PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM TECNOLOGIA AMBIENTAL ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM GESTÃO E TECNOLOGIA AMBIENTAL. Marcondes Mafaciolli Pacheco

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1 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM TECNOLOGIA AMBIENTAL ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM GESTÃO E TECNOLOGIA AMBIENTAL Marcondes Mafaciolli Pacheco CULTIVO DE MICROALGAS VISANDO A FICORREMEDIAÇÃO DE EFLUENTE URBANO E CARACTERIZAÇÃO DA BIOMASSA PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL Santa Cruz do Sul 2015

2 Marcondes Mafaciolli Pacheco CULTIVO DE MICROALGAS VISANDO A FICORREMEDIAÇÃO DE EFLUENTE URBANO E CARACTERIZAÇÃO DA BIOMASSA PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL Esta Dissertação foi submetida ao Programa de Pós- Graduação Mestrado em Tecnologia Ambiental, Área de Concentração em Gestão e Tecnologia Ambiental, Universidade de Santa Cruz do Sul UNISC, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Tecnologia Ambiental. Orientadora: Prof. Dra. Rosana de Cassia de Souza Schneider Santa Cruz do Sul 2015

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4 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente à minha mãe pela coragem e destemor com que sempre encarou a vida, dando-nos exemplo de persistência e determinação, e, ao longo desta trajetória, pela confiança, preocupação, apoio e incentivo desmedidos dispensados a mim, imprescindíveis para esta conquista. A minha namorada Tais, pelo carinho, dedicação e companheirismo, mas principalmente pela compreensão por eu ter estado ausente em determinados momentos, mesmo assim, jamais negando apoio, ciente de que esta realização era um sonho pessoal. Aos colegas e amigos Amaro de Azevedo e Adan Trentin pelos bons e profícuos momentos compartilhados ao longo desta trajetória. As bolsista Danielle Kochenborger, Lilian Ferreira e Mariana Dalla Costa pelo apoio e dedicação nas tarefas laboratoriais. A professora Dra. Rosana de Cassia Schneider primeiramente por terme aceito em seu grupo de pesquisa, pelos esclarecimentos e orientações e, principalmente, pelo entusiasmo transmitido que fizeram despertar em mim o interesse e o apreço pela pesquisa. A professora e co-orientadora Dra. Maria Silvana Aranda Moraes e à professora Dra. Michele Hoeltz pela dedicação, disponibilidade, entusiasmo, confiança, seriedade e bom-humor com que me auxiliaram no andamento deste projeto e de outros trabalhos paralelos. Foi extremamente gratificante ter trabalhado com vocês e tenham a certeza de que foram fundamentais para que este projeto alcançasse seus objetivos. Aos professores Dr. Eduardo Alexis Lobo Alcayaga e Dr. Marcelino Hoppe pelas prestimosas contribuições para o desenvolvimento desta pesquisa. Aos demais professores do Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Ambiental pelos conhecimentos transmitidos. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES pela bolsa cedida para o Mestrado em Tecnologia Ambiental da UNISC.

5 O que somos é o presente de Deus para nós. O que nos tornamos é o nosso presente para Deus ELEANOR POWELL

6 RESUMO A poluição gerada por efluentes líquidos e gasosos e a pressão sobre as reservas fósseis de combustíveis estão entre as externalidades que mais desafiam a sustentabilidade ambiental e econômica das atividades antrópicas. As atuais tecnologias disponíveis de tratamento de efluentes apresentam limitações de aplicabilidade por apresentarem especificidade para determinados tipos de resíduos ou por sua ineficiência. Por outro lado, biocombustíveis de fontes convencionais apresentam-se com potencial de suprir as necessidades de consumo energético da sociedade moderna, porém implicando em múltiplos impactos negativos. A versatilidade de processos biotecnológicos empregando microalgas viabiliza a sua aplicação no tratamento de diferentes tipos de águas residuárias e de efluentes gasosos, além do que, permite a integração da biorremediação com a produção de biomassa para a conversão em biocombustíveis. No presente trabalho, buscou-se avaliar o potencial de emprego desta tecnologia no tratamento de efluente urbano secundário e na produção de biodiesel e os efeitos da aplicação de determinados estresses (suplementações com CO 2 ou glicerol) no desempenho da técnica para estas aplicações. A aplicação de CO 2 possibilitou ganhos em termos de rendimento de biomassa (0,8213±0,014 g L -1 ) e de lipídios (195,43±39 mg g -1 ), e melhor desempenho na biorremediação do efluente urbano secundário, destacadamente para DBO5 (54,34%), fósforo total (92,4%), nitrogênio amoniacal (97,1%) e nitrogênio total Kjeldahl (92,8%). Contudo, a condição não suplementada com CO 2 permitiu extração de um óleo com composição em termos de ácidos graxos capaz de conferir melhor qualidade a um biodiesel, com predominância das formas isoméricas de C16:0, C18:0, C18:1 e C18:2. Nos experimentos envolvendo o uso de glicerol, os melhores resultados de rendimento de biomassa foram observados para a concentração de 3 g L -1, enquanto que o maior rendimento de lipídios foi obtido na condição de 5 g L -1. Todas as condições resultaram em um óleo com boas características para a produção de biodiesel, destacadamente para as condições 3 e 5 g L -1 que apresentaram quantidades maiores de C14:0, C16:0, C18:0, C18:1 e C18:2. Palavras-chave: Microalgas, ficorremediação, CO 2, glicerol, biodiesel.

7 ABSTRACT MICROALGAE CULTIVATION AIMING URBAN WASTEWATER PHYCOREMEDIATION AND BIOMASS CHARACTERIZATION FOR BIODIESEL PRODUCTION The pollution generated by liquid and gaseous effluents and the pressure on fossil fuel reserves are among the externalities that more challenging environmental and economic sustainability of human activities. Current available wastewater treatment technologies have applicability limitations due to their specificity for certain types of waste or inefficiency. On the other hand, conventional sources of biofuels present with potential to meet the power requirements of modern society, but implying multiple negative impacts. The versatility of biotechnological processes employing microalgae enables its application in the treatment of different types of wastewater and emissions, besides, allows the integration of bioremediation with the production of biomass for biofuel production. In this study, we sought to assess the employment potential of this technology in the treatment of secondary urban effluent and the production of biodiesel and the effects of the application of certain stresses (supplemental CO 2 or glycerol) in the performance of the technique for these applications. The application of CO 2 enable gains in terms of biomass yield ( ± g L -1 ) and lipids ( ± 39 mg g -1 ), and better performance in the bioremediation of secondary urban effluent, notably for BOD 5 (54.34%), total phosphorus (92.4%), ammonia (97.1%), total Kjeldahl nitrogen (92.8%). However, the condition which is not supplemented with CO 2 allowed extraction of an oil composition in terms of fatty acids can provide better quality at a biodiesel, with predominance of the isomeric forms C16: 0, C18: 0, C18: 1 and C18: 2. In the experiments involving the use of glycerol, the best results biomass yield was observed at the concentration of 3 g L -1, whereas the highest yield was obtained at lipid condition 5 g L-1. All conditions resulted in an oil with good characteristics for biodiesel production, notably for condition 3 and 5 g L -1 that showed reasonable amounts of C14: 0, C16: 0, C18: 0, C18: 1 and C18: 2. Keywords: Microalgae, phycoremediation, CO 2, glycerol, biodiesel.

8 LISTA DE ABREVIATURAS GEE Gases de Efeito Estufa CO 2 Dióxido de carbono COT Carbono Orgânico Total C - Carbono N Nitrogênio P Fósforo K Potássio S Enxofre Fe Ferro - HCO 3 - íon bicarbonato 2- CO 3 - íon carbonato CH 4 - Metano C 2 H 6 - Etano C 2 H 4 Eteno CHCl 3 - Clorofórmio CH 3 OH Metanol DBO 5 Demando Bioquímica de Oxigênio DQO Demando Química de Oxigênio + NH 4 - N Nitrogênio Amoniacal PO -3 4 P - Fosfato NTK Nitrogênio Total Kjeldahl

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação gráfica do comportamento característico de microalgas modelado pelo método da curva de crescimento (adaptado de Moazami et al. (2012)) Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de interação entre microalgas e bactérias durante o tratamento de águas residuárias e efluentes gasosos com geração de biomassa e possiblidade de extração de bioprodutos (adaptado de Prajapati et al. (2013)) Figura 3. Fluxograma esquemático do delineamento da pesquisa Figura 4. Fotobiorreator em escala piloto do tipo misto (A) colunas verticais (B) tanque aberto (C) turf scrubber Figura 5: Conjunto alimentador de gases: (A) compressores diafragmáticos VigoAr 300; (B) cilindro de CO 2 e (C) válvula solenóide Figura 6. Registros fotográficos dos cultivos de microalgas nos experimentos utilizando glicerol Figura 7: Vista lateral do reator anaeróbico de fluxo ascendente (A) e detalhe do ponto de coleta de efluente no reator (B) Figura 8: Detalhes de (A) eletrodo de alumínio; (B) eletroflotação; (C) agitador e (D) recuperação em filtro de tecido Figura 9: Fotomicrografia de Scenedesmus sp. identificada em amostra de cultivo em fotobiorreator em escala piloto ampliada: 100 vezes (A); vezes (B) Figura 10: Curvas de crescimento de Scenedesmus sp. em efluente urbano secundário com e sem aporte de CO 2. Os dados são expressos como média ± desvio-padrão, n =

10 Figura 11. Dados médios de incidência de irradiação solar dos períodos em que foram realizados os cultivos sem CO 2 (Média Set - Dez) e com CO 2 (Média Jan - Mar) Figura 12. Temperaturas médias dos períodos em que foram realizados os cultivos sem CO 2 (Média Set - Dez) e com CO 2 (Média Jan - Mar) Figura 13: Teor de lipídios em mg L -1 de cultivo de microalgas com e sem aporte de CO 2. Os dados são expressos como média ± desvio-padrão, n = Figura 14. Percentagens de remoção dos parâmetros do efluente bruto secundário pelos cultivos de microalgas sem e com aporte de CO Figura 15. Curvas de crescimento da microalga Scenedesmus sp. em experimento de bancada utilizando efluente urbano secundário e concentrações de 0, 1, 3 e 5 g L -1 de glicerol como fonte suplementar de carbono orgânico. Os dados são expressos como média ± desvio-padrão, n = Figura 16. Densidades celulares dos cultivos submetidos a diferentes concentrações de glicerol (0 (controle), 1, 3 e 5 g L -1 ). Os dados são expressos como média ± desvio-padrão, n= Figura 17. Rendimentos de biomassa obtidos através de cultivos de Scenedesmus sp. em meios contendo diferentes concentrações de glicerol (0, 1, 3 e 5 g L -1 ). Os dados são expressos como média ± desvio-padrão, n = Figura 18. Teores de óleo extraídos de biomassas de Scenedesmus sp. submetidas a meios de crescimento contendo diferentes concentrações de glicerol (0, 1, 3 e 5 g L -1 ). Os dados são expressos como média ± desviopadrão, n = Figura 19. Cromatogramas obtidos por cromatografia gasosa com detector de massas no modo íon total (TIC) para identificação dos principais compostos

