Indução de ovulações duplas utilizando baixa dose de deslorelina em éguas

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1 Ciência Veterinária nos Trópicos, Recife-PE, v. 17, n. 1/2 p janeiro/agosto, 2014 Indução de ovulações duplas utilizando baixa dose de deslorelina em éguas Marlon Vasconcelos AZEVEDO¹, Natalia Matos SOUZA¹, José Carlos FERREIRA-SILVA¹, Ilana Oliveira BATISTA¹, Felipe Augusto Boudoux Martins SALES¹, Marco Antonio ALVARENGA 2, Marcos Antonio Lemos OLIVEIRA 1, Paulo Fernandes LIMA¹ RESUMO 1 Laboratório de Biotecnologia aplicada à Reprodução Animal. Departamento de Medicina Veterinária/ Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife. Brasil. ² Laboratório de Reprodução Animal do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp-Botucatu, SP, Brasil Autor para correspondência: paulolima4045@hotmail.com Objetivou-se induzir ovulações múltiplas em éguas utilizando baixas doses de acetato de deslorelina (GnRH) visando aumentar a eficiência reprodutiva nessa espécie. Foram utilizadas 15 éguas doadoras de embriões da raça Quarto de Milha, em sistema cross over 15 x 2 (quinze animais x dois tratamentos), no qual cada uma foi monitorada por dois ciclos consecutivos. No Grupo Controle (GC), o estro das doadoras ocorreu de forma natural e o desenvolvimento folicular foi monitorado por ultrassonografia. A ovulação foi induzida com 2500 UI de hcg por via intravenosa, quando o foliculo alcançou diâmetro de 35 mm, momento em que se procedeu a inseminação artificial. No oitavo dia (D8) após ovulação, as doadoras foram submetidas aos procedimentos de colheita embrionária. No Grupo Tratado (GT), as doadoras receberam, por via intramuscular, 7,5 mg de dinoprost-trometamina e após 48 horas de sua administração foi realizado o monitoramento folicular duas vezes ao dia com auxilio de ultrassom, até que o maior folículo atingisse o diâmetro de 23 a 25 mm e o segundo do que 18 mm. Posteriormente iniciou-se o protocolo de superovulação com a administração de 100 µg de GnRH em intervalo de 12 horas até que o maior folículo atingisse o diâmetro entre 33 de 35 mm. A ovulação foi induzida com 1000 µg de GnRH, por via intramuscular, associado a 1000 UI de hcg aplicado por via intravenosa. Imediatamente após a ovulação efetuou-se a inseminação artificial e a colheita de embriões realizada no D8. O percentual de éguas com ovulações múltiplas no GC foi de 13,33% (2/15) e no GT de 86,66% (13/15), havendo diferença (P<0,05). O número médio de embrião por doadora foi de 1,066±0,497 no GT e de 0,6±0,48 no GC, registrando-se diferença (P < 0,05). A porcentagem de embrião por ovulação foi de 52,94% no GC e 57,14% no GT, existindo diferença (P < 0,05). A porcentagem de embrião por lavado foi de 60,00% no GC e de 80,00% no GT, havendo diferença (P > 0,05). Os resultados permitem concluir que a administração de pequenas doses de GnRH favorece o crescimento dos folículos dominante e co-dominante, aumenta a incidência de ovulações múltiplas e a taxa de recuperação embrionária por ciclo, contribuindo para aumentar a eficiência reprodutiva das doadoras de embriões. PALAVRAS-CHAVE embrião, GnRH, folículo Double ovulation induction using low dose of Deslorelin in mares ABSTRACT The wok was aimed to induce multiple ovulations in mares using low doses of deslorelin acetate (GnRH) to enhance the reproductive efficiency. A total of 15 mares of the quarter horse breed were used as embryo donors in a cross over 15 x 2 experimental design (fifteen animals x two treatments), where animals were monitored for two consecutive cycles. On the control group (CG), the estrous of donors occurred on its natural form and follicular development was monitored by ultrasonography. Ovulation was induced with 2500 IU hcg intravenously, when the follicle reached 35 mm in diameter, moment when artificial insemination was performed. On day 8 (D8) after ovulation, donors were submitted to embryo collection. On Treated Group 2 (TG), donors received, by intramuscular shot, 7.5 mg dinoprost thrometamine and after 48 hours of its administration follicular development was monitored twice a day by ultrasound, until the larger follicle reached 23 to 25 mm and the second follicle reached at least 18 mm. Moreover, a super-ovulation protocol was performed with 100 µg deslorelin in 12 42

