CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL ALEXANDRE COELHO DE FIGUEIREDO

CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL ALEXANDRE COELHO DE FIGUEIREDO AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA ANESTESIA LOCAL COM VASOCONSTRITOR NOS TEMPOS DE CONGELAMENTO / DESCONGELAMENTO NA CRIOCIRURGIA DE ADENOMAS SEBÁCEOS EM CÃES (Canis familiaris) Niterói, RJ 2012

1 ALEXANDRE COELHO DE FIGUEIREDO AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA ANESTESIA LOCAL COM VASOCONSTRITOR NOS TEMPOS DE CONGELAMENTO / DESCONGELAMENTO NA CRIOCIRURGIA DE ADENOMAS SEBÁCEOS EM CÃES (Canis familiaris) Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração em Clínica e Reprodução Animal. Orientador: Prof.ª Dr.ª MARIA DE LOURDES GONÇALVES FERREIRA Co-Orientador: Prof.ª Dr.ª MARÍLIA BOTELHO DE OLIVEIRA CHAUDON Niterói, RJ 2012

2 ALEXANDRE COELHO DE FIGUEIREDO AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA ANESTESIA LOCAL COM VASOCONSTRITOR NOS TEMPOS DE CONGELAMENTO / DESCONGELAMENTO NA CRIOCIRURGIA DE ADENOMAS SEBÁCEOS EM CÃES (Canis familiaris) Aprovado em: / / Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração em Clínica e Reprodução Animal. BANCA EXAMINADORA Prof.ª Dr.ª MARIA DE LOURDES GONÇALVES FERREIRA Prof.ª Dr.ª VIVIANE ALEXANDRE NUNES DEGANI Prof.ª Dr.ª LUCI ANA FERNANDES MARTINS Niterói, RJ 2012

3 AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais, Antônio Mauricio de Figueiredo e Cecilia Maria Coelho de Figueiredo pelo exemplo que eles me dão diariamente, pela educação, pelos seus incentivos e apoio, pelos seus carinhos e atenção em todos os momentos, sempre pensando no meu bem. À minha esposa Iana Oliveira de Figueiredo, que está sempre ao meu lado, dando o seu amor, me apoiando, dividindo as minhas emoções e fazendo de mim um homem cada dia mais feliz e realizado. Ao meu irmão, Guilherme Coelho de Figueiredo, que sempre foi uma companhia muito importante, sendo um exemplo e um orgulho muito grande para mim. Aos meus familiares, em especial ao meu avô, José Coelho e a minha tia Helena Maria Coelho Franco, que já passaram por grandes dificuldades de saúde, mas que superaram e estão firmes e fortes, sempre com muita atenção e carinho comigo. À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira pelos seus ensinamentos, atenção, paciência e amizade, sendo parte fundamental por mais esta conquista. À Dr.ª Carmen Helena de Carvalho Vasconcellos por me apresentar à criocirurgia e despertar o meu interesse por oncologia veterinária ainda na minha graduação. À equipe do Setor de Cirurgia e Oncologia Veterinária do HUVET-UFF, que sem eles eu não teria conseguido atingir os meus objetivos no mestrado e me fizeram aprender o que é trabalho em grupo: Cristina Pliego, Carolina Leal, Letícia Castilho, Táya Oliveira, Tábata Maués, Carolina Israel, Isabel Guigon, Douglas Castro, Ricardo Vecchione e Raquel Sartori.

Aos professores Phillipe Bauer e João Marcelo pelos ensinamentos práticos e amizade ao longo dessa jornada. 4 Aos funcionários do HUVET-UFF, em especial ao Flávio, Karine, Lúcia e Mariane, que sempre me ajudaram quando precisei. Aos colegas que ajudaram no desenvolvimento prático deste estudo e foram muito importantes para a sua realização: Bernardo Nogueira, Beatriz Donda, Camila Martire, Fausto Saito, Carolina Guimarães, Ivan Silva e Carla Luz. Aos meus grandes amigos, sem os quais eu não teria muita história para contar, que sempre acreditaram em mim e na minha vontade de me tornar um Médico Veterinário. São eles: Walter Campos, Pablo Medina, Thiago Bujnowski, Marina Mendes, Ayla Carvalhaes, Érica Aquino e Isa Mendes.