11 presentes em amostras de óleo de biomassas de microalgas cultivadas sem e com aporte de CO Figura 20. Áreas relativas dos picos dos principais ácidos graxos encontrados em extrato oleoso de biomassas de microalgas produzidas com e sem suplementação com CO 2 (ETAPA I) Figura 21. Cromatogramas obtidos por cromatografia gasosa com detector de massas no modo íon total (TIC) para identificação dos principais compostos presentes em amostras de óleo de biomassas de microalgas cultivadas com diferentes concentrações de glicerol Figura 22. Áreas relativas dos picos dos principais ácidos graxos encontrados em extrato oleoso de biomassas de microalgas produzidas sob diferentes concentrações de glicerol (ETAPA II)...108

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Características dos diferentes perfis metabólicos de microalgas de acordo com as fontes de energia e de carbono utilizadas (Fonte: Chen et al. (2011)) Tabela 2. Rendimentos de biomassa dos cultivos sem e com suplementação de CO 2. Os dados são expressos como média ± desvio-padrão, n = Tabela 3. Teor de lipídios em biomassa encontrados em algumas espécies de microalgas Tabela 4. Parâmetros químicos de qualidade do efluente urbano secundário antes e após o tratamento utilizando cultivos de microalgas e o comparativo com a Res. CONSEMA n 128/06. Os dados são expressos como média ± desvio-padrão, n = Tabela 5. Comparação qualitativa (x: ocorrência) entre os compostos identificados por GC/MS das amostras de óleo de biomassa de microalgas cultivadas sem e com aporte de CO 2 (t R : tempo de retenção) Tabela 6. Principais compostos identificados a partir dos picos majoritários dos cromatogramas da ETAPA II (onde tr: tempo de retenção)

13 SUMÁRIO RESUMO... 6 ABSTRACT... 7 LISTA DE ABREVIATURAS INTRODUÇÃO OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Microalgas Perfis metabólicos de microalgas Avaliação do crescimento de microalgas Sistemas de cultivo de microalgas Sistemas abertos Sistemas fechados (Fotobiorreatores) Águas residuárias urbanas como meio de cultivo Fatores que afetam o crescimento de microalgas Luminosidade Temperatura Nutrientes Carbono inorgânico suplementar Carbono orgânico suplementar Ficorremediação Recuperação de biomassa de microalgas Métodos eletroquímicos Filtração Biocombustíveis...40

14 3.10 Biocombustíveis de microalgas Biodiesel de microalgas Extração de lipídios de microalgas Extração de biocompostos de microalgas Composição em ácidos graxos nas microalgas METODOLOGIA Delineamento experimental da pesquisa Identificação da espécie de microalga ETAPA I: Produção de microalgas em fotobiorreator misto em escala piloto com e sem suplementação com CO ETAPA II: Estudo da utilização de glicerol como fonte de carbono suplementar para microalgas em escala laboratorial Local de origem do efluente utilizado como meio de cultivo Determinação da densidade celular (DC), densidade celular máxima (DCM), tempo de cultivo e taxa de crescimento (r) de cultivos de microalga Recuperação da biomassa de microalgas Determinação do teor de lipídios na biomassa de microalgas Determinação da composição de ácidos graxos do óleo da biomassa de microalgas utilizando cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massas (GC/MS) Caracterização analítica dos efluentes brutos secundários para estudo da ficorremediação em escala piloto Análise de dados RESULTADOS E DISCUSSÃO Identificação da espécie de microalgas ETAPA I Análise do crescimento de Scenedesmus sp. utilizando efluente urbano como meio de cultura e suplementação com carbono inorgânico (CO 2 ) Rendimento de biomassa microalgal...73

15 5.2.3 Teor de lipídios na biomassa de microalgas Estudo da ficorremediação de efluente urbano no experimento em escala piloto ETAPA II Crescimento microalgal em diferentes concentrações de glicerol Rendimento de biomassa microalgal Teor de lipídios em biomassa de microalgas Composição de ácidos graxos na biomassa de microalgas e avaliação do potencial de produção de biodiesel CONSIDERAÇÕES FINAIS SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS REFERÊNCIAS

16 13 1 INTRODUÇÃO A elevada taxa de crescimento da população urbana vem gerando grandes quantidades de resíduos, dentro os quais, as águas residuárias e os efluentes gasos estão entre os principais tipos de rejeitos que desafiam a sustentabilidade ambiental das atividades antrópicas (Arbib et al., 2014), provocando profundas modificações nas estruturas e funcionamento dos mais diferentes ecossistemas (Smith et al., 1999). Por outro lado, cerca de 80% da demanda global de energia é fornecida por combustíveis fósseis. Esta forma de energia é considerada não renovável e a crise de energia tornou-se um dos mais importantes desafios enfrentados pela sociedade humana no século 21 (Wu et al., 2014). Embora atualmente a importância estratégica da água doce seja universalmente reconhecida, e embora as questões relativas à gestão sustentável da água possam ser encontradas em quase todas as agendas científicas, sociais e/ou políticas, o aumento da poluição, a industrialização e o rápido desenvolvimento econômico impõem riscos graves à disponibilidade e à qualidade dos recursos hídricos em todo o mundo (Abdel-Raouf et al., 2012). Não obstante, o aquecimento global tem atingido níveis alarmantes em virtude da crescente concentração de gases de efeito estufa (GEE) na atmosfera. Dentre os GEE, o dióxido de carbono (CO 2 ) é considerado um dos mais importantes (Kumar et al., 2011). O glicerol, enquanto subproduto da produção de biodiesel, em geral requer, para ser reincorporado em processos industriais, elevado grau de pureza, o que muitas vezes inviabiliza sua utilização, via de regra, tornando-se um poluente ambiental em potencial (Leoneti et al., 2012). Não obstante, a fim de remover uma série de substâncias solúveis, dentre elas o glicerol, durante a purificação do biodiesel, são usadas grandes quantidades de água, logo, sendo geradas elevadas quantidades de efluentes (Veljković et al., 2014). Muitas espécies de microalgas são capazes de assimilar diferentes fontes de carbono. A disponibilidade de glicerol como fonte de carbono tem levado a muitos estudos avaliando o uso de glicerol

17 14 como matéria-prima para a produção biológica de produtos químicos valiosos (Leite et al., 2014; Liu et al., 2013; Moita et al., 2014). Processsos biotecnológicos envolvendo microalgas oferecem novas oportunidades para o tratamento de águas residuárias e efluentes gasosos devido à sua grande eficiência na remoção de poluentes (Cea-Barcia et al., 2014; Granados et al., 2012). A utilização de microalgas no tratamento e reciclagem de águas de despejo tem atraído grande interesse em virtude da possibilidade de geração de quantidades substanciais de biomassa a custo relativamente baixo, eliminando a necessidade de fornecimento de nutrientes e água potável. Águas residuárias constituem, portanto, um meio de crescimento sustentável para a produção de microalga (Kothari et al., 2013; Osundeko & Pittman, 2014). A integração da produção de biomassa com o tratamento de águas residuárias permite alcançar vantagens econômicas e ambientais que viabilizam explorações em larga escala de microalgas (Ramos Tercero et al., 2014). As reservas mundiais de combustíveis fósseis estão diminuindo gradualmente, podendo chegar à sua exaustão em um horizonte de 50 anos (Gao et al., 2013). A escassez de reservas e problemas ambientais relacionados à exploração e consumo de combustíveis fósseis têm impulsionado a busca e o desenvolvimento de fontes alternativas de energia de modo a assegurar a sustentabilidade econômica e ambiental do seu fornecimento (Hong et al., 2014; Lam & Lee, 2012; Stephens et al., 2010). Biocombustíveis produzidos a partir de biomassa apresentam-se como fontes renováveis de energia com potencial de contribuir para satisfazer às necessidades de consumo energético da sociedade moderna (Ibrahim et al., 2014). Uma série de investigações apontam múltiplos impactos negativos associados aos chamados biocombustíveis de primeira geração (derivados de culturas convencionais comestíveis) e de segunda geração (derivados de culturas convencionais nãocomestíveis), incluindo elevado consumo de água e agroquímicos, degradação da terra pelo uso intensivo do solo, aumento das emissões de dióxido de carbono (CO 2 )

18 15 e outros gases de efeito estufa, perda da biodiversidade e instabilidade dos preços globais de alimentos (Benson et al., 2014). Os biocombustíveis derivados de microalgas, os denominados biocombustíveis de terceira geração, despontam como alternativas promissoras devido às características únicas inerentes às algas (Zhou et al., 2014). Comparada à matéria-prima utilizada para a produção de biocombustíveis de primeira e de segunda geração, microalgas, apresentam uma série de vantagens, tais como maior taxa de fotossíntese, maior teor de óleo, capacidade de crescimento em águas residuárias, elevados rendimentos de biomassa, facilidade de colheita, além de não comprometerem a produção de alimentos (Bahadar & Bilal Khan, 2013; Song et al., 2014; Zhu et al., 2014a; Zhu et al., 2014b). Dentre as formas de biocombustíveis, o mais comum, além do bioetanol, é o biodiesel, proveniente de biomassa e, portanto, renovável, que atualmente tem atraído bastante interesse, podendo ser usado em substituição ao diesel de petróleo em veículos exigindo pouca ou nenhuma alteração nos motores (Mata et al., 2010). O biodiesel produzido a partir de microalgas têm se destacado como a opção mais promissora para substituir os combustíveis diesel derivados de petróleo (Komolafe et al., 2014). O potencial de microalgas como fonte alternativa de energia tem sido submetido à intensa pesquisa acadêmica e industrial. As microalgas podem gerar quantidades significativas de biomassa e de óleo para a conversão em biodiesel (Pittman et al., 2011). No presente trabalho, objetivou-se a produção de microalgas em efluente urbano em duas escalas: uma em escala piloto investigando os efeitos do uso de CO 2 suplementar na ficorremediação do efluente, bem como no crescimento microalgal e no acúmulo de lipídios e determinar o perfil de ácidos graxos da biomassa com vistas a avaliar o potencial de produção de biodiesel; a outra, em escala laboratorial, investigou-se os efeitos no crescimento, acúmulo de lipídios e no perfil de ácidos graxos da biomassa microalgal da utilização de diferentes concentrações de glicerol de modo a avaliar a influência de seu uso no potencial de produção de biodiesel.

19 16 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Produzir biomassa de microalgas em efluente doméstico urbano proveniente do sistema UASB (Upflow Anaerobic Slugde Blanket) da ETE (Estação de Tratamento de Efluentes) UNISC, visando a ficorremediação e avaliação do potencial de produção de biodiesel. 2.2 Objetivos específicos Testar e comparar os efeitos da utilização do aporte de CO 2 no crescimento e rendimento de biomassa de cultivos de microalgas em escala piloto; Caracterizar o efluente antes e após o cultivo em escala piloto através de análises químicas; Testar e comparar os efeitos da utilização de glicerol como fonte suplementar de carbono orgânico no crescimento e rendimento de biomassa de cultivos de microalgas em escala laboratorial; Determinar o teor de lipídios e a composição de ácidos graxos das biomassas de microalgas produzidas em escalas piloto e laboratorial para avaliar seu potencial para a produção de biodiesel.

