DIVERSIDADE MICROBIOLÓGICA EM DUAS ÁREAS COM SISTEMA DE MANEJO DO SOLO DISTINTAS

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1 DIVERSIDADE MICROBIOLÓGICA EM DUAS ÁREAS COM SISTEMA DE MANEJO DO SOLO DISTINTAS OLIVEIRA, Pablo Boniol¹; BALLESTRIN, Carolina Scaburi²; BUENO, Paulo Agenor Alves³ RESUMO: O estudo da quantidade microbiana pode fornecer subsídios importantes para o planejamento e manejo do uso correto do solo. Este trabalho objetivou quantificar e comparar bactérias e fungos presentes em solo de cultivo agrícola e com área de reserva biológica situada no município de Tuneiras do Oeste PR. Foram coletas solos em profundidades de 0-20cm, sendo dois pontos selecionadas aleatoriamente em floresta nativa, e três em propriedade agrícola. Utilizou-se técnicas de microbiologia ambiental e diluição seriada para as amostras para quantificar as UFC/gss. Quando comparado a microbiota do solo de floresta nativa com solo de cultivo agrícola, foi possível analisar através de teste estatístico que há diferença microbiológica entre as áreas, sendo possível concluir que densidade da microbiota de floresta nativa é superior à do cultivo agrícola tradicional. Palavras-chave: Microbiologia Ambiental; Microbiota; Fungo e Bactéria. MICROBIOLOGICAL DIVERSITY IN TWO AREAS WITH DIFFERENT SOIL MANAGEMENT SYSTEM ABSTRACT: The study of the microbial quantity can provide important subsidies for the planning and management of the correct use of the soil. This work aimed to quantify and compare bacteria and fungi present in agricultural soil and with a biological reserve area located in the municipality of Tuneiras do Oeste - PR. Soils were collected at depths of 0-20cm, with two sites randomly selected in native forest, and three on agricultural property. Environmental microbiology and serial dilution techniques were used for the samples to quantify CFU / gss. When comparing the soil microbiota of native forest with agricultural soil, it was possible to analyze by statistical test that there is a microbiological difference between the areas, and it is possible to conclude that the density of the native forest microbiota is superior to that of the traditional agricultural crop. Keywords: Environmental Microbiology; Microbiota; Fungus and Bacteria. ¹ Graduando de Engenharia Ambiental - UTFPR. pabloboniol@gmail.com. ² Graduanda de Engenharia Ambiental - UTFPR. carolinascaburi@gmail.com. ³Professor Doutor da UTFPR - DABIC. pauloaabueno@gmail.com. Rev. GEOMAE Campo Mourão, PR v.8n.especial SIAUT p ISSN

2 OLIVEIRA, P.B.; BALLESTRIN, C.S.; BUENO, P.A.A. INTRODUÇÃO O solo pode ser considerado um grande habitat de microrganismos e, nesse contexto, a comunidade microbiana possui papel fundamental em importantes processos edáficos como formação e estabilidade de agregados (KEMPER & ROSENAU, 1986) e também na função de fertilidade dos solos, atuando na decomposição da matéria orgânica, na mineralização e na fixação de nutriente, interferindo em suas propriedades (PRADE, 2007). A cobertura vegetal interfere sobre a atividade microbiana dos solos e, consequentemente, sobre o processo de decomposição da matéria orgânica por meio das modificações de temperatura, umidade, aeração, ph e nutrientes. Por isso que, uma população florestal possui comportamento diferente das culturas agrícolas (BERNANDES & SANTOS, 2006). Agrotóxicos, defensivos agrícolas, pesticidas, praguicidas, remédios de planta e veneno são algumas das inúmeras denominações relacionadas a um grupo de substâncias químicas utilizadas no controle de pragas e doenças de plantas. O uso dessas substancias gera impactos negativos ao ambiente, com sua acumulação nos solos e corpos hídricos (MELO & AZEVEDO, 2008). Uma das formas de melhorar a qualidade do solo é a adoção de práticas de cultivo orgânico, as quais evitam ou praticamente excluem o uso de fertilizantes e pesticidas sintéticos, procurando substituir insumos adquiridos externamente por aqueles encontrados na propriedade ou próximos (ALTILERI, 2002). Os microrganismos são excelentes indicadores, porque se relacionam com as propriedades físicas e químicas do solo e são capazes a quaisquer modificações neste sistema, além de serem relativamente simples de mensurar, sendo a avaliação através de cultura em placas um procedimento de fácil acesso e satisfatório (ALVES, 2013). Sendo o objetivo deste trabalho comparar concentrações de unidades formadoras de colônias de bactérias e fungos presentes em solo de cultivo de cana de açúcar e de área de reserva biologia situada no município de Tuneiras do Oeste PR através de testes estatísticos. 152