5 Chegará o dia em que todo homem conhecerá o íntimo dos animais. Nesse dia, um crime contra um animal será considerado um crime contra a própria humanidade. Leonardo da Vinci

6 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS p. 8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES p. 9 LISTA DE TABELAS p. 10 RESUMO p. 11 ABSTRACT p. 12 1 INTRODUÇÃO p. 13 2 REVISÃO DE LITERATURA p. 15 2.1 DEFINIÇÃO E HISTÓRICO p. 15 2.2 CRIOBIOLOGIA p. 23 2.3 MECANISMOS DE MORTE CELULAR INDUZIDOS PELA CRIOCIRURGIA p. 23 2.3.1 Fase direta ou indireta p. 24 2.3.2 Fase indireta ou tardia p. 26 2.3.2.1 Fase Imunológica p. 27 2.4 AGENTES CRIÓGENOS p. 30 2.5 TÉCNICAS DE PREPARO, APLICAÇÃO E EQUIPAMENTOS p. 32 2.5.1 Preparação do paciente e anestesia p. 34 2.5.2 Instrumentação criocirúrgica e métodos de aplicação p. 35 2.6 MONITORAÇÃO DA TEMPERATURA p. 41 2.7 CICLO DE CONGELAMENTO / DESCONGELAMENTO p. 43 2.7.1 A velocidade de congelamento p. 43 2.7.2 A temperatura do tecido p. 44 2.7.3 O tempo de duração do congelamento p. 46 2.7.4 A velocidade de descongelamento p. 47 2.7.5 Repetição do ciclo de congelamento / descongelamento p. 48 2.7.6 O intervalo entre os ciclos de congelamento / descongelamento p. 49 2.8 INDICAÇÕES DA CRIOCIRURGIA p. 50

7 2.9 CONTRAINDICAÇÕES DA CRIOCIRURGIA p. 52 2.10 VANTAGENS E DESVANTAGENS DA CRIOCIRURGIA p. 53 2.11 TUMORES CUTÂNEOS p. 55 2.11.1 Adenomas sebáceos p. 57 2.12 ANESTESIA LOCAL p. 59 3 OBJETIVOS p. 61 4 MATERIAL E MÉTODOS p. 62 4.1 LOCAL DE REALIZAÇÃO p. 62 4.2 PACIENTES E AVALIAÇÃO CITOLÓGICA p. 62 4.2.1 Grupos p. 63 4.2.2 Critérios de inclusão e exclusão dos adenomas sebáceos p. 63 4.2.3 Avaliação dos pacientes pré-tratamento p. 64 4.2.4 Protocolo anestésico p. 64 4.2.5 Realização de biópsia p. 65 4.2.6 Aparelho de criocirurgia p. 65 4.3 CRIOCIRURGIA p. 67 4.4 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS p. 68 4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA p. 68 5 RESULTADOS p. 69 6 DISCUSSÃO p. 75 6.1 TÉCNICA CRIOCIRÚRGICA p. 76 7 CONCLUSÃO p. 82 8 OBRAS CITADAS p. 83 9 ANEXO p. 95

8 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS % por cento marca registrada 1ª primeira 1º primeiro 2ª segunda 2º segundo 3ª terceira CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais cm centímetro Co Companhia CV Coeficiente de Variação HUVET-UFF Hospital Universitário de Medicina Veterinária Professor Firmino Mársico Filho da Universidade Federal Fluminense kg quilograma mg miligrama ml mililitro mm milímetro nº número º graus ºC graus celsius PAAF punção aspirativa por agulha fina PAF punção por agulha fina ph Potencial Hidrogeniônico PROPPI Pró Reitoria de Pesquisa, Pós Graduação e Inovação

