MAPA DO CROMOSSOMA DE E.coli

REPLICAÇÃO DE DNA

MAPA DO CROMOSSOMA DE E.coli

TERMINOLOGIA Regras básicas para a designação de genes e proteínas: Genes bacterianos 3 letras minúsculas em itálico que reflectem a sua função aparente Ex: dna (replicação do DNA), uvr (resistência à lesão por radiação UV), rec (recombinação) Quando vários genes afectam o mesmo processo, acrescenta-se as letras A, B, C, etc, que reflectem a ordem de descoberta. Proteínas bacterianas geralmente a mesma designação do gene que as codifica; 3 letras não-itálicas, a 1ª maiúscula Ex: DnaA, RecA

Conceito de Molde Watson e Crick: uma cadeia é o complemento da outra

REGRAS BÁSICAS PARA A REPLICAÇÃO DO DNA

EXPERIÊNCIA DE MESELSON - STAHL

Questões levantadas: As cadeias parentais desenrolam-se completamente antes da replicação? O início da replicação é aleatório ou não? Após o início da replicação num determinado ponto, a replicação prossegue numa direcção ou em ambas?

REPLICAÇÃO DO DNA

Regiões ricas em pares A = T

INÍCIO DA REPLICAÇÃO A replicação inicia-se nas ORIGENS DE REPLICAÇÃO, que são sequências específicas muito ricas em pares A=T E.coli - 1 origem de replicação Eucariotas - múltiplas origens de replicação localizadas ao longo do cromossoma REPLICÃO - unidade de replicação porção de DNA que sofre um processo individual de replicação

QUAL O SENTIDO DA REPLICAÇÃO?

DEFINIÇÃO DAS CADEIAS DE DNA NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO A síntese de DNA dá-se na direcção 5 3 e é semi-descontínua

A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA DESCONTÍNUA Fragmentos de Okazaki : CONTÍNUA Eucariotas: 100-200 nucleótidos E. coli : 1000-2000 nucleótidos

POLIMERIZAÇÃO DE NUCLEÓTIDOS FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO FOSFODIÉSTER (dnmp) n + dntp Mg 2+ Polimerase (dnmp) n+1 + PPi Enzima de 3 substratos: cadeia de DNA que é copiada cadeia neo-sintetizada ou cadeia em crescimento 2 -desoxirribonucleótido-5 -trifosfato incorporado

ELONGAÇÃO DA CADEIA DE DNA

PROPRIEDADES DAS DNA POLIMERASES ACTIVIDADE POLIMERÁSICA 5 3 NECESSIDADE DE UM MOLDE A cadeia molde complementar é copiada no sentido 3 5 NECESSIDADE DE UM PRIMER ACTIVIDADE EXONUCLEÁSICA 3 5 E 5 3 PROCESSIVIDADE Número de nucleótidos adicionados antes que a enzima se dissocie do molde. Esta propriedade pode ser potenciada por proteínas associadas.

FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO COMPLEMENTARIDADE DE BASES Geometria das bases Formas tautoméricas das bases ACTIVIDADE CORRECTORA DAS DNA POLIMERASES Actividade exonucleásica 3 5

A GEOMETRIA DAS BASES CONTRIBUI PARA A FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO

FORMAS TAUTOMÉRICAS DO URACILO

CORRECÇÃO DE ERROS PELA ACTIVIDADE 3 5 EXONUCLEÁSICA DA DNA POLIMERASE I

DNA polimerase I não é a responsável pela replicação do cromossoma de E.coli: Velocidade de polimerização demasiado baixa Processividade baixa Estudos genéticos demonstraram que a DNA polimerase I não actua sòzinha Em 1969 John Cairns isolou uma estirpe que produzia uma DNA polimerase I inactiva

DNA polimerases IV e V identificadas em 1999 Envolvidas numa forma específica de reparação de DNA

FRAGMENTO KLENOW DA DNA POLIMERASE I ANÁLISE POR DIFRACÇÃO DE RAIOS-X Frag. pequeno Fragmento Klenow N 5 3 exonuclease 3 5 exonuclease Polimerase C Tripsina