3 Revista GEOMAE - v.8, n. Especial SIAUT, 2017 METODOLOGIA Área de Estudo O presente trabalho foi realizado no município de Tuneiras do Oeste, Paraná, na Reserva Biológica das Perobas e em uma área de cultivo agrícola, com produção de soja em suas proximidades. A Reserva Biológica das Perobas (Figura 1) é uma Unidade de Conservação de Proteção Integral, sob jurisdição federal, criada em 2006, abrangendo os municípios de Tuneiras do Oeste e Cianorte. Sua localização é determinada pelos pontos de coordenadas geográficas 23º 47' e 23º 55' de Latitude Sul, 52º42' e 52º51' de Longitude Oeste. Sua área territorial é de hectares, sendo que apenas 20,9 % dessa área pertence a Cianorte, e o restante a Tuneiras do Oeste (ICMBIO, 2013). Figura 1 - Localização da Reserva Biológica das Perobas em Cianorte e Tuneiras do Oeste, Paraná. Os municípios de Tuneiras do Oeste e Cianorte localizam-se na região Noroeste do Estado do Paraná, pertencentes ao bioma Mata Atlântica e ao Terceiro Planalto Paranaense ou Planalto de Guarapuava (IBGE, 2010). O clima da região é o Cfa, ou seja, subtropical úmido mesotérmico, com temperaturas entre 18ºC e 22ºC, com verões quentes, geadas pouco frequentes, sem 153

4 OLIVEIRA, P.B.; BALLESTRIN, C.S.; BUENO, P.A.A. estação seca definida, e maior concentração de chuvas no verão (IAPAR, 2000). Originados a partir do Arenito Caiuá, os solos dessa região apresentam alta suscetibilidade à erosão (IAPAR, 1999), sendo as principais classes de solos encontradas, o Latossolo Vermelho Distrófico, o Argissolo Vermelho Eutrófico e o Argissolo Vermelho Distrófico (ICMBIO, 2013). Coleta do Solo Para quantificação da microbiota presente naturalmente na área de estudo, foi realizada uma coleta de solo na Rebio das Perobas e em suas proximidades. Antes da coleta, retirou-se toda a serapilheira presente. A coleta foi realizada com o auxílio de enxadão e pá e em seguida armazenada em sacos plásticos para transporte. Na área de floresta nativa foram selecionados 2 pontos ao acaso, e para a área cultivada, 3 pontos (Figura 2). Para cada amostra, foi delimitado um quadrado de dimensões 30cmx30cm em cada área e com 20 cm de profundidade para a coleta do solo. Figura 2 Localização dos Pontos Coletados Dentro da Reserva Biológica das Perobas em Cianorte e Tuneiras do Oeste - Paraná. 154