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Ilustração de três das técnicas de criocirurgia mais utilizadas em Medicina Veterinária: Zaragatoa, spray e sonda. Fonte: Andrews (2004). p. 36 Figura 2: Esquema adaptado de Graham e Barham (2003), das diferentes formas de aplicação do spray : direto; circular e pelo método de pincel. p. 37 Figura 3: Esquema adaptado de Andrews (2004) da formação da bola de gelo, a margem de cinco mm necessária para que o tratamento alcance a temperatura de - 50ºC em toda a lesão, inclusive de profundidade e a altura que a ponteira da pistola deve ficar em relação à lesão. p. 38 Figura 4: Microscopia eletrônica de eritrócitos (em preto) de coelho. (a) descongelado; (b) congelado até -30ºC com velocidade lenta de congelamento; (c) congelado até - 50ºC com velocidade moderada de congelamento; (d) congelado até -150ºC com velocidade de congelamento rápida. Observar a desidratação dos eritrócitos em (b) presença tanto de desidratação de eritrócitos quanto de gelo intracelular (c) e micro cristais de gelo dentro dos eritrócitos sem ocorrer desidratação (d). Fonte: Sun (2007). p. 44 Figura 5: Punch de mesmo modelo utilizado no estudo (A). Realização da biópsia com punch de quatro mm, logo antes da realização do primeiro ciclo de criocirurgia. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. p. 65 Figura 6: Aparelho de criocirurgia Tracker (A). Em (B), tela indicadora da temperatura atual (-37), com a temperatura mínima determinada pelo operador (Tmin = -43ºC) e o tempo em segundos (1) após ultrapassar o Tmin. Em (C, D e E) variações da cor do laser de acordo com a temperatura registrada. Fonte: www.cryac.com.br/produtos_tracker.html p. 66 Figura 7: Delimitador Cryoplate da Cry-Ac contendo quatro cones, com orifícios de 4, 6, 9 e 12 mm (A). Aplicação do Cryoplate durante um dos procedimentos criocirúrgicos deste estudo. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012 (B). p. 66 Figura 8: Sequência de fotos extraídas de uma das filmagens do período de congelamento direto. Observar a mudança nítida de coloração do laser. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. p. 67 Figura 9: Gráficos do tempo em segundos do congelamento direto dos adenomas sebáceos até a temperatura de -30ºC tanto no 1º e 2º ciclo dos grupos 1 e 2. HUVET- UFF, Niterói RJ, 2012. p. 71 Figura 10: Gráficos do tempo em segundos do descongelamento natural dos adenomas sebáceos até que a temperatura registrada ultrapassasse zero graus tanto no 1º e 2º ciclo dos grupos 1 e 2. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. p. 73

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Tamanho dos adenomas sebáceos em milímetros, de acordo com os grupos e seus respectivos pares. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. p. 69 Tabela 2: Temperatura dos adenomas sebáceos após a antissepsia e cinco minutos após o bloqueio anestésico de acordo com os grupos 1 e 2. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. p. 70 Tabela 3: Tempo em segundos do congelamento direto dos adenomas sebáceos até a temperatura de -30ºC tanto no 1º e 2º ciclo dos grupos 1 e 2. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. p. 71 Tabela 4: Tempo em segundos do descongelamento natural dos adenomas sebáceos até que a temperatura registrada ultrapassasse zero graus tanto no 1º e 2º ciclo dos grupos 1 e 2. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. p. 73