MODELO PARA A ESTRUTURA DO COMPLEXO DNA POLIMERASE I DNA

DNA POLIMERASE III Enzima responsável pela replicação de DNA em E.coli In vivo Pol III é uma holo-enzima constituída por, pelo menos, 10 sub-unidades: α, ε e θ formam o núcleo da enzima τ liga dois núcleos da polimerase γ 2 δδ χψ associam-se para formar um complexo que posiciona o anel (β 2 ) β dimeriza para formar um anel em torno do molde de DNA

A sub-unidade β da DNA Polimerase III forma uma estrutura em anel à volta do DNA e é responsável pela sua elevada processividade (> 500.000 nucleótidos)

REPLICAÇÃO EM E.coli Replissoma - complexo de enzimas e proteínas necessários para a replicação Polimerases Helicases Topo-isomerases Proteínas de ligação ao DNA (DNA binding proteins) Primases Ligases

ETAPAS DA REPLICAÇÃO 1. ETAPA DE INICIAÇÃO (controlo da replicação) Reconhecimento das origens de replicação por um complexo proteico Abertura localizada da dupla cadeia de DNA pela DNA helicase Síntese do primer 2. ETAPA DE ELONGAÇÃO Síntese contínua na cadeia leading Síntese descontínua na cadeia lagging 3. ETAPA DE TERMINAÇÃO Reconhecimento de sequências, sobre as quais se fixam proteínas, bloqueando o movimento de progressão da forquilha de replicação

REPLICAÇÃO EM E.coli INICIAÇÃO 1. Reconhecimento de sequências na origem da replicação por uma única proteína que se fixa sobre estas mesmas sequências 2. Abertura da dupla cadeia de DNA a nível da região rica em pares A=T, junto ou no seio da origem de replicação 3. Organização do complexo de replicação na região aberta do DNA

oric ORIGEM DE REPLICAÇÃO EM E.coli ARRANJO DAS SEQUÊNCIAS CONSERVADAS

REPLICAÇÃO EM E.coli INICIAÇÃO COMPLEXO DE INICIAÇÃO ORISSOMA Conjunto de proteínas que intervêm na etapa de iniciação Algumas proteínas ligam-se ao DNA, especificamente (DnaA) Outras participam no orissoma através do reconhecimento de proteínas já presentes (DnaB)

MODELO PARA INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO NA ORIGEM DE E.coli, oric

CONTROLO DA ETAPA DE INICIAÇÃO Permitir que a iniciação se faça no momento adequado do ciclo de divisão Impedir que o cromossoma se replique mais do que uma vez por cada ciclo Mecanismo de sequestração Metilação de OriC, nas sequências GATC, pela DNAadenina-metiltransferase (Dam-metilase) Após replicação, o DNA semi-metilado liga-se à membrana bacteriana, ficando as origens de replicação inacessíveis

METILAÇÃO DO DNA E INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO

REPLICAÇÃO EM E.coli REGULAÇÃO DA INICIAÇÃO

REPLICAÇÃO EM E.coli ELONGAÇÃO Síntese contínua da cadeia leading Síntese descontínua da cadeia lagging em fragmentos de Okazaki Coordenação da síntese das duas cadeias: - Ambas as cadeias são sintetizadas por uma única DNA polimerase assimétrica - O looping do DNA da cadeia lagging junta os dois pontos de polimerização

SÍNTESE DOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI

SÍNTESE SEMI-DESCONTÍNUA DO DNA PROBLEMA PRINCIPAL

SÍNTESE DE DNA NAS CADEIAS LEADING E LAGGING

CADEIA LAGGING - REMOÇÃO DE RNA PRIMER E SUBSTITUIÇÃO POR DNA

NICK TRANSLATION ACTIVIDADES 5 3 EXONUCLEÁSICA E POLIMERÁSICA DA DNA POLIMERASE I

MECANISMO DA REACÇÃO DE LIGAÇÃO DO DNA

REPLICAÇÃO EM E.coli TERMINAÇÃO

REPLICAÇÃO EM E.coli TERMINAÇÃO

REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS A replicação é um acontecimento muito mais raro nos eucariotas do que nos procariotas. A iniciação da replicação é fortemente regulada O DNA não se encontra nu na célula, mas sob a forma de cromatina. Esta encontra-se organizada sob a forma de nucleossomas. Nível superior de organização implica complexidade maior para a replicação