5 Revista GEOMAE - v.8, n. Especial SIAUT, 2017 O solo foi homogeneizado, distinguindo-se apenas por área, desta forma homogeneizados os pontos e acondicionado em sacos plásticos devidamente identificados, para posteriormente serem, levados ao laboratório de Ecologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Câmpus Campo Mourão, para o processamento. Em laboratório, o solo foi colocado em bandejas plásticas, para remoção dos materiais indesejados (raízes, galhos e folhas). Posteriormente, peneirou-se com peneira de análise granulométrica de tela metálica com 2mm de malha para uniformização da amostra. Com o intuito de tornar o solo com consistência seca e estabilizou-se a umidade, utilizando 100g de solo de cada ponto e armazenamos em estufa à 30 C, sendo pesado todos os dias até estabilizar da perda de água. Após três dias, o solo estava completamente seco, para evitar a contaminação das amostras. Após a estabilização da umidade realizou-se o procedimento de diluição em série das amostras para realizar a contagem das colônias de fungos e bactérias. Onde uma alíquota de 10 g de cada amostra foi ser diluída em 90 ml de solução salina (0,85% NaCL) estéril, mantendo sob agitação em mesa agitadora à 170 rpm/40min. Em seguida, aplicou-se 1 ml da solução obtida em 9ml de solução salina estéril, sendo esta diluição de O procedimento foi repetido até a diluição (EMBRAPA, 2012) Bactérias Aeróbias Totais Para o crescimento de bactérias aeróbias utilizou-se o Meio Luria-Bertani (GREEN e SAMBROOK, 2012), de composição (g.l-1): 10,0 Triptona; 5,0 Extrato de levedura; 10,0 NaCl; 15,0 Ágar; em água destilada de ph 7,0. O meio foi autoclavado a 120ºC por 15min em seguida vertido em placas de Petri, inoculando-se 0,1ml das diluições 10-5 até Sendo realizadas duplicatas para cada diluição. As placas incubadas permaneceram em estufa a 30ºC durante 48h para ser realizada a contagem. A contagem da população de bactérias foi realizada através da técnica de contagem de placas (ALVES, 2013). As contagens das UFC/g de solo seco foram realizadas através do seguinte cálculo: UFC/gss = número de colônias por placa x diluição utilizada; Fungos Totais Para obter o crescimento da população de fungos utilizou-se o meio de cultura BDA acidificado (200 ml de caldo de batata, 18 g de ágar ágar, 10 g de dextrose e 10 gotas de ácido lático, para 1 litro de meio) (COLLA et al., 2008), no qual foram realizados duplicadas para cada diluição. 155

6 OLIVEIRA, P.B.; BALLESTRIN, C.S.; BUENO, P.A.A. Foram então retirados 0,1mL das diluições seriadas de 10-3 a 10-5 e inoculado nas placas de Petri, estas foram levadas a estufa e incubadas por 48 horas a 37 C, sendo realizada a contagem de colônias no dia seguinte. Análise Estatística Para fazer a análise estatística das duas áreas, foi necessário fazer o teste estatístico de análise de variância Kruskal-Wallis para verificar possíveis diferenças na composição microbiológica entre os pontos. Já para a área de mata nativa da Rebio das Perobas, utilizou-se o teste para duas amostras independentes Test-T. Ao verificar a homocedasticidade das ambas as áreas, realizou-se o teste de duas amostras independentes Mann Whitney, aplicando o software BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007). RESULTADOS E DISCUSSÃO As contagens das bactérias no solo estudado são apresentadas na Tabela 1. O número de unidades formadoras de colônias por grama de solo seco ficou entre a ordem de 105 a 107 para solo onde estava sendo cultivado cana de açúcar, e entre 107 a 109 para o solo de floresta nativa. Sendo esses valores normais quando comparado com o estudo de Meister et al. (2006), onde foram encontradas densidades, em células por grama de solo, em torno de 106 para solo de áreas cultiváveis, a partir da coleta de solo na profundidade de 0 a 20 centímetros. Salientando-se também que a contagem de microrganismos do solo pode variar de acordo com a metodologia aplicada ou ainda a profundida do solo que foi coletada. Tabela 1 Contagem de Unidade Formadoras de Colônias de Bactéria. 156