2 Indução de ovulações duplas utilizando baixa dose de deslorelina em éguas O trabalho foi realizado na Central Ilana Reprodução Equina, localizada no Município de Pombos, a uma latitude 08º08 29» sul e a uma longitude 35º23 45» oeste, a uma altitude de 208 metros, situada na Região Agreste do Estado de Pernambuco. Foram utilizadas 15 éguas doadoras de embriões da raça Quarto de Milha, em sistema cross over 15 x 2 (quinze animais x dois tratamentos), no qual cada uma foi monitorada por dois ciclos consecutivos. As éguas, selecionadas através de exame clínico ginecológico, encontravam-se em plena atividade reprodutiva, com idade variando de oito a 20 anos e peso corporal entre 450 e 550 Kg. Foram mantidas em baias individuais e a alimentação constou de feno de Tifton (Cynodon spp.), água e sal mineral ad libitum, além de suplementação com 4 kg de ração comercial peletizada própria para equinos, fornecida duas vezes ao dia. O acetato de deslorelina (GnRH) foi doado pelo Laboratório de Reprodução Animal do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp-Botucatu, SP, Brasil. O Vetercor (hcg) foi produzido pela Empresa Laboratórios Hertape Calier e o Lutalyse (Dinoprost-trometamina) pela Pfizer, ambos comercialmente adquiridos. A dinâmica folicular foi avaliada por ultrassonografia transretal com auxílio de ultrassom (Aloka 500 Japan) equipado com um transdutor linear de 5 MHz. O diâmetro dos maiores folículos foram determinados por média aritmética das duas maiores distâncias transversais do antro folicular em uma única imagem congelada no monitor do aparelho de ultrassonografia conforme sugerido por Ginther (1986/1995). No Grupo Controle (GC), o estro das doadoras ocorreu de forma natural e o desenvolvimento folicular foi monitorado por ultrassonografia. A ovulação foi induzida com 2500 UI de hcg por via intravenosa, quando o foliculo alcançou diâmehour intervals until larger follicle reached 33 to 35 mm. The ovulation was induced with 1000 µg deslorelin acetate, by an intramuscular shot, concomitant with 1000 IU hcg intravenously. Artificial insemination was performed immediately after ovulation and embryo collection was on D8. The percentage of mares with multiple ovulations on CG was 13.33% (2/15) and TG of 86.66% (13/15), with difference between groups (P < 0.05). The mean number of embryos per donor was 1.066±0.497 on TG and 0.6±0.48 on CG (P < 0.05). The percentage of embryos per ovulation was 52.94% on CG and 57.14% on TG, with difference between groups (P < 0.05). The percentage of embryos per flushing was 60.00% on CG and 80.00% on TG, with difference between groups (P > 0.05). The percentage of embryo recovery per flushing was 60% CG and 80% on TG (P<0.05). The results allow the conclusion that administration of small doses of GnRH enhances dominant and co-dominant follicular growth, increasing the incidence of multiple ovulations, embryo recovery rates per cycle and contributes to increase the reproductive efficiency of embryo donors. KEYWORDS embryo, GnRH, follicle. INTRODUÇÃO A equinocultura é uma atividade importante para a economia brasileira, gerando um faturamento total da ordem de R$ 7,3 bilhões, além de 641 mil empregos diretos, seis vezes mais do que a indústria automotiva e 20 vezes mais do que a aviação civil. A transferência de embriões (TE) é uma biotécnica capaz de acelerar a disseminação de genes de animais de alto mérito zootécnico (SILVA, 2003). Com 43% de todas as TE mundialmente realizadas, o Brasil ocupa papel de destaque ao lado da Argentina (29%) e dos Estados unidos (18%), conforme Stroud (2010). Apesar desse volume de TE em equinos, a eficiência dessa biotécnica permanece baixa quando comparada com a de outras espécies domésticas, nas quais a adoção de protocolos de múltiplas ovulações já está estabelecida (ALVARENGA et al., 2001; NISWENDER et al., 2003). A égua é de natureza monoovular e a indução da superovulação constitui-se num dos principais problemas a ser superado, além das taxas de recuperação embrionária serem inconsistentes e abaixo do esperado (SCHERZER et