11 RESUMO FIGUEIREDO, A.C. Avaliação da influência da anestesia local com vasoconstritor nos tempos de congelamento / descongelamento na criocirurgia de adenomas sebáceos em cães (canis familiaris). 2012. 97 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Niterói - RJ, 2012. A técnica de criocirurgia ideal combina a realização de ciclos de congelamento rápido com descongelamento lento. Alguns autores sugerem que o uso da lidocaína com vasoconstritor (epinefrina) melhora a eficiência da técnica por promover vasoconstrição local. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência do bloqueio anestésico local de lidocaína com epinefrina e a influência da repetição de um segundo ciclo nos tempos de congelamento e descongelamento na criocirurgia de adenomas sebáceos em cães, utilizando a técnica de spray aberto. Foram selecionados nove cães portadores de mais de um adenoma sebáceo, num total de 34 lesões, com diâmetro entre 4,10mm e 9,00mm, e que foram distribuídos em dois grupos. A metodologia incluiu citologia préoperatória e biópsia transoperatória. Para a realização do procedimento, os animais receberam anestesia geral além do bloqueio anestésico no local dos adenomas sebáceos. A temperatura das lesões foi mensurada após a antissepsia da região e cinco minutos após o bloqueio anestésico local de acordo com os grupos. Nas lesões do grupo 1 e 2 foram utilizados bloqueios locais de lidocaína com e sem epinefrina, respectivamente. A temperatura dos adenomas sebáceos foi mensurada antes, durante e após os dois ciclos de congelamento / descongelamento e os seus tempos, respectivamente, cronometrados. Para a avaliação dos resultados obtidos foi utilizado o teste t de Student pelo método de comparação de pares (técnica de pareamento). Em relação ao tempo de congelamento direto, não houve diferença significativa quanto aos grupos e entre seus ciclos. Entretanto, o tempo de congelamento direto foi significativamente maior (p<0,05) no primeiro ciclo em relação ao segundo ciclo do grupo 1. O tempo de descongelamento natural do grupo 1 foi significativamente maior (p<0,05) do que o grupo 2 e também foi maior no segundo ciclo em relação ao primeiro, nos dois grupos. Pode-se concluir que o uso de lidocaína com epinefrina em anestesia local nos pacientes submetidos à criocirurgia de adenomas sebáceos e a repetição de um segundo ciclo aumentam o tempo de descongelamento, o que melhora a eficiência da técnica, resultando em maior morte celular. Palavras chaves: crioterapia, bloqueio local, epinefrina, neoplasias, caninos.

12 ABSTRACT FIGUEIREDO, A.C. Evaluation of the influence of local anesthesia with vasoconstrictor in times of freezing / thawing in cryosurgery of sebaceous adenomas in dogs (canis familiaris). 2012. 97 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Niterói - RJ, 2012. The ideal technique of cryosurgery combines cycles of rapid freezing with slow thawing. Some authors suggest that the use of lidocaine with vasoconstrictor (epinephrine) improves the efficiency of the technique by promoting local vasoconstriction. This study aimed to evaluate the influence of local anesthetic blockade of lidocaine with epinephrine and the influence of repetition of a second cycle in the times of freezing and thawing in cryosurgery of sebaceous adenomas in dogs using open spray technique. Nine dogs with more than one sebaceous adenoma were selected, performing a total of 34 lesions with diameters between 4.10mm and 9.00mm, and were divided into two groups. The methodology included preoperative cytology and transoperative biopsy. For the procedure, the animals received general anesthesia besides the anesthetic blockade at the site of sebaceous adenomas. The temperature of the lesions was taken after the asepsis of the region and five minutes after the local anesthetic blockades according to groups. In the lesions of group 1 and 2 were used local blocks with lidocaine with and without epinephrine, respectively. The temperature of the sebaceous adenomas was taken before, during and after the two cycles of freeze / thaw and their times, respectively timed. To evaluate the results we used the Student test t by the method of comparison of pairs (pairing technique). Regarding the direct freezing time, there was no significant difference between the groups and their cycles. However, the direct freezing time was significantly higher (p <0.05) in the first cycle relative to the second cycle of group 1. The natural thawing time in group 1 was significantly higher (p <0.05) than in group 2 and was also higher in the second cycle compared to the first cycle, in both groups. It can be concluded that the use of lidocaine with epinephrine of a local anesthetic of patients undergoing cryosurgery of sebaceous adenoma and the repetition of a second cycle increase defrost time, which improves the efficiency of the technique, resulting in increased cell death. Keywords: cryotherapy, local blockade, epinephrine, neoplasms, canines.