7 Revista GEOMAE - v.8, n. Especial SIAUT, 2017 Já as quantidades de colônias fúngicas encontradas em cada concentração são apresentadas na Tabela 2. Nota-se que a quantidade colônias encontradas por grama de solo seco ficou entre 10³ a 105 para as ambas amostras de solo. Quando comparado com Castro Junior et al. (2006), os fungos apresentavam-se na ordem de 102, já no estudo de Meister et al. (2006), as densidades foram de 104 a 105 para solo em profundidade de 0 a 20 centímetros. Tabela 2 Contagem de Unidade Formadoras de Colônias de Fungos. Para a comparação das três áreas de cultivo utilizou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis com o valor de p = , para bactérias e o valor de p = para fungos. Isso mostra que os três pontos de coleta na área de cultivo apresentam uniformidade em relação a composição microbiológica podendo ser tratadas como uma amostra representativa da área cultivada, tanto bactérias como fungos. Depois para as comparações dos dois pontos coletados dentro da reserva biológica, também não paramétricos, utilizamos o teste de Mann-Whitney. Resultando em um valor de p bilateral = e , para bactérias e fungos respectivamente. Nos quais também foram aceitas as hipóteses nulas de que a média das duas amostras, são iguais estatisticamente. Como os resultados foram de acordo com o esperado, (amostras uniformes do mesmo uso do solo) juntamos os valores dos três pontos de cultivo, e dos dois pontos de floresta. Resultando assim em duas amostras, contendo todas as contagens de UFC/gss, sendo uma de cultivo e outra de floresta. Para comparar a média dessas duas amostras que não apresentaram distribuição normal, utilizou-se o teste de Mann-Whitney. O valor de p bilateral foi menor que para ambas analises, fazendo com que rejeitamos as hipóteses nulas e aceitamos as hipóteses alternativas de que as médias amostrais são diferentes, o que já era esperado, uma vez que o tipo de manejo da área influencia significativamente na microbiota do solo. 157

8 OLIVEIRA, P.B.; BALLESTRIN, C.S.; BUENO, P.A.A. Desta forma, podemos afirmar que existe uma maior densidade de microrganismos, tanto numericamente quanto estatisticamente, encontrada na área de vegetação nativa, quando comparada a área de cultivo agrícola. Ficando constatado que o sistema natural propicia a ocorrência de maior número de microrganismos. CONCLUSÃO Os variados tipos de manejo em que uma área está sendo afetada, influencia significativamente na microbiota, o solo natural existente da Reserva Biológica das Perobas apresentou estatisticamente uma maior diversidade de comunidade microbiana quando comparado ao solo de cultivo agrícola. REFERÊNCIAS ALTIERI, M. Agroecologia: Bases científicas para a agricultura sustentável. Guaíba, Agropecuária, p. ALVES, M. S. Diversidade microbiológica cultivável de solos e seu potencial para avaliação da qualidade do solo. (Bacharel em Ciências Biológicas). Pelotas: Universidade Federal de Pelotas f. AYRES, M., AYRES JÚNIOR, M., AYRES, D.L. & SANTOS, A.A BIOESTAT Aplicações estatísticas nas áreas das ciências bio-médicas. Ong Mamiraua. Belém, PA. BERNARDES, C. M.; SANTOS, M. A. População microbiana como indicadora de interferência de diferentes manejos de solos de cerrado com cultivo de soja. Bioscience Journal, Uberlândia, v.22, n.2, p.7-16, D'ANDRÉA, A. F.; SILVA, M. I. N.; CURI, N.; SIQUEIRA, J. O. e CARNEIRO, M. A. C. Atributos biológicos indicadores da qualidade do solo em sistemas de manejo na região do cerrado no sul do estado de Goiás. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v.26, EMBRAPA. Quantificação e Identificação de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis. Curso Teórico e Prático. Jaguariúna, GREEN, M. R.; SAMBOOK, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York Disponível em: < 158

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