20 17 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Microalgas Microalgas são microrganismos fotossintetizantes, procariontes ou eucariontes, robustos capazes de crescer sob as mais diferentes condições em ambientes aquáticos ou mesmo terrestres devido à sua estrutura unicelular ou multicelular simples (Singh & Sharma, 2012). Estes microrganismos crescem em torno de 100 vezes mais rapidamente do que plantas terrestres, podendo dobrar sua biomassa em menos de um dia, isso porque além de possuírem estrutura celular simples, também apresentam elevada relação superfície/volume, o que lhes confere altas taxas de assimilação de nutrientes (Lam et al., 2012). Como não produzem celulose para compor elementos estruturais característicos de plantas superiores tais como folhas, caules e raízes, microalgas podem apresentar taxas de crescimento muito mais elevadas do que as culturas terrestres, em alguns casos, podendo atingir uma ordem de magnitude acima destas (Yue et al., 2014). Exemplos de microrganismos procarióticos são cianobactérias (Cyanophyceae) e de microalgas eucarióticas, as algas verdes (Chlorophyta) e diatomáceas (Bacillariophyta) (Mata et al., 2010). O mecanismo fotossintético de microalgas é semelhante ao das plantas terrestres, mas, devido à sua estrutura celular simples e submersão em meio aquoso, na maioria dos casos, têm melhor acesso à água, CO 2 e outros nutrientes, sendo assim mais eficientes na conversão da energia e fixação de CO 2 em biomassa. Microalgas são responsáveis por aproximadamente 50% da fixação mundial de carbono orgânico (Ratha & Prasanna, 2012). Estes microrganismos consomem uma grande quantidade de CO 2 convertendo-o eficientemente em biomassa e liberando, via fotossíntese, mais oxigênio para a atmosfera do que as florestas (Rossi et al., 2014). Não obstante, são capazes de remover ureia das águas intensificando com isso a própria atividade de bioconversão. Microalgas requerem para seu crescimento apenas luz, açúcares,

21 18 CO 2, N, P e K, a partir dos quais sintetizam grandes quantidades de lipídios, proteínas e carboidratos que podem ser convertidos e processados em biocombustíveis (Demirbas, 2011) e produtos químicos de elevado valor (Abdelaziz et al., 2014; Rawat et al., 2011). Dependendo da espécie de microalga e da finalidade e forma de cultivo, vários compostos químicos de alto valor podem ser extraídos, tais como pigmentos, antioxidantes, β-caroteno, polissacarídeos, triglicerídios, ácidos graxos, vitaminas, sendo amplamente utilizados como produtos em diferentes setores industriais (por exemplo produtos farmacêuticos, cosméticos, alimentos funcionais e biocombustíveis) (Mata et al., 2010). Microalgas marinhas são excelentes fontes de ácidos graxos poliinsaturados importantes tais como o ácido linoleico (C18:2n-6), ácido α-linolênico (C18:3n-3), ácido araquidônico (C20:4n-6), ácido eicosapentaenóico (C20:5n-3), e ácido docosahexaenóico (C22:6n-3) os quais são considerados essenciais na aquicultura (Welladsen et al., 2014). Além disso, dispensam o uso de herbicidas e agroquímicos em geral, podendo ser produzidas durante todo o ano (Singh & Gu, 2010). Certas cepas de microalgas fazem uso extremamente eficiente da luz e de nutrientes. No entanto, o fotoperíodo é uma variável importantíssima para o crescimento de microalgas, pois determina a quantidade de energia disponível para o processo fotossintético. Microalgas apresentam diferentes exigências de luz e as condições de cultivo tem efeito substancial sobre a taxa de proliferação celular e, consequentemente na produção de biomassa. No ambiente natural, a intensidade da luz sofre oscilações contínuas ao longo do dia. Mudanças na quantidade de luz induzem alterações na composição bioquímica de microalgas (Krzemińska et al., 2014). Intensidade luminosa excessiva pode provocar oxidação fotoquímica e fotoinibição, enquanto baixos níveis de luz limitam o crescimento de microalgas. Em geral, o crescimento de muitos microrganismos fotossintéticos fica saturado em torno de 200 µmol m -2 s -1, que é cerca de 1/10 do máximo da intensidade de luz no verão ao ar livre (2000 µmol m -2 s -1 ) (Teo et al., 2014).

22 Perfis metabólicos de microalgas Microalgas são capazes de adaptações a alterações das condições ambientais, podendo assumir diferentes perfis metabólicos. Estes perfis metabólicos são definidos de acordo com a forma com que microalgas fazem uso da luz solar e dos substratos orgânicos e inorgânicos: Fotoautotrófico: ou seja, usando a luz como fonte de energia única que é convertida em energia química por me2io de reações fotossintéticas e CO 2 como fonte de carbono (Cheirsilp & Torpee, 2012). O CO 2 utilizado em cultivos fotoautotróficos pode ser fornecido em larga escala a partir de uma fonte pontual de emissão, como por exemplo em usinas de energia, oferecendo assim uma oportunidade de reciclagem de gases de exaustão (Davis et al., 2011). Culturas fotoautotróficas requerem, no entanto, longos períodos de cultivo e resultam em baixas concentrações celulares (Adesanya et al., 2014). Exemplos de microalgas fotoautotróficas são Chlorella fusca var. vacuolata, Scenedesmus obliquus e Anabaena variabilis. Heterotrófico: ou seja, utilizando apenas compostos orgânicos como fonte de carbono e energia (Ota et al., 2011). Este modo de crescimento oferece várias vantagens incluindo a eliminação de luz como fonte de energia, melhor controle da cultura, elevados rendimentos de biomassa e acumulação de lípidos (Gim et al., 2014). A maioria das divisões de microalgas contêm espécies heterotróficas incolores que podem assimilar carbono orgânico na forma de substâncias dissolvidas do ambiente externo (osmotrofia) ou por engolfamento de bactérias e outras células (fagocitose) (Garay et al., 2014). Algumas espécies de microalgas, tais como as pertencentes aos gêneros Chlorella, Scenedesmus, Tetraselmis e Nitzchia, têm a capacidade de alternar seu metabolismo entre fototrófico e heterotrófico, dependendo das condições ambientais. A escassez, por exemplo, de carbono orgânico no meio pode inibir o metabolismo heterotrófico (Su et al., 2012).

23 20 Mixotrófico: esse perfil de crescimento é uma variação do regime heterotrófico, onde compostos orgânicos e CO 2 são assimilados, enquanto respiração e fotossíntese operam simultaneamente (Li et al., 2014). A principal diferença entre mixotrofia e a fotoheterotrofia é que, nesta última, a luz exclusivamente fornece a energia necessária para o aproveitamento de compostos orgânicos, enquanto que em um perfil mixotrófico, além da luz, compostos orgânicos podem ser utilizados para esse fim (Wang et al., 2014). São exemplos de algas capazes de crescer segundo um regime mixotrófico, as espécies Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa. O crescimento mixotrófico para algumas espécies de microalgas pode melhorar significativamente a produtividade de biomassa (densidade celular máxima e taxa de crescimento), reduzindo assim os custos de produção, com o uso, por exemplo, de glicerol e/ou glicose como fonte de carbono (Girard et al., 2014). Perfis mixotróficos tem menor dependência de luz e apresentam elevadas taxas de produção (Cerón Garcí et al., 2000), o que torna este perfil metabólico o mais atraente para os mais diversos fins, especialmente quando se pretende a mitigação das emissões de CO 2 e/ou o tratamento de águas residuárias (Adesanya et al., 2014). A Tabela 1 apresenta os perfis metabólicos de crescimento de microalgas e suas respectivas fontes de energia e de carbono. Tabela 1. Características dos diferentes perfis metabólicos de microalgas de acordo com as fontes de energia e de carbono utilizadas (Fonte: Chen et al. (2011)). Perfil metabólico Fonte de energia Fonte de carbono Fotoautotrófico Luz Inorgânico Heterotrófico Mixotrófico Fotoheterotrófico Compostos orgânicos Luz ou compostos orgânicos Luz Orgânico Inorgânico ou orgânico Orgânico

24 Avaliação do crescimento de microalgas A curva de crescimento é um dos métodos mais empregados para avaliar o crescimento em cultivos de microalgas, podendo ser expressa como uma relação entre a concentração celular ou de biomassa em um determinado volume (densidade celular) pelo tempo. A Figura 1 apresenta as diferentes fases em um perfil característico de crescimento de culturas de microalgas baseado no método de avaliação pela curva de crescimento. Figura 1: Representação gráfica do comportamento característico de microalgas modelado pelo método da curva de crescimento (adaptado de Moazami et al. (2012)). De acordo com Derner (2006), na análise de crescimento de microalgas modelado pelo método da curva de crescimento pode-se observar quatro fases características: 1 Fase de indução ou Fase Lag: corresponde à fase de adaptação das células algais às condições de cultivo, em que pode ocorrer redução da densidade celular.

25 22 2 Fase exponencial ou Fase Log: fase em que o crescimento se dá a uma taxa elevada e constante (logarítmica), duplicando-se sucessivamente em intervalos regulares de tempo. 3 Fase de diminuição do crescimento: fase em que a taxa de crescimento torna-se negativa em função da menor disponibilidade de nutrientes no meio e, principalmente, do efeito de autossombreamento resultante da elevada concentração celular, que dificulta a penetração de luz e, consequentemente, da atividade fotossintética. 4 Fase estacionária: fase em que as taxas de crescimento e a mortalidade igualam-se, não havendo incremento líquido na população. 5 Fase de morte celular: fase em que a taxa de mortalidade é superior à de crescimento celular, como resultado dos níveis baixos de nutrientes disponíveis, do autossombreamento e da toxicidade causada pela quantidade excessiva de metabólitos no meio. 3.4 Sistemas de cultivo de microalgas As formas de cultivo mais difundidas de microalgas podem ser divididas em dois tipos básicos de sistemas: os abertos e os fechados. Dentre os sistemas abertos destacam-se aquelas em formato de lagoas a céu aberto, de pista (Raceway Ponds) e os tapetes de algas (turf scrubber). Os sistemas fechados, também chamados fotobiorreatores, apresentam maior diversidade de formatos e configurações, sendo os mais comuns os de formato tubular, os de coluna com ar ascendente (Bubble column e Air-lift) e os de formato plano (Flat Panel ) (Handler et al., 2012).

26 Sistemas abertos Lagoas abertas representam os sistemas abertos de produção de microalgas mais antigos e simples (Richardson et al., 2012). Geralmente consistem de uma lagoa artificial rasa, impermeabilizada, com formato oval, contínua ou dividida por uma série de chicanas onde a água é circulada ou transferida através de tanques a fim de promover uma mistura uniforme de nutrientes e da biomassa (Handler et al., 2012). A principal vantagem das lagoas abertas é sua simplicidade, resultando em baixos custos operacionais e de produção. No entanto, são altamente suscetíveis a contaminações por outros microrganismos como bactérias ou mesmo outras algas, a perdas de água por evaporação, difusão de CO 2 para a atmosfera e exigência de grandes áreas de terra (Ugwu et al., 2008). Além disso, existe a dificuldade de controle nesses sistemas de variáveis ambientais que interferem no processo de cultivo, como precipitações, temperatura e luminosidade (Singh & Sharma, 2012). Sistemas abertos não utilizam efetivamente o CO 2 fornecido que facilmente escapa do meio de cultura devido às profundidades comumente rasas dos sistemas e à ineficiência na transferência de massa de CO 2 para a cultura. A fixação de CO 2 nesses sistemas varia de 10 a 30% (Li et al., 2013). No que diz respeito à produtividade de biomassa, sistemas de lagoas abertas são menos eficientes quando comparados aos sistemas fechados. Tal condição pode ser atribuída a diversos fatores, incluindo perdas por evaporação, oscilações de temperatura no meio, mistura ineficiente, carência de CO 2 e limitações de luz (Brennan & Owende, 2010). No cultivo de algas, a produtividade dos sistemas e os custos de construção e operação do reator são dependentes do sistema de mistura empregado. A agitação do meio visa atender uma série de finalidades, incluindo a prevenção da sedimentação de células, a eliminação de estratificação térmica, a distribuição de nutrientes e de dióxido de carbono, a remoção de oxigênio fotossinteticamente produzido e a melhoria de eficiência de utilização de luz. Para assegurar a mistura adequada, uma circulação com uma velocidade mínima do líquido deve ser mantida (Ketheesan & Nirmalakhandan, 2011). Raceway Ponds são

27 24 sistemas abertos que diferem das lagoas abertas por possuírem mecanismos artificiais de agitação, em geral executados por rodas-de-pás, que imprimem uma turbulência tal capaz de manter uniforme a densidade da mistura (Rogers et al., 2014). As concentrações celulares de microalgas em lagoas abertas estão em média próximas a 0,5 g L -1 de biomassa (0,05% de peso seco, ou 99,95% de teor de humidade) (Gross et al., 2013). Segundo Mulbry et al. (2008), com a tecnologia chamada Turf Scrubber aplicada na ficorremediação de efluentes, é possível utilizar agrupamentos de várias espécies filamentosas de algas, tendo se mostrado eficaz para melhorar a qualidade de águas residuárias agrícolas, esgoto doméstico e efluentes industriais. O sistema consiste de uma comunidade de algas crescendo anexada a uma tela ou meio suporte acoplado a uma calha, através do qual flui a água poluída ou o meio de cultura. A comunidade de algas é um sistema de alta diversidade, com 30 ou mais espécies de algas, juntamente com microrganismos associados e microinvertebrados. Quando operado em valores de ph neutro, esta comunidade viva fornece a maior parte do tratamento de água por absorção de compostos inorgânicos na produção primária e degradação de compostos orgânicos na respiração da comunidade bacteriana (Pizarro et al., 2006) Sistemas fechados (Fotobiorreatores) Os sistemas fechados de cultivo de microalgas comumente denominados fotobiorreatores são projetados para a produção de cepas de microrganismos fotossintetizantes ricos em produtos de elevado valor, com a vantagem da flexibilidade metabólica apresentada por microalgas: o perfil metabólico e as taxas de geração do(s) produto(s) desejado(s) podem ser melhorados ajustando adequadamente as condições de cultura. Os projetos de fotobiorreatores fechados devem ser cuidadosamente otimizados para cada espécie de alga de interesse, de acordo com as suas características fisiológicas e de crescimento específicos (Sierra et al., 2008).

28 25 Fotobiorreatores minimizam a contaminação e permitem o cultivo de monoculturas de microalgas; possibilitam o controle sobre condições de ph, temperatura, luz, concentração de CO 2 etc.; resultam em menores perdas de água por evaporação e de CO 2 ; apresentam elevadas taxas de transferência de massa de CO 2 ; permitem a produção de bioprodutos complexos (Singh & Sharma, 2012). No entanto, fotobiorreatores apresentam também uma série de desvantagens, tais como superaquecimento e acúmulo de O 2, o que muitas vezes requer a existência de um eficiente sistema de refrigeração e de troca de gases para viabilizar o cultivo, elevando os custos operacionais de produção (Raes et al., 2014). As concentrações celulares de microalgas em fotobiorreatores são superiores às obtidas através de cultivos em sistemas abertos, podendo atingir 2 a 6 g L -1 de biomassa (peso seco de 0,2-0,6% ou 99,4-99,8% de teor de humidade) (Gross et al., 2013). Uma variedade de diferentes tipos de fotobiorreatores têm sido desenvolvida, podendo ser classificados de acordo com a geometria do reator em tubulares, coluna vertical e flat panel. Fotobiorreatores tubulares são sistemas tipicamente compostos de uma série de tubos transparentes construídos em diferentes padrões (por exemplo, em linha reta, curvado ou em espiral), de diâmetro relativamente pequeno (em geral inferior a 0,1 m) para assegurar alta produtividade de biomassa (Wang et al., 2012). Os tubos podem ser dispostos em posição horizontal ou vertical, feitos de materiais transparentes e instalados em ambientes externos expostos à radiação solar (Kumar et al., 2011). Um sistema de troca de gases onde ar, CO 2 e nutrientes são adicionados e O 2, removido, é acoplado ao reator principal. O meio de cultura é recirculado a partir de um reservatório com o auxílio de uma bomba mecânica que mantém um fluxo altamente turbulento nos fotobiorreatores proporcionando mistura total ao meio e prevenindo a deposição de biomassa (Razzak et al., 2013). Fotobiorreatores de colunas verticais são geralmente cilíndricos com raio de até 0,2 m e altura de até 4 m. Estas colunas devem ter pequenos raios a fim de aumentar a relação superfície-volume. A restrição de altura está associada com as limitações de transferência de gás e à resistência dos materiais transparentes utilizados para construir as colunas. Em colunas altas, podem ser estabelecidos

29 26 gradientes de CO 2, provocando morte celular. Além disso, colunas longas aumentam o tempo de residência de O 2 gerado por fotossíntese, o qual pode produzir efeito inibitório no crescimento de microalgas (Wang et al., 2012). Fotobiorreatores de coluna de bolhas (Air Lift) são recipientes cilíndricos com altura mais do que duas vezes o diâmetro. Tem a vantagem de ser de baixo custo, elevada área superficial em relação ao volume, a falta de peças móveis, satisfatória transferência de calor e massa, meio de cultura relativamente homogêneo, liberação eficiente de O 2 e mistura de gás residual. A transferência de massa de CO 2 é feito através da injeção de mistura de gases a partir de um sistema de aspersão. A eficiência fotossintética depende muito da taxa de fluxo de gás no sistema (Singh & Sharma, 2012). Fotobiorreatores tubulares que circulam a cultura por meio de um dispositivo airlift são especialmente atraentes, por inúmeras razões: a circulação é conseguida sem partes móveis e isto proporciona um sistema de cultura robusto com um potencial reduzido de contaminação; o dano celular associado ao bombeamento mecânico é evitado e; o dispositivo airlift combina a função de uma bomba e um permutador de gás, que remove o oxigênio produzido pela fotossíntese (Molina et al., 2001). Flat Panel ou Fotobiorreatores de Placas Planas têm recebido muita atenção para o cultivo de organismos fotossintetizantes por apresentarem maiores superfícies de incidência de radiação dentre os sistemas fechados de cultivo. São confeccionados com materiais transparentes à radiação luminosa para melhor aproveitamento da energia solar, do qual pode ser conseguida elevada eficiência fotossintética (Reyna-Velarde et al., 2010). As concentrações de oxigênio dissolvido em fotobiorreatores de placas planas são relativamente menores se comparadas aos fotobiorreatores tubulares horizontais. Somada à essa limitação, tem-se ainda uma maior dificuldade no controle da temperatura da cultura, efeito fotoinibidor pelo crescimento da cultura junto à parede interna das placas e possíveis estresses hidrodinâmicos para algumas cepas de microalgas (Ugwu et al., 2008). As principais vantagens dos fotobiorreatores Flat Panel são a sua produtividade e a eficiência na utilização da luz solar em função da elevada relação área-volume (Su et al., 2010).

30 Águas residuárias urbanas como meio de cultivo Exceto certos tipos de efluentes industriais, a maior parte das águas residuárias contem carbono orgânico, nitrogênio, fósforo e outros compostos, o que as torna adequadas para o cultivo de microalgas (Liang, 2013; Sahu et al., 2013). Microalgas podem crescer em águas residuárias e produzir biomassa valiosa enquanto removem o conteúdo orgânico e de minerais destes efluentes para a construção de biomassa (Ummalyma & Sukumaran, 2014). Águas residuárias têm sido utilizadas como meio de cultivo uma vez que constituem um substrato prontamente disponível e de baixo custo para o crescimento e produção de biomassa de microalgas e remoção de nutrientes (Rawat et al., 2011). O cultivo de microalgas em águas residuárias possibilita significativa redução no consumo de água doce potável, com a vantagem de uma mais rápida absorção de nutrientes, como nitrogênio e fósforo. Em comparação aos nutrientes fornecidos por fertilizantes artificiais, aqueles presentes em efluentes urbanos em geral encontram-se em formas preferencialmente assimiláveis pelas microalgas (Zhu et al., 2014a). Uma grande variedade de frações de águas residuárias urbanas, de esgoto bruto a efluentes previamente tratados em diferentes níveis (primário, secundário, lodos ativados, efluentes clarificados) e, inclusive, efluentes provenientes de espessamento de lodos ativados têm sido testados como meios de cultivo para microalgas com resultados satisfatórios em termos de produtividade de biomassa (Olguín, 2012). Águas residuárias municipais normalmente contêm cerca de 350 mg DQO L -1, 50 mg L -1 + de NH 4 - N e 10 mg L -1 de PO P (Boelee et al., 2014b). Efluentes tratados contêm altas concentrações de nutrientes (nitrogênio e fósforo) e elementos-traço (K, Ca, Mg, Fe, Cu e Mn) que são essenciais para o metabolismo e crescimento de microalgas. Efluentes secundários assim como terciários têm, portanto, encontrado ampla aplicação como meios de cultura para microalgas (Aravantinou et al., 2013). O cultivo de algas em águas residuárias, no entanto, ainda enfrenta muitas incertezas e desafios, sendo suscetível à influência de uma série de fatores e a eficiência do crescimento depende do controle de variáveis consideradas críticas. A

31 28 presença de metais pesados ou compostos orgânicos tóxicos, bem como de contaminantes bióticos como bactérias patogênicas e predadores (zôoplancton) no meio de cultivo produz efeitos inibitórios no crescimento de microalgas (Pittman et al., 2011; Van Den Hende et al., 2014; Zhou et al., 2014). A luminosidade constitui um fator crítico no crescimento de microalgas quando utilizadas águas residuárias urbanas como meio de cultivo em função da quantidade de sólidos suspensos e da turbidez apresentada por este tipo de efluente (Zhou et al., 2014). Culturas de microalgas podem superar a limitação de luz consumindo altos níveis de carbono orgânico total (COT), na forma ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico ou etanol, de águas residuárias municipais para o crescimento rápido em condições fotoheterotróficos ou mixotróficas (Ji et al., 2014). 3.6 Fatores que afetam o crescimento de microalgas A produção de biomassa de microalgas e a acumulação de substâncias de reserva são limitados por uma série de fatores, dentre os quais a disponibilidade de nutrientes, temperatura e irradiação desempenham papeis fundamentais (Roleda et al., 2013) Luminosidade A intensidade de incidência da luz solar sobre a superfície da terra pode chegar a 1100 W m -2, o que excede a quantidade de energia necessária para a produção eficiente de microalgas. Entretanto, a luz solar contém um amplo espectro da radiação eletromagnética, mas filtrada para o UV pelo ozônio atmosférico, fornecendo comprimentos de onda adequados tanto para o crescimento celular quanto para a produção de biomassa em microalgas (Chen et al., 2011).

32 29 Dentre os vários fatores que afetam a produtividade de microalgas, a luz é um dos principais parâmetros a se considerar, uma vez que fornece toda a energia necessária para suportar seu metabolismo. Contudo, quando fornecida em excesso, pode danificar as células, levando a um stress oxidativo e à fotoinibição, reduzindo a eficiência fotossintética (Gris et al., 2014). Neste caso, quando a absorção de luz excede a capacidade bioquímica do fotossistema, o excesso é dissipado na forma de calor ou de fluorescência. Quando a luz se torna limitante, células de microalgas aumentam a sua concentração de pigmentos de colheita de luz, em particular, a clorofila, a fim de capturar a luz disponível. No entanto, isto pode levar à autosombreamento interno, o denominado "efeito de pacote", em que a eficiência de absorção da luz por unidade de clorofila diminui com o aumento do teor de clorofila (Sutherland et al., 2015). Especialmente quando são utilizadas águas residuárias urbanas como meio de cultivo, a luminosidade constitui um fator crítico no crescimento em função da quantidade de sólidos suspensos e da turbidez apresentada por este tipo de efluente (Zhou et al., 2014). Culturas de microalgas podem, contudo, superar a limitação de luz consumindo altos níveis de carbono orgânico total (COT), na forma ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico ou etanol, de águas residuárias para o crescimento rápido em condições fotoheterotróficos ou mixotróficas (Ji et al., 2014) Temperatura A temperatura de um meio de cultivo contendo microalgas varia em escalas diurnas e sazonais, afetando tanto as taxas de fotossíntese quanto as de respiração. A maioria das espécies de microalgas cresce bem em uma temperatura ótima entre 15 e 25 C. Em temperaturas sub-ótimas, a fotossíntese microalgal satura com menores intensidades de luz, enquanto que em temperaturas supra-ótimas, as taxas de respiração e fotorrespiração aumentam rapidamente. A temperatura afeta também a solubilidade de gases em água, incluindo O 2 e CO 2, bem como o ph do meio (Sutherland et al., 2015).

33 30 Em cultivos de microalgas, a produção de biomassa e a acumulação de lipídios são limitadas por uma série de fatores, dentre eles a temperatura (Roleda et al., 2013). Baixas temperaturas tendem a reduzir a atividade enzimática na glicólise e no ciclo de Krebs e, consequentemente, o metabolismo do carbono (Shah et al., 2014). O controle operacional da temperatura em geral pode não ser possível ao cultivar microalgas, sendo assim importante a escolha de espécies que facilmente adaptam-se às condições climáticas existentes (Suali & Sarbatly, 2012) Nutrientes Para o processo de fotossíntese, microalgas necessitam além de luz, quantidades específicas de nutrientes essenciais, o que inclui macroelementos como C, N, P, S, K, Fe (e Si, para o caso das diatomáceas), oligoelementos como Co, Mo e Mn, e vitaminas, como a cianocobalamina e tiamina, a fim de produzirem biomassa e multiplicarem-se (Choi & Lee, 2014). Entretanto, em situações de escassez de nutrientes, são capazes de adaptarem-se às condições nutricionais do meio, armazenando quantidades em excesso de determinados elementos para uso posterior, ou ainda, ajustando a composição de sua biomassa (Markou et al., 2014b) Carbono inorgânico suplementar O carbono é um recurso essencial para a produção de microalgas, compondo cerca de 50% da sua biomassa orgânica. Durante a fotossíntese, a energia da luz é inicialmente convertida em energia química, que é então utilizado para assimilar o CO 2 para a formação de moléculas de carboidratos. Limitação de carbono no meio de cultivo é indicado pelo ph elevado durante o dia. Esta elevação do ph afeta o - 2- equilíbrio espécies inorgânicas de carbono, com o aumento da HCO 3 e CO 3 e diminuição de CO 2. Microalgas absorvem preferencialmente o CO 2 através da

34 31 difusão passiva, sobre as outras espécies de carbono inorgânico, que exigem transporte ativo. O fornecimento de dióxido de carbono como uma fonte de carbono inorgânico influencia diretamente o crescimento de microalgas. A principal resposta à introdução de CO 2 em cultivos de microalgas é o aumento do teor de clorofila a, além do que, favorece a regulação do ph do meio da cultura. O desempenho de crescimento de microalgas, no entanto, depende de o CO 2 encontrar-se em uma faixa apropriada de concentração (Tripathi et al., 2015). Além do CO 2 gasoso, que é um dos principais contribuintes para o aquecimento global, microalgas podem utilizar também o íon bicarbonato (HCO - 3 ) como fonte de carbono inorgânico para o seu crescimento autotrófico (Kim et al., 2014) Carbono orgânico suplementar Para produzir abundantemente bioprodutos de interesse a partir de microalgas, em particular, biocombustíveis, microalgas devem ser cultivadas num modo heterotrófico onde carbono orgânico, como açúcares e ácidos orgânicos comportam-se como fontes de carbono e de energia. Esta condição de cultura elimina a necessidade de luz e, por conseguinte, possibilita aumento na produtividade de biomassa (Liang, 2013). Há três modos de cultivo de microalgas com base nas diferentes formas de aproveitamento de fontes de carbono para a síntese de biomassa: fototrófico, heterotrófico e mixotrófico. Porém, somente em modos de cultivo heterotróficos o carbono em formas orgânicas pode ser utilizado por microalgas para crescimento e acumulação de materiais de reserva (lipídios e carboidratos) (Moon et al., 2013). Perfis mixotróficos, ao combinar mecanismos autotróficos e heterotróficos, assimilando simultaneamente CO 2 como fonte de carbono e compostos orgânicos como fontes de carbono e energia, são vantajosos devido à possibilidade da utilização de águas residuárias como substrato para seu crescimento, viabilizando a

35 32 degradação da matéria orgânica presente nestes substratos (Prathima Devi et al., 2013). A utilização de glicose apresenta-se como alternativa adequada de suplementação como fonte de carbono para microalgas, implicando, contudo, em custos que podem representar entre 60-75% dos custos totais de produção de biomassa. Um cenário ideal e competitivo para o cultivo seria a utilização de subprodutos industriais abundantes e prontamente disponíveis como fontes suplementar de carbono e/ou nutrientes (Espinosa-Gonzalez et al., 2014) Glicerol como fonte de carbono suplementar O Glicerol, também conhecido como glicerina ou propano-1,2,3-triol, é um produto químico que tem uma multiplicidade de aplicações industriais. É o componente principal dos triglicerídeos encontrados em gorduras animais, óleos vegetais e óleos bruto, sendo usualmente considerado um subproduto de reações de saponificação e hidrólise (Quispe et al., 2013). O glicerol bruto obtido a partir do biodiesel consiste de glicerol e de uma série de impurezas como água, sais orgânicos e inorgânicos, sabão, álcool, vestígios de glicerídeos e pigmentos vegetais, o que tende a limitar sua aplicação como matériaprima nas indústrias (Tan et al., 2013). A pureza de 99% ou superior é requerida para os mercados cosméticos e farmacêuticos, que pode ser obtida através de operações complexas de destilação (Gholami et al., 2014). Sendo um sub-produto derivado da produção de biodiesel, a previsão é de que até 2020, 2,7 milhões de toneladas de glicerol serão geradas em todo o mundo, as quais devem ser eficientemente transformadas, a fim de alcançar a sustentabilidade do segmento produtor de biodiesel (Znaiguia et al., 2014). Através de processos heterotróficos de fermentação, microalgas são capazes de converter glicerol e produzir diversos bioprodutos, tais como 1,3 propanodiol,

36 33 lipídios e pigmentos, oferecendo uma alternativa para o gerenciamento do glicerol enquanto resíduo (Chi et al., 2007). A abundância e o custo relativamente baixo do glicerol são alguns dos principais atrativos para seu uso como fonte de carbono suplementar alternativo para microalgas (Gupta et al., 2013). 3.7 Ficorremediação A ficorremediação utilizando microalgas, macroalgas e cianobactérias para a remoção ou biotransformação de nutrientes e xenobióticos de águas residuárias e de poluentes de efluentes gasosos é denominada ficorremediação, constituindo uma tecnologia emergente que tem se destacado pela viabilidade econômica e sustentabilidade ambiental (Olguín & Sánchez-Galván, 2012). Microalgas desempenham um papel fundamental e indispensável na ciclagem de elementos e poluentes em muitos ecossistemas. Por sua capacidade de interação com contaminantes aquáticos, algas têm sido empregadas em processos de tratamento de águas residuárias (Zhou et al., 2013), especialmente no tratamento terciário de águas residuárias urbanas em lagoas de maturação ou em lagoas facultativas por possuírem um metabolismo capaz de remover nutrientes, metais pesados (Muñoz & Guieysse, 2006) e produzir metabólitos secundários (exudados) capazes de provocar efeito inibitório ao desenvolvimento de patógenos (Molina-Cárdenas et al., 2014). Processos anaeróbicos em geral respondem insatisfatoriamente ao tratamento de efluentes tóxicos. Neste caso, oxigenação externa é muitas vezes necessária para a mineralização dos contaminantes presentes nesse tipo de efluente, tornando o processo dispendioso e podendo causar a liberação de aerossóis perigosos e contaminantes voláteis tóxicos, tais como compostos fenólicos ou solventes orgânicos (Muñoz et al., 2009). A oxigenação fotossintética utilizando processos envolvendo microalgas supera estas limitações por gerar O 2 in situ, tendo em vista que a luz solar é a

37 34 principal fonte de energia e que a reação implica ainda no consumo do dióxido de carbono liberado pela respiração bacteriana (Maza-Márquez et al., 2014). Não obstante, microalgas podem auxiliar na co-degradação metabólica secretando biossurfactantes e compostos extracelulares no meio, o que aumenta a biodisponibilidade de poluentes, melhorando assim, a atividade microbiana de bioconversão. As bactérias, por sua vez, podem acelerar o desenvolvimento de microalgas liberando no meio, fatores de promoção do crescimento (Tang et al., 2010). A sinergia dos processos biotecnológicos envolvendo esse tipo de consórcio permite, portanto, a degradação de poluentes da água (tratamento secundário) enquanto recupera nutrientes através da assimilação destes pela biomassa (tratamento terciário) (González-Fernández et al., 2011). A Figura 2 esquematiza a exploração de sistemas de microalgas com vistas à ficorremediação de efluentes liquidos e gasosos e à produção de bioprodutos de interesse. Microalgas são capazes de desenvolver ainda outros mecanismos como a biossorção (Fomina & Gadd, 2014), fitoquelação produção de polipeptídeos chamados fitoquelantes capazes de se ligar a metais pesados (Perales-Vela et al., 2006) e a bioacumulação (Chojnacka, 2010), possibilitando a imobilização na própria biomassa de metais pesados e poluentes orgânicas perigosos de águas residuárias. A mineralização também é um processo importante na fixação do carbono. Quantidades substanciais de CO 2 são sequestradas por consumo e precipitação de carbonatos e bicarbonatos como resultado do desenvolvimento de um meio alcalino pela atividade fotossintética (Bundeleva et al., 2014; Lee et al., 2006). Lagoas de estabilização são exemplos clássicos de sistemas que exploram relações simbióticas entre algas e bactérias para a depuração da carga orgânica e remoção de nutrientes de águas residuárias (Mahapatra et al., 2013).