13 1 INTRODUÇÃO A cirurgia é uma das medidas mais eficazes de tratamento para a maioria das neoplasias sólidas nos animais, e geralmente, oferece as melhores chances de cura de tais tumores. Dentre os objetivos da cirurgia oncológica, encontram-se: o diagnóstico, a cura, a paliativa e a preventiva (MORRIS e DOBSON, 2007a; WITHROW, 2007b; DALECK e RODASKI, 2009). Criocirurgia é a utilização controlada de temperaturas extremamente baixas para a destruição de tecidos indesejados (KOKOZKA e SCHEINFELD, 2003; WITHROW, 2007a; YIU et al., 2007; HOLMBERG, 2007; EURIDES et al., 2009; SABEL, 2009; GAGE; BAUST e BAUST, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). A criocirurgia contra o câncer começou na Inglaterra entre 1845 e 1851, quando James Arnott, usou uma aplicação local de solução salina contendo gelo picado para tratar cânceres avançados em locais acessíveis, como a mama e a cervix uterina (GAGE, 1998; GLORIA e GRAHAM, 2001; BAUST et al., 2004; THEODORESCU, 2004; YIU et al., 2007; ERINJERI e CLARK, 2010). A moderna criocirurgia evoluiu há aproximadamente 50 anos, quando Irving Cooper, um neurocirurgião e Arnold Lee, um engenheiro, criaram em 1961 um aparelho capaz de acondicionar e direcionar, por meio de sondas, quantidades controladas de nitrogênio líquido para tal fim. A partir deste momento a criocirurgia alcançou um novo patamar e outras possibilidades de tratamento surgiram (BAUST e GAGE, 2004; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; YIU et al., 2007; EURIDES et al., 2009; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009). A criocirurgia chegou a ser abandonada nas décadas de 70 e 80 nos EUA, mas têm ressurgido. Isto se deve ao surgimento de novas técnicas e equipamentos,

14 possibilitando que a criocirurgia se tornasse uma importante opção no tratamento de neoplasias, benignas e malignas, de diferentes órgãos (tais como próstata, fígado, rins, pâncreas e mamas) e sistemas (ósseo e neurológico). O grande desenvolvimento tecnológico permitiu este maior número de indicações, além de melhores resultados com o uso desta técnica (SANDISON et al., 1998; DANIEL et al., 1999; LEE JR. et al., 1999; TACKE et al., 1999; SILVERMAN et al., 2000; WEI et al., 2002; BUTTS et al., 2003; MALA et al., 2003; TRAORÉ et al., 2003; FOURNIAL et al., 2004; WITHROW, 2007a; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Dentre as vantagens da criocirurgia como uma alternativa à intervenção cirúrgica, é considerado um tratamento relativamente rápido, de fácil aplicação, baixo custo de manutenção e segura, pois é possível ser realizada apenas com uma sedação e bloqueio anestésico local. Holmberg (2007) sugere que a utilização de lidocaína com epinefrina na anestesia local não só ajuda a eliminar a dor do tratamento, como também facilitaria um ciclo de congelamento rápido / descongelamento lento por produzir vasoconstrição local. Já quando há necessidade de anestesia geral, esta é mais breve, sendo uma grande vantagem nos casos de animais idosos. Além disso, promove menor invasão, menor morbidade e a possibilidade de uma resposta imunológica contra alguns tipos de câncer (HOFFMANN e BISCHOF, 2002; WITHROW, 2007a; YIU et al., 2007; GAGE, BAUST e BAUST, 2009; SABEL, 2009; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009; NISHIDA et al., 2011). Por estes motivos seu uso tem crescido bastante, tanto em Medicina Humana, quanto em Medicina Veterinária.

15 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 DEFINIÇÃO E HISTÓRICO Criocirurgia é a utilização controlada de temperaturas extremamente baixas para a destruição de tecidos indesejados (KOKOZKA e SCHEINFELD, 2003; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; YIU et al., 2007; EURIDES et al., 2009; GAGE; BAUST e BAUST, 2009; SABEL, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). Goldberg e colaboradores (2009) definem que o termo criocirurgia poderia ser usado para descrever todos os métodos de destruição de tecidos, por congelamento, pela aplicação de temperaturas baixas. Utilizado como sinônimo por alguns autores brasileiros (LUCAS, 1999; LUCAS e LARSSON, 2002), o termo crioterapia é uma alternativa cabível, visto que já foi usado há vários anos para descrever esses métodos, e pode ser útil para a realização de pesquisa literária deste assunto (GOLDBERG et al., 2009). Porém, nos Estados Unidos, convencionou-se que este termo seria utilizado para os procedimentos em que não há destruição dos tecidos, como na acne, alopecia areata e peeling superficial (KUFLIK e GAGE, 1997; MORAIS, VELHO e MAGALHÃES, 2008). Outro termo utilizado nesse meio é a crioablação, que nada mais é do que a criocirurgia utilizada percutaneamente guiada por exames de imagem (TATLI et al. 2010), e que também pode ser utilizada cirurgicamente em laparotomias ou laparoscopias (ERINJERI e CLARK, 2010). É bastante estudada e utilizada principalmente no tratamento do câncer de próstata, assim como em rins e fígado. Na realização da criocirurgia, ocorre o processo de congelamento seguido do descongelamento, que é chamado de ciclo. Dependendo da indicação, podem ser