al., 2008). A possibilidade de incrementar o número de ovulações na égua tem motivado diversos pesquisadores buscarem estabelecer tratamentos hormonais alternativos visando aumentar eficiência da TE utilizando fatores liberadores de gonadotrofinas (GnRH), FSH suíno (FSH-p), FSH equino (FSH-e), gonadotrofina coriônica equina (ecg), imunização contra inibina e extrato de pituitária equina (SQUIRES, 1986; MCCUE et al., 1992; GINTHER e BERGELT, 1993; NISWENDER et al., 2003; SQUIRES e MCCUE, 2007). Inicialmente a utilização do GnRH mostrou-se capaz de induzir ovulação durante o anestro sazonal de éguas (JOHN- SON, 1986/1987), todavia, na estação de monta, pareceu não induzir ovulações múltiplas (HARRISON et al., 1990/1991). Posteriormente, Ginther e Bergelt (1990) mostraram que o tratamento com baixa dose do análogo de GnRH por longo período é eficiente para aumentar o número de ovulações, mesmo fora da estação de monta. Do mesmo modo, estudo recente demonstrou que o tratamento com baixa dose de GnRH resultou em 85% de ovulações duplas por ciclo estral (NAGAO et al., 2012). Diante do exposto, objetivou-se induzir ovulações múltiplas em éguas utilizando baixas doses de GnRH visando aumentar a eficiência reprodutiva nessa espécie. MATERIAL E MÉTODOS Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto,

3 Marlon Vasconcelos Azevedo et al. tro de 35 mm, momento em que se procedeu a inseminação artificial. No oitavo dia (D8) após ovulação, as doadoras foram submetidas aos procedimentos de colheita embrionária. No Grupo Tratado (GT), as doadoras receberam, por via intramuscular, 7,5 mg de dinoprost-trometamina e após 48 horas de sua administração foi realizado o monitoramento folicular duas vezes ao dia com auxilio de ultrassom, até que o maior folículo atingisse o diâmetro de 23 a 25 mm e o segundo 18 mm. Posteriormente iniciou-se o protocolo de superovulação com a administração de 100 µg de deslorelina em intervalo de 12 horas até que o maior folículo atingisse o diâmetro entre 33 de 35 mm. A ovulação foi induzida com 1000 µg de acetato de deslorelina, por via intramuscular, associado a 1000 UI de hcg aplicado por via intravenosa. Imediatamente após a ovulação efetuou-se a inseminação artificial e a colheita de embriões realizada no D8. A análise estatística foi realizada utilizando o programa computacional InStat (GraphPad Software, Inc., 2000). Para os dados considerados normais foi utilizado a ANOVA e as múltiplas comparações, visando analisar quais grupos diferiram entre si, utilizou-se o teste de Tukey. Para os dados que não seguiram uma tendência normal foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis. O tratamento estatístico foi delineado com nível de significância para P < 0,05. RESULTADOS Nas doadoras que evidenciaram mais de uma ovulação no mesmo ciclo estral observou-se que as ovulações ocorreram em intervalo médio de 24 horas. O percentual de éguas com múltiplas ovulações foi significativamente diferente (P < 0,005) entre os grupos, verificando-se que o GT apresentou resultado mais expressivo do que o GC. Do mesmo o número médio de ovulação por doadora obtido no GC foi inferior (P < 0,05) ao observado no GT. (Tabela1). Registrou-se maior média (P < 0,05) de embriões por doadora no GT quando comparado com o GC. Do mesmo modo constatou-se que no GT ocorreu o maior percentual de embrião por ovulação, bem como de lavados positivos em relação ao GC (Tabela 2). No que concerne a dinâmica folicular do GC foi possível observar que quando o maior folículo atingiu o tamanho superior a 25 mm, os demais, entre o terceiro e o quarto dia, entraram em atresia (Gráfico 1). Na dinâmica folicular do GT observou-se que o folículo co-domimante manteve seu desenvolvimento de modo semelhante ao dominante, culminando com uma dupla ovulação (Grafico 2). DISCUSSÃO O tratamento com análogo de GnRH foi eficiente porque induziu maior número de dupla ovulação, quando comparado aos animais do GC, resultado também verificado anteriormente por Ginther e Bergfelt (1990) e por Nagao et al. (2012). Esse achado já era esperado tendo em vista que a égua apresenta característica monoovular e que a produção endógena de FSH não é capaz, normalmente, de estimular o desenvolvimento simultâneo de mais de um folículo. Além do GnRH, outras alternativas, como a utilização do Extrato de Pituitária Equina (EPE), vem sendo estudadas para induzir múltiplas ovulações na espécie equina, contudo, sem apresentar os mesmos resultados. Essa hipótese esta respaldada nos resultados de Douglas (1979/1982), Farinasso (2004), Rocha Filho (2004), Carmo (2007) e Bonin (2011), os quais, utilizando baixa dose de EPE, obtiveram, respectivamente, por- Tabela 1 - Dados relativos a ovulação nos diferentes tratamentos. Grupo N o de Animais Ovulação por Doadora Dupla n (%) ( ± s) GC 15 13,33 (2/15) a 1,13±0,231 a GT 15 86,66 (13/15) b 1,86±0,23 b ab na mesma coluna indica diferença significativa (P < 0,05). Tabela 2 - Dados relativos ao embrião nos diferentes tratamentos. Embrião Grupo N o de Animais Por Doadora ± s Por Ovulação % Por Lavado % GC 15 0,6±0,48 a 52,94 a 60,00 a GT 15 1,07±0,50 b 57,14 b 80,00 b ab na mesma coluna indica diferença significativa (P < 0,05). 44 Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto, 2014

4 Indução de ovulações duplas utilizando baixa dose de deslorelina em éguas Gráfico 1 - Comportamento da dinâmica folicular das éguas do GC durante o estro natural. Gráfico 2 - Comportamento da dinâmica folicular das éguas do (GT) durante estro induzido. O Dia 1 é referente ao dia da aplicação do agente luteolítico e o Dia 3 dia ao início do tratamento para dupla ovulação. centagens de múltiplas ovulações da ordem de 75%, 77%, 31%, 84%, e 65%. Em éguas submetidas a tratamentos superovulatórios é comum ocorrer falha de ovulação, desenvolvimento de folículos anovulatórios e folículos hemorrágicos ( DIPPERT et al., 1994; LAPIN e GINTHER, 1997), considerações não corroboradas neste trabalho, talvez em decorrência da qualidade do GnRH e da baixa doze aqui utilizada. Outra possível razão que pode explicar a não ocorrência desses fenômenos nesse trabalho é o fato das éguas não terem entrado no processo de Down regulation. Esse processo, segundo Irvine (1983), ocorre em várias espécies após a aplicação contínua de elevadas doses de GnRH, que inicialmente induz hipersecreção de gonadotrofina com dessensibilização da hipófise e posteriormente diminuição da liberação dessa gonadotrofina. No que concerne aos valores médios de embriões produzidos por doadora, a média de recuperação embrionária do GC foi semelhante ao relatado por Alvarenga et al. (2008). Por sua vez, o aumento do número de ovulações no GT foi responsável para que neste trabalho os resultados obtidos fossem muito próximo daqueles mencionados por Carmo et al. (2003) e Bonin (2011) utilizando EPE nas doses, respectivamente, de 25 mg Bid e de 7,0 mg Bid, bem como de outros trabalhos com ovulações múltiplas que relatam a recuperação de 1 a 2 embriões por ciclo (DOUGLAS, 1979; WOODS e GINTHER, 1984; McCUE, 1996; MACHADO, 2003; FARINASSO, 2004). Do mesmo modo, Ginther (1992) relaciona aumento da taxa de ovulação com aumento do número de embriões recuperados. Analisando o número de embriões recuperados por ovulação observa-se que o valor do GT foi maior do que o encontrado no GC. Esse achado é semelhante aos 60% descrito por Woods e Ginther (1984) utilizando EPE. Por outro lado, mostrou-se superior aos 49%, 43,2%, 30,2% e 26%, respectivamente, reportados por Alvarenga et al. (2001), Scoggin et al. (2002), Carmo et al. (2003) e Machado et al. (2003). Apesar de duas éguas não responderem ao tratamento de superovulação, a taxa de recuperação embrionária por lavado foi também superior no GT, fato já esperado e que corrobora os dados de Ginther (1992) e Carmo et al. (2003). A taxa de recuperação embrionária por lavado obtida no GT foi superior aos dados reportados por Taveiros et al. (1999) e sem tratamen- Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto,

5 Marlon Vasconcelos Azevedo et al. to superovulatório, bem como ao de Guimarães et al. (2007) utilizando baixa dose de EPE e próximo do verificado por Taveiros et al. (2008) sem tratamento superovulatório. O crescimento folicular médio ocorreu de forma similar tanto no GT quanto no GC, todavia, quando o maior folículo no GC atingiu a dominância (>25 mm), os demais folículos diminuiram de diâmetro e entraram em atresia. No GT, o folículo co-dominante manteve o crescimento médio de 2,5 a 3,0 mm de diâmetro por dia, até os dois folículos chegarem a ovulação. Esse achado sinaliza que a utilização de GnRH não compromete o desenvolvimento folicular ovariano, fato previamente relatado por Ginther (1986). CONCLUSÕES Os resultados permitem concluir que a administração de pequenas doses de GnRH aqui utilizadas favorece o crescimento dos folículos dominante e co-dominante, aumenta a incidência de ovulações múltiplas e a taxa de recuperação embrionária por ciclo, contribuindo para aumentar a eficiência reprodutiva das doadoras de embriões na Região do Agreste de Pernambucano. REFERÊNCIAS ALVARENGA, M.A.; MCCUE, P.; SQUIRES, E.L.; NEVES NETO, J.R. Improvement of ovarian superstimulatory. Response and embryo production in mares treated with equine pituitary extract twice daily. Theriogenology, v.56, p , ALVARENGA, M.A; CARMO, M.T; LANDIM-ALVARENGA,F.C, Superovulation in mares: Limitations and perspectives. Pferdeheilkunde,v.24, p.88-91, BONIN, B. F. Efeito do tratamento com extrato de pituitária equina na resposta ovariana e eficiência reprodutiva de éguas idosas em programa de transferência de embriões. 137f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu SP, CARMO, M.T. Disturbs on oocyte transport and maturation of mares superovulated with equine pituitary extract. 156f. Thesis (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu - SP, CARMO, M.T. Comparação entre doses constantes e decrescentes de extrato de pituitária eqüina na indução de superovulação em éguas. 156f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu SP, DIPPERT, K.D.; JASKO, D.J.; SEIDEL JR., G.E.; SQUIRES, E.L. Fertilization rates in superovulated and spontaneously ovulating mares. Theriogenology, v.41, p , DOUGLAS R.H. Some aspects of equine embryo transfer. Journal of Reproduction and Fertility. v.32, p , DOUGLAS, R.H. Review of induction of superovulation and embryo transfer in the equine. Theriogenology, v.11, p.33-46, FARINASSO, A. Utilização de baixas doses de extrato de pituitária eqüina na indução de ovulações múltiplas em éguas cíclicas. 60 f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, GINTHER, O.J. Folliculogenesis during the transitional period and early ovulatory season in mares. Journal of Reproduction and Fertility, v.90, p , GINTHER, O.J. Reproductive biology of the mare: basic and applied aspects. 2.ed. Equiservices, Cross Plains, Wisconsin, p , e 642, GINTHER, O.J. Ultrasonic imaging and Rreproductive events in the mare. 2.ed. Equiservices, Cross Plains, Wisconsin, 378 pp GINTHER, O.J.; BERGFELT, D.R. Effect of GnRH treatment during the anovulatory season on multiple ovulation rate and on follicular development during the ensuing pregnancy in mares. Journal of Reproduction and Fertility, v.88, p , GINTHER, O.J.; BERGFELT, D.R. Growth of small follicles and concentrations of FSH during the equine estrous cycles. Journal of Reproduction and Fertility, v.99, p , GINTHER, O.J. Ultrasonic imaging and animal reproduction: horses. Book 2. Equiservices, Cross Plains, Wisconsin, 394pp, GREAVES, H.E.; KALARIOTES, V.; CLEAVER, B.D.; PORTER, M.B.; SHARP, D.C. Effects of ovarian imput on GnRH and LH secretion immediately postovulation in pony mares. Theriogenology, v.55, p , GUIMARÃES, J.D. Taxas de recuperação embrionária em programa comercial de transferência de embriões em éguas da raça Mangalarga Machador. Acta Scientiae Veterinariae, v.35, supl.3, p.1220, Harrison, L.A.; Squires, E.L.; Nett, T.M.; McKinnon, A.O. Use of gonadotropinreleasing hormone for hastening ovulation in transitional mares. Journal of Animal Science, v.68, p , Harrison, L.A., Squires, E.L., Nett, T.M.; McKinnon, A.O. Comparison of hcg, burserelin and luprostiol for induction of ovulation in cycling mares. Journal of Equine Veterinary Science, v.11, p , IRVINE, C. H. G. Gonadotropin-releasing hormone. Journal of Equine Veterinary Science. v.3: ,1983. JOHNSON, A.L. Gonadotropin-releasing hormone treatment indu- 46 Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto, 2014

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