CONTROLO DA REPLICAÇÃO PELO CICLO CELULAR A síntese de DNA tem início, em muitas origens diferentes, durante a fase S A replicação produz uma única cópia de cada molécula. Bloqueio da iniciação da replicação até ao próximo ciclo celular A replicação do genoma inteiro deve estar concluída antes da passagem à fase G2

DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS α - 4 sub-unidades: 180 kda (actividade polimerásica), 60 kda + 50kDa (actividade primase) e 72 kda (?). Fracamente processiva, sem actividade exonucleásica 3 5 δ - 2 sub-unidades: 125 kda (actividade polimerásica e exonucleásica 3 5 ) e 50 kda (?). Moderadamente processiva quando só; elevada processividade quando associada ao PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) ε - enzima multimérico: 256-258 kda (actividade polimerásica e exonucleásica 3 5 ); o nº de outras sub-unidades varia em função da espécie; elevada processividade na ausência de PCNA

DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS γ - Actividade polimerásica e exonucleásica 3 5. Responsável pela replicação do DNA mitocondrial, processo autónomo sob o ponto de vista cronológico e enzimático β - enzima monomérico (40 kda); pouco processiva e sem actividade exonucleásica 3 5. Não parece ter papel na replicação mas intervém nos processos de reparação por excisão de bases erradas

HOMOTRÍMERO DE PCNA ESTRUTURA Notar a semelhança desta estrutura com com o dímero β 2 da DNA Polimerase III de E.coli

REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS INICIAÇÃO A replicação inicia-se em múltiplas origens. Porquê? O movimento da forquilha de replicação é ~20x mais lento nos eucariotas do que nos procariotas (50 nt/seg). A esta velocidade a replicação de um cromossoma humano de tamanho médio levaria 500 horas As origens de replicação ou sequências de replicação autónoma (Autonomously Replicating Sequence ou ARS) foram identificadas e estudadas na levedura. Existem cerca de 400 ARS no genoma da levedura

CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ARS Identificaram-se 400 ARS no genoma da levedura. A maioria, mas não a totalidade, constitui origens de replicação As origens encontram-se espaçadas a intervalos irregulares ao longo do cromossoma. O intervalo médio é cerca de 40 kb As ARS são constituídas por sequências conservadas: 5 (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(T/A) 3 O complexo de reconhecimento da origem (ORC), constituído por pelo menos 6 polipéptidos, liga-se àquelas sequências conservadas A ligação de ORC induz modificação conformacional no DNA, necessária para a replicação e transcrição

MECANISMO DE REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS Pol α Pol δ DNA ligase RNase H (remove RNA primers) Primase Helicase Pol δ PCNA RFC RPA = SSB Pol α / primase -síntesede RNA-DNA primers para iniciação da replicação; baixa processividade Pol δ / PCNA -funções complexas na replicação de ambas as cadeias; elevada processividade

REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR 5 3 3 5 Síntese da cadeia leading 5 3 3 5 + Replicação Cadeia filha completa 5 3 + Remoção do RNA primer 5 3 3 5 3 5 3 5 Síntese da cadeia lagging RNA Cadeia filha incompleta primer

REPLICAÇÃO NOS TELÓMEROS As extremidades dos cromossomas são estabilizadas pelos telómeros, requerendo uma transcriptase reversa para a sua replicação Os telómeros humanos consistem em 1000-1500 cópias de T x G y

OUTRAS PROTEÍNAS IMPLICADAS NA REPLICAÇÃO PROTEÍNAS COM ACTIVIDADE ENZIMÁTICA Topo-isomerase tipo I Topo-isomerase tipo II RNase H 3 DNA ligases DNA helicase PROTEÍNAS COM PAPEL ESTRUTURAL PCNA RFC RPA PROTEÍNAS MODULADORAS