38 35 Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de interação entre microalgas e bactérias durante o tratamento de águas residuárias e efluentes gasosos com geração de biomassa e possiblidade de extração de bioprodutos (adaptado de Prajapati et al. (2013)) Águas residuárias não tratadas ou parcialmente tratadas apresentam elevadas cargas de nutrientes que, uma vez lançadas em corpos d água produzem efeitos eutrofizantes (Arbib et al., 2014). A eutrofização representa uma gravíssima ameaça para a saúde em longo prazo e para o equilíbrio dos ambientes aquáticos, especialmente das águas superficiais, e dos ecossistemas em geral (Smith et al., 1999). A remoção de nutrientes aos níveis aceitáveis de descarga e/ou reuso é o maior desafio no tratamento de águas residuárias, onde muitas das tecnologias convencionais disponíveis baseadas em métodos químicos e físicos ainda são alternativas de custo elevado (Cai et al., 2013) e insustentáveis ambientalmente porque requerem o uso de produtos químicos, são acompanhadas por emissões de CO 2, e removem, ao invés de recuperar, N e P (Boelee et al., 2014a). As técnicas atualmente disponíveis removem apenas uma fração desses elementos totais presentes no efluente, e uma melhora na eficiência de remoção através dos

39 36 métodos convencionais implica em um aumento no consumo de energia em cerca de 60-80% e, consequentemente, dos custos associados aos processos. Sistemas alternativos devem explorar a combinação de múltiplas finalidades ao tratamento de águas residuárias, como a produção de energia renovável, por exemplo, de modo a compensar eventuais custos adicionais (Cabanelas et al., 2013). O método mais comum para remoção de nitrogênio é a desnitrificação, que leva à redução de nitrato a gás nitrogênio. O fósforo, por outro lado, é frequentemente removido por precipitação química com cloreto férrico (Singh & Dhar, 2011). Águas residuárias urbanas e agrícolas oferecem condições ideais para o crescimento bacteriano e decomposição da matéria orgânica através de processos oxidativos (Ruiz et al., 2013). No entanto, bactérias são pouco eficientes na remoção de nutrientes inorgânicos, dentre os quais, o P, que é o elemento normalmente responsável pela eutrofização dos ecossistemas de água doce. Portanto, um polimento final adicional após um tratamento essencialmente bacteriano é necessário antes do lançamento em cursos de água naturais, o que tende a elevar os custos de tratamento (Guzzon et al., 2008). Estudos recentes têm demonstrado que tratamentos baseados em microalgas apresentam-se como métodos viáveis e alternativos aos sistemas tradicionais de tratamento para a remoção de nutrientes em excesso de diferentes tipos de águas residuárias (Samorì et al., 2014; Tuantet et al., 2014). 3.8 Recuperação de biomassa de microalgas A colheita das algas consiste na recuperação da biomassa a partir do meio de cultura. A separação e recuperação de biomassa de microalgas a partir do meio de crescimento é uma etapa crítica no processo de produção de microalgas, representando cerca de 20-30% dos custos totais (Wu et al., 2012). Células de microalgas com tamanho na faixa entre 5 e 50 µm formam suspensões estáveis em meios de cultura em função da carga de superfície negativa que carregam e por secretarem compostos orgânicos que mantêm a sua estabilidade em estado

40 37 disperso (Chen et al., 2011). A escolha da técnica de separação depende das propriedades das microalgas, tais como densidade e tamanho, e também do tipo e valor dos produtos desejados. Culturas de microalgas são suspensões geralmente muito diluídas com concentrações inferiores a 1 g L -1. Culturas diluídas podem ser ideais para a penetração de luz, podendo fornecer a biomassa necessária para os processos de produção e consecução dos bioprodutos de interesse sem grande desidratação. Uma concentração de 15 % (m/v) é a concentração mínima exigida de microalgas para a para a extração de lípidos e produção de biocombustíveis (Danquah et al., 2009). A fim de remover grandes quantidades de água e de processar grandes volumes de biomassa de algas, um método de colheita adequado pode requer um ou mais passos envolvendo processos químicos, físicos ou biológicos, de modo a efetuar a separação sólido-líquido desejada. A experiência tem demonstrado que embora um método de colheita universal adequado e econômico para todas as espécies de microalgas não exista, essa ainda é uma área ativa de pesquisa (Mata et al., 2010). A colheita de microalgas pode ser dividida em um processo de duas etapas em que, o primeiro passo é a colheita durante a qual grandes quantidades de biomassa é separada a partir do volume de cultura (2-7% de peso seco); no segundo passo, chamado de espessamento, concentra-se ainda mais a pasta de algas, sendo esta etapa a de mais intenso consumo energético (Pragya et al., 2013). As técnicas comumente aplicadas na colheita ou separação de microalgas do meio de cultivo são centrifugação, floculação, sedimentação, filtração, eletroflotação etc. (Nurra et al., 2014). A sustentabilidade de sistemas de microalgas utilizados quer seja para a produção de bioprodutos de interesse comercial ou mesmo com a finalidade de ficorremediação é alcançada desde que a biomassa produzida seja aproveitada (Rawat et al., 2011). O processo de colheita ou separação da biomassa do meio de cultivo é o principal gargalo em atividades de produção de microalgas para os mais diferentes fins (Granados et al., 2012). Algumas das tecnologias aplicáveis à

41 38 separação de biomassa de microalgas mais comumente utilizadas são centrifugação, filtração, flotação, coagulação, floculação, etc. No entanto, estes processos de separação convencionais possuem algumas limitações em termos de consumo de energia, custos e eficiência, uma vez que as células de microalgas apresentam dimensões reduzidas, encontram-se em baixas concentrações no meio e são altamente estáveis em suspensão (Hu et al., 2013) Métodos eletroquímicos Métodos eletroquímicos são processos físico/químicos que utilizam correntes elétricas para dissolver metais de sacrifício e assim fornecer os íons necessários para a coagulação/floculação. Ao contrário da floculação química com o uso de alumínio ou cloreto férrico, por exemplo, métodos eletroquímicos não introduzem ânions desnecessários que podem resultar na redução do ph (Lee et al., 2013). Tecnologias combinando eletrocoagulação com eletroflotação tem atraído atenção considerável em matéria de separação de biomassa algal. Nestes processos, os íons metálicos liberados no ânodo pela oxidação eletrolítica atacam as células em suspensão promovendo a coagulação das mesmas; ao mesmo tempo, as microbolhas de oxigênio e hidrogênio geradas no ânodo e no cátodo, respectivamente, aderem-se aos microflocos formando flocos maiores que podem ser removidas por sedimentação ou levadas até à superfície pelas microbolhas (Gao et al., 2010). (Uduman et al., 2011) obtiveram mais do que 98% de recuperação de duas espécies de microalgas marinhas (Chlorococcum sp. and Tetraselmis sp.) utilizando eletrocoagulação. (Shuman et al., 2014) demonstraram através de um estudo que a electro-coagulação-floculação utilizando eletrodo de níquel pode ser eficazmente aplicada para realizar a separação/colheita de Nannochloropsis sp. do seu meio de crescimento (0,2-0,3 g L -1 ) em um tempo de tratamento de apenas 4 s, com consumo energético de 0,03 kwh m -3. O processo resulta na separação rápida de microalgas (mais de 90% em 120 minutos), com o mínimo de danos para as células de algas (> 90% de células viáveis após o processamento).

42 39 Elevada eficiência é uma característica vantajosa deste método, ao passo que o elevado consumo energético (até 16 KWh/kg de biomassa), o aquecimento que pode danificar o sistema e as incrustações/corrosões nos eletrodos são as duas principais desvantagens (Rawat et al., 2013) Filtração A filtração é o método de colheita que provou ser o mais competitivo em relação às outras opções de colheita, sendo possível concentrar microalgas com eficiências que variam de 10 a 20% (m/m), embora requeiram manutenções significativas, tais como limpezas e substituições de filtros (Weschler et al., 2014). As técnicas de filtração disponíveis compreendem microfiltração, ultrafiltração, filtração sob pressão, filtração à vácuo e filtração de fluxo tangencial. Os elevados custos de manutenção (limpeza e substituição de filtros e membranas) e consumo energético são aspectos negativos que limitam as aplicações desta técnica para a separação de biomassa microalgal (Rawat et al., 2013). No entanto, pode tornar-se viável para a colheita de espécies filamentosas, como Spirulina sp. (> 70μm cel -1 ) ou formadoras de grandes colônias, tais como as pertencentes às espécies Coelastrum sp. e Micractinium sp. A recuperação de variedades pequenas de algas como Dunaliella e Chlorella que possuem dimensões semelhantes às de bactérias, não pode ser realizada através de métodos de filtração envolvendo pressão ou vácuo. Técnicas de filtração avançadas, como a microfiltração, ultrafiltração ou membranas são mais indicadas nesses casos, para pequenas escalas. Em largas escalas são recomendadas técnicas de filtração de fluxo tangencial (Abdelaziz et al., 2013; Harun et al., 2010).

43 Biocombustíveis Fontes alternativas de combustíveis produzidos a partir de materiais nãotóxicos, biodegradáveis e renováveis têm atraído grande interesse atualmente em face de uma demanda energética global crescente. Biocombustíveis representam uma importante forma de progresso tecnológico na busca por soluções energéticas sustentáveis (Quispe et al., 2013). A biomassa é considerada uma fonte promissora para a produção de biocombustíveis para atenuar o esgotamento da energia fóssil e de Gases do efeito estufa (Zhang et al., 2014b). A biomassa é a matéria derivada direta ou indiretamente de plantas e animais. A sua base de recursos inclui centenas de milhares de espécies de plantas, tanto terrestres quanto aquáticas; de diversos resíduos agrícolas, florestais, de esgotos e de processo industriais. A biomassa é um recurso renovável e a energia derivada de biomassa é, portanto, considerada renovável (Ibrahim et al., 2014). Em pesquisas relacionadas a biocombustíveis de biomassa, ênfase específica é dada para o desenvolvimento de hidrocarbonetos líquidos que possuam propriedades semelhantes aos derivados de fontes minerais e que possam substituir ou serem misturados à gasolina, diesel e etanol (Yue et al., 2014). Entretanto, outras formas de biocombustíveis têm recebido notória atenção, como é o caso do biogás, substituindo o gás mineral na produção de energia e calor, e também como combustível gasoso veicular (Zirkler et al., 2014). A principal vantagem econômica dos biocombustíveis é que, enquanto a mudança para outros tipos de energias renováveis incorre em grande investimento de capital, os biocombustíveis podem ser introduzidos nas matrizes energéticas sem grande mudança nas infraestruturas existentes (Tokunaga & Konan, 2014). Óleos e lipídios provenientes de plantas oleaginosas como soja, girassol, canola, pinhão manso, e de gorduras animais estão sendo intensivamente investigado como matérias-primas potenciais para a produção de biodiesel. No entanto, a obtenção de grandes quantidades destes substratos esbarra em uma

44 41 série de desafios, que incluem: variação de crescimento sazonal, taxa de crescimento lento de muitas plantas oleaginosas tradicionais, de baixos índices de produtividade por áreas, competição com óleos comestíveis, processos de extração caros, etc. (Terigar & Theegala, 2014). A matéria-prima agrícola deverá satisfazer a maior parte da procura total por biomassa para fins energéticos nos próximos anos. No entanto, a matéria-prima lignocelulósica é caracterizado por reduzida densidade por peso seco ( kg m - 3 ) e baixos poder calorífico (10-17 MJ kg -1 ) e fluidez, formas irregulares e alta umidade em alguns casos, limitando sua aplicação como fonte de energia (Miao et al., 2012). As emissões de GEE associadas ao aproveitamento de determinadas formas de biomassa para fins energéticos podem ser comparativamente menores do que aquelas resultantes da queima de combustíveis minerais. Pucker et al. (2012) comparou as emissões de GEE (CO 2, CH 4 e N 2 O) resultantes em termos de CO 2 equivalente do uso de biometano obtido a partir de diferentes processos de conversão de biomassa vegetal sólida em substituição ao gás natural no aquecimento de ambientes. As análises dos GEE demonstraram que as mais baixas emissões de gases foram as resultantes do biometano obtido através por gaseificação indireta de resíduos florestais (32 kg CO 2 equivalente MWh -1 ), o que representa uma redução em 80% das emissões quando comparado ao gás natural. Quando queimados diretamente na forma de cavacos de madeira, a redução das emissões de GEE observada foi comparativamente inferior em apenas 29%. Materiais lignocelulósicos como os da agricultura e os resíduos florestais, bem como culturas herbácea e lenhosas de ciclos curtos, têm sido extensivamente investigadas como matéria-prima para a produção de biocombustíveis. O grande desafio da produção de biocombustíveis a partir de lignocelulose é aumentar a produtividade, minimizando o uso de produtos químicos caros como é o caso das enzimas (Chen et al., 2014).

45 Biocombustíveis de microalgas Uma série de investigações apontam múltiplos impactos negativos associados aos chamados biocombustíveis de primeira e segunda geração (derivados de culturas convencionais), incluindo elevado consumo de água e agroquímicos, degradação da terra pelo uso intensivo do solo, aumento das emissões de CO 2 e outros gases de efeito estufa, perda da biodiversidade e instabilidade dos preços globais de alimentos e etc. (Benson et al., 2014). Biocombustíveis de microalgas representam uma alternativa potencial aos combustíveis a base de petróleo utilizados pelo setor de transportes e aos biocombustíveis de primeira e segunda geração. Em comparação com outras tecnologias, a possibilidade de cultivo em águas salobras ou residuárias e em terras não-aráveis, com rendimentos de óleo muito superiores são os fatores mais favoráveis para a exploração de culturas de microalgas para a produção de biocombustíveis (Ribeiro & Silva, 2013). Além disso, estes microrganismos capturam até 2 g de CO 2 atmosférico por grama de biomassa, ou seja, utilizam um gás de efeito estufa para produzir e acumular compostos precursores de biocombustíveis (Moll et al., 2014). Microalgas vem se destacando como fonte potencial de combustíveis à base de biomassa não-lignocelulósica, o que as classifica como matéria-prima de terceira geração para a produção de biocombustíveis (Ho et al., 2013). Estão entre as mais promissoras fontes de biocombustíveis por sua capacidade de multiplicar-se intensamente mesmo em águas de baixa qualidade e/ou em terras não-aráveis absorvendo grandes quantidades de CO 2, e acumular quantidades apreciáveis de substâncias de reserva (Ashokkumar et al., 2014), como polissacarídeos (açúcares) e triacilglicerídeos (gorduras), que são as matérias-primas para a produção de bioetanol e biodiesel, respectivamente (Slade & Bauen, 2013). Esses microrganismos podem atingir índices de acumulação de substâncias oleosas por unidade de área em uma ou até duas ordens de magnitude maiores do que culturas convencionais como a canola, palma, soja ou pinhão manso (Yue et al., 2014).

46 43 A biomassa microalgal pode ser convertida em biocombustíveis sólidos, líquidos ou gasosos com potencial de suprir 30% da demanda global de combustíveis sem afetar a produção de alimentos (López Barreiro et al., 2013) através de diversos processos, dentre os quais destacam-se os termoquímicos (liquefação, pirólise, gaseificação) (Amin, 2009), químicos (transesterificação) e os bioquímicos (fermentação e digestão anaeróbica) (Demirbas, 2011). Quando processadas por meio de reações químicas ou biológicas, a biomassa de microalgas pode fornecer diferentes tipos de biocombustíveis renováveis, tais como biodiesel, biohidrogênio, bioetanol e biometano. Pittman et al. (2011) reviram o potencial de produção de biocombustíveis e concluiu que as atuais tecnologias de cultivo de algas com essa finalidade são economicamente inviáveis. No entanto, uma opção mais atraente em termos de redução de emissões de GEE, demanda por recursos de água doce e fertilizantes, o que, por conseguinte resulta em menores custos de geração de biocombustíveis, é o cultivo de algas utilizando águas residuárias. Segundo os mesmos autores, a alta produtividade de biomassa de microalgas cultivadas em esgotos e águas residuárias sugere que este método de cultivo oferece um meio viável para a geração de biocombustíveis e é provável que seja uma das principais tecnologias utilizadas para a produção de energia sustentável e renovável no futuro. Não obstante, embora o uso de águas residuárias como fonte de nutrientes apresente riscos de contaminação e que o uso de fertilizantes e de água doce deve ser preferido, publicações recentes envolvendo Análise do Ciclo de Vida (ACV) confirmaram que o uso das águas residuárias para a produção de biocombustíveis a partir de microalgas assegura a viabilidade econômica e a sustentabilidade de todo o processo de produção (Olguín, 2012). Um dos principais requisitos para a produção em larga escala de biocombustíveis provavelmente seja a utilização de cepas de microalgas adaptadas às condições ambientais locais. Assim, existe a necessidade de isolamento eficaz e rápido de estirpes de microalgas com potencial elevado de crescimento e produtividade de biomassa, com teores de lípidos e/ou polissacarídeos satisfatórios para viabilizar a exploração (Abdelaziz et al., 2014).

47 44 Além de fonte potencial de matéria-prima para a produção de biodiesel, microalgas tem atraído interesse também como uma fonte de outros tipos de biocombustíveis, como hidrogênio (Nayak et al., 2014) e butanol (Efremenko et al., 2012) para serem utilizados diretamente como fontes de energia ou para a geração de energia elétrica (Lakaniemi et al., 2013). A biomassa microalgal pode ser submetida a um processo de pirólise produzindo assim H 2, bem como hidrocarbonetos leves, tais como CH 4, C 2 H 6, C 2 H 4 (Nasir Uddin et al., 2013). A biomassa de microalgas pode ser empregada ainda como matéria-prima para a produção de biogases na forma de resíduo, após prévia extração para aproveitamento dos conteúdos intracelulares via fermentação anaeróbica (Mussgnug et al., 2010; Ramos-Suárez & Carreras, 2014). Em relação aos combustíveis com base em microalgas, o foco principal é a produção de biodiesel, enquanto bioetanol e o biometano são considerados como parte de processos integrados (Oncel, 2013) em que a biomassa residual gerada no processo de extração de óleo pode ser fermentada aerobicamente em etanol e, anaerobicamente, em biometano (Chinnasamy et al., 2010) Biodiesel de microalgas O biodiesel é um combustível renovável e potencial substituto do diesel mineral. Entre as várias matérias-primas disponíveis para a produção de biodiesel, as microalgas têm se mostrado promissoras, uma vez que possuem elevadas taxas de crescimento e produtividade de lipídios, em comparação com a maioria das matérias-primas à base de plantas (Guldhe et al., 2014). A Lei n (BRASIL, 2005) trás a seguinte definição para biodiesel: biocombustível derivado de biomassa renovável para uso em motores a combustão interna com ignição por compressão ou, conforme regulamento, para geração de outro tipo de energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustíveis de origem fóssil."

48 45 Uma definição mais detalhada em termos da constituição do biodiesel é dada pela pelo inciso I, Art. 2º da Resolução n. 45 (ANP, 2014): Biodiesel: combustível composto de alquil ésteres de ácidos carboxílicos de cadeia longa, produzido a partir da transesterificação e/ou esterificação de matérias graxas, de gorduras de origem vegetal ou animal, e que atenda a especificação contida no Regulamento Técnico, parte integrante desta Resolução. Em sua constituição, um biodiesel comumente apresenta uma mistura de ésteres metílicos, em geral obtidos segundo a reação: Triglicerídeos + 3 metanol 3 éster metílico (biodiesel) + glicerina O poder calorífico do biodiesel é comparável ao diesel de petróleo. Biodiesel produzido a partir de biomassa de microalgas pode chegar aos 41 MJ Kg -1, enquanto o diesel mineral possui um capacidade calorífica máxima de 42,7 MJ Kg -1 (Demirbas & Fatih Demirbas, 2011). O teor de lípidos na biomassa é tipicamente muito baixa (<5% m/m) e é dependente da espécie. A escolha da espécie é um fator determinante na exploração comercial de cultivos de microalgas para a produção de biodiesel. Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis sp., Nitzschia laevis, Parietochloris incise e Schizochytrium sp. possuem conteúdos de lipídios superiores a 50% do seu peso seco (Uggetti et al., 2014). O acúmulo de lipídios em microalgas é uma consequência da escassez nutrientes, especialmente de nitrogênio, e excesso de disponibilidade em de carbono orgânico (Chandra et al., 2014). Tanto o carbono inorgânico (CO 2 ) quanto orgânico (glucose, acetato, glicerol, etc) podem ser utilizados por microalgas para a produção de lipídios. As classes de lipídios encontrados em microalgas são divididas em lipídios neutros (triglicerídeos, colesterol) e lipídios polares (fosfolipídios, glicolipídios). Enquanto lipídios neutros, os triglicerídeos são a principal matéria-prima para a produção de biodiesel. As vias de síntese de triglicéridos em microalgas consistem basicamente em três etapas: (a)

49 46 formação de acetil-coenzima-a (acetil-coa) no citoplasma; (b) alongamento e a dessaturação da cadeia de carbono dos ácidos graxos; e (c) a biossíntese de triglicéridos em microalgas, tendo acetil-coa e L-α-fosfoglicerol como os principais precursores (Huang et al., 2010). Essencialmente, a biossíntese de biomassa compete com a de lipídios na assimilação de carbono inorgânico durante a fotossíntese, sendo necessário portanto, um estímulo interruptor do processo metabólico de produção de biomassa para que a síntese lipídica possa ser priorizada (Fields et al., 2014). Quando submetidas a determinadas situações de estresse (ambiental e/ou nutricional), microalgas podem alterar seu metabolismo interrompendo a síntese de glicerolipídios, que desempenham basicamente funções estruturais, e intensificar o acúmulo de lipídios neutros, os triacilgliceróis, cuja função é a de servir de substância energética de reserva, podendo atingir até 50% do peso seco na biomassa. Os triglicerídeos são, na verdade, os componentes chave de lipídios para a produção de biodiesel a partir de microalgas (Oncel, 2013). Os óleos vegetais e gorduras animais em suas formas brutas diferem do petro-diesel em viscosidade, não atendendo deste modo os padrões regulatórios para uso direto em motores sem prévia conversão. A técnica mais amplamente difundida de conversão de lipídios em biodiesel é a transesterificação que, embora tenha recebido considerável atenção nas últimas décadas, apresenta intenso consumo energético e várias etapas subsequentes de purificação para remoção de subprodutos (glicerol) e recuperação de catalizadores que tendem a elevar os custos de produção (Rawat et al., 2013). A transesterificação (também chamada de alcoólise) consiste numa reação em geral catalisada por compostos ácidos ou básicos ou enzimas (lipases) entre glicerídeos (gorduras ou óleos) com um álcool para formar ésteres e glicerol. O resultado da transesterificação é um produto constituído de uma mistura de ésteres, glicerol, álcool, catalisador e tri-, di-e monoglicerídeos (Bharathiraja et al., 2014).

50 Extração de lipídios de microalgas Lipídios podem ser definidos como qualquer molécula biológica que se solubiliza em solventes orgânicos. A maioria dos lipídios pode geralmente ser classificada em duas categorias com relação à polaridade em: (1) lípidos neutros (glicerídeos, ácidos graxos livres, hidrocarbonetos, cetonas, esteróis, e pigmentos tais como carotenóides e clorofilas), e (2) os lípidos polares, que são subcategorizados em fosfolípidos e glicolípidos. Os vários componentes de lipídios polares (acilgliceróis, ácidos graxos livres e partes de ácidos graxos) podem ser facilmente convertidos em ésteres metílicos de ácidos graxos, que são os principais componentes do biodiesel (Shin et al., 2014). Microalgas produzem tanto lipídios neutros, como triglicerídeos e lipídios polares, como os fosfolipídios, que são comumente produzidos na membrana celular, enquanto que os primeiros são acumulados como gotículas no citoplasma (Taher et al., 2014). A acumulação de lipídios intracelulares em geral ocorre como resultado de um estresse ambiental, dentre estes, limitações na disponibilidade de nutrientes, especialmente nitrogênio, em que o metabolismo microalgal é direcionado da produção de carboidratos para a síntese e acumulação de lipídios (Procházková et al., 2014). Lípidos brutos podem ser eficientemente extraídos a partir de biomassa seca de microalgas através métodos de extração utilizando uma variedade de solventes (clorofórmio, etanol, n-hexano e éter dietílico), através de métodos como os descritos por Folsch, Soxhlet, Bligh e Dyer e etc (Rawat et al., 2013; Shin et al., 2014), extração com dióxido de carbono supercrítico (Halim et al., 2011), ultrassom (Bigelow et al., 2014), microondas (Dai et al., 2014), etc. Estudos prévios também relatam o sucesso na utilização de técnicas integradas em que, em geral, uma delas atua como pré-tratamento para uma etapa posterior de extração efetiva. A biomassa de microalgas pode, por exemplo, ser submetida anteriormente a um pré-tratamento para ruptura celular para promover o aumento da superfície de contato e, subsequentemente, ser eluída em um solvente

51 48 para a extração dos lípidos da matriz celular. Idealmente, uma tecnologia de extração de lipídios de microalgas para produção de biodiesel deve exibir um nível elevado de especificidade para os a fim de minimizar a co-extração de contaminantes não-lipídicos (proteínas e carboidratos) e seletiva no sentido de extrair preferencialmente acilgliceróis do que outras frações lipídicas que não são prontamente conversíveis em biodiesel (i.e, lipídios polares, ácidos graxos livre s, hidrocarbonetos, esteróis, cetonas, carotenos, e clorofilas e etc.) (Halim et al., 2012a) Extração de biocompostos de microalgas Os produtos bioquímicos primários utilizados para a síntese de biocombustíveis (lipídios neutros para o biodiesel e açúcares simples para o bioetanol) normalmente estão encapsulados dentro das estruturas celulares das microalgas ou apresentam-se como constituintes da membrana e/ou parede celular. O rompimento celular é um passo em geral necessário no pré-processamento, uma vez que libera os produtos anteriormente mencionados da matriz celular de microalgas para posterior conversão em bioprodutos de interesse (Halim et al., 2012b; Lee et al., 2012). Dentre os métodos de extração de lipídios utilizados para microalgas destacam-se os baseados na extração por solventes como o n-hexano, clorofórmio e metanol. Contudo, vários métodos alternativos à utilização de solventes têm sido intensivamente investigados, incluindo a utilização de moinhos de esferas, enzimas, ultra-som, micro-ondas, métodos térmicos, pressão osmótica, extração com CO 2 supercrítico e etc. (Keris-Sen et al., 2014).

52 Composição em ácidos graxos nas microalgas Lee et al. (2010) determinaram a composição de ácidos graxos através de cromatografia gasosa. Os ácidos predominantemente encontrados nas análises foram o oléico (C18: 1) e o linoléico (C18: 2), em concentrações de 10,75 e 6,91 mg g -1 de peso seco. Segundo Sánchez et al. (2011), a ocorrência de grandes quantidades de ácido linolênico (C18:3) na composição oleosa de biomassa de microalgas tende a tornar a matéria-prima demasiado ácida, comprometendo seu aproveitamento para a produção de biodiesel via transesterificação básica. Os autores sugerem a aplicação de uma operação de esterificação dos ácidos graxos livres com um álcool na presença de um catalisador ácido anteriormente à transesterificação alcalina de triacilgliceróis também utilizando álcool, melhorando assim a performance da reação. Estes ácidos graxos são uma mistura de ácidos graxos insaturados, tais como palmitoleico, oleico, linoleico e ácido linolénico, e os ácidos graxos saturados, tais como ácido palmítico e ácido esteárico. O ácido palmítico e o oleico são os principais ácidos graxos, no caso de microalgas. Altos níveis de ácido oleico podem fazer o óleo resistente à oxidação, que é essencial para aplicações de biodiesel e biolubricantes (Kiran et al., 2014). De acordo com Halim et al. (2012a), o perfil de ácidos graxos e a composição de lipídios extraídos a partir de uma espécie particular são afetados pelo ciclo de vida da microalga, bem como pelas condições de cultivo, tais como a composição do meio, a temperatura, a intensidade de iluminação, das trocas gasosas e da relação entre as fases luz/escuro. Ainda segundo os mesmos autores, células de microalgas colhidas durante a fase estacionária apresentam quantidades menores de lipídios polares do que as mesmas espécies colhidas na fase logarítmica. Choi et al. (2014) determinaram a composição de ácidos graxos de Scenedesmus sp. por FT-IR. As espécies mais abundantes de ácidos graxos encontradas nesta investigação foram os ácidos linolênico (C18:3) com 41,22%, seguido do ácido palmítico (C16:0) com 33,21% e do ácido linoleico (C18:2) com

53 50 11,59%. Segundo os autores, com esta composição, o biodiesel produzido a partir da biomassa de Scenedesmus sp. apresenta elevada qualidade, atendendo às especificações de normas internacionais como ASTM D6751 e EN para biodiesel e biocombustíveis. Ho et al. (2014) cultivaram Desmodesmus sp. F2 autotroficamente com injeção contínua de CO 2 a 2,5% a taxas de 0,2 vvm em meio artificial. Após otimizações em condições como intensidade luminosa (700 μmol m -2 s -1 ), temperatura (35 C), fonte de nitrogênio (nitrato, 6,6 mmol L -1 ), intensificaram o rendimento de biomassa de 1,92 para 3,32 g L -1 com conteúdo médio final de lipídios de 64,13%, sendo que 95% da composição dos ácidos graxos correspondem às espécies C16 e C18. Microalgas marinhas são excelentes fontes de ácidos graxos poliinsaturados importantes tais como o ácido linoleico (C18: 2n-6), ácido α-linolênico (C18: 3n-3), ácido araquidônico (C20: 4n-6), ácido eicosapentaenóico (C20: 5n-3), e ácido docosahexaenóico (C22: 6n-3) os quais são considerados essenciais na aquicultura. O omega-3, em particular, têm demonstrado possuir propriedades nutricionais benéficas, assim como os ácidos C20: 5n-3 (EPA) e C22: 6n-3 (DHA) (Welladsen et al., 2014).

54 51 4 METODOLOGIA 4.1 Delineamento experimental da pesquisa Os experimentos foram realizados em duas etapas: Uma em escala piloto (ETAPA I) em que se produziu biomassa em efluente urbano secundário e realizou-se o estudo do efeito da utilização de CO 2 na ficorremediação do efluente, bem como na produção de biomassa, acúmulo de lipídios e composição de ácidos graxos para se avaliar o potencial de produção de biodiesel. Na segunda etapa (ETAPA II), buscou-se avaliar os efeitos da utilização de glicerol como fonte de carbono suplementar testando diferentes concentrações (o (controle), 1, 3 e 5 g L -1 ) na produtividade, acumulação de lipídios e composição de ácidos graxos em biomassa. Esta etapa foi conduzida em escala laboratorial a fim de testar simultaneamente as diferentes concentrações de glicerol. pesquisa. A Figura 3 mostra de forma esquemática o delineamento experimental da

55 Figura 3. Fluxograma esquemático do delineamento da pesquisa. 52