16 realizados até três ciclos de congelamento / descongelamento no mesmo procedimento (WITHROW, 2007a). A criocirurgia contra o câncer começou na Inglaterra entre 1845 e 1851, quando James Arnott, usou uma aplicação local de solução salina contendo gelo picado para tratar cânceres avançados em locais acessíveis, como a mama e a cervix uterina. Apesar de seu objetivo inicial ter sido a anestesia, ele notou os efeitos que a baixa temperatura causava na viabilidade das células cancerígenas. Esta solução alcançava temperaturas de -18ºC até -24ºC e foram adequadas para congelar tumores, com resultados de diminuição de tamanho, diminuição de secreções e melhoria da dor. Entretanto, esta temperatura limitou a sua aplicabilidade clínica (GAGE, 1998, KUFLIK et al., 2000; COOPER e DAWBER, 2001; GLORIA e GRAHAM, 2001; BAUST et al., 2004; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; LUCAS, 2004; QUEIROZ, 2004; THEODORESCU, 2004; YIU et al., 2007; EURIDES et al., 2009; SABEL, 2009; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). Hoje em dia, James Arnott é conhecido como o pioneiro na utilização da anestesia pelo frio (GAGE, 1998). No final do século XVII, cientistas observaram que os gases atmosféricos aquecem quando comprimidos e esfriam quando expandidos (GAGE, 1998; KUFLIK et al., 2000). Utilizando este princípio, em 1877, foi desenvolvido um sistema de expansão isotérmico para o resfriamento de gases atmosféricos, que permitiu a liquefação do oxigênio, hidrogênio e nitrogênio. Em 1892, James Dewar desenvolveu o primeiro compartimento a vácuo para facilitar o armazenamento dos gases liquefeitos. A partir daí o termo criógeno começou a ser utilizado e pelo final do século XIX, tanto o ar líquido, quanto o dióxido de carbono estavam disponíveis para uso terapêutico em tumorações malignas locais (GAGE, 1998, KUFLIK et al., 2000; COOPER e DAWBER, 2001; THEODORESCU, 2004; YIU et al., 2007; SABEL, 2009). O primeiro uso clínico da criocirurgia em doenças de pele foi reportado por Campbell White nos Estados Unidos em 1899. Ele obteve ar líquido com o professor Charles Tripler e aplicou tanto com um swab, spray ou compartimento de vidro preenchido de ar líquido no alvo de lesões de pele, incluindo epiteliomas iniciais. Infelizmente, ar líquido não era facilmente acessível e não surgiram outros relatos

17 disponíveis desse pesquisador (GAGE, 1998; KUFLIK et al., 2000; GLORIA e GRAHAM, 2001; YIU et al., 2007; MORAIS, VELHO e MAGALHÃES, 2008). Em 1907, Whitehouse utilizou ar líquido em diversas lesões de pele, incluindo nevus pigmentados, lúpus e epitelioma. Ele tratou 15 casos de câncer de pele (com menos de dois cm de diâmetro) e de face com bons resultados, utilizando a técnica de spray e de swab. Neste mesmo ano, Willian Pusey introduziu o uso clínico do dióxido de carbono solidificado (-78.5 ºC), sugerindo que o ar líquido era mais difícil de ser obtido e armazenado. Ele tratou verrugas, nevus vasculares, lúpus eritematoso, lúpus vulgaris e epiteliomas, mas não achava que a criocirurgia era a melhor escolha de tratamento para os casos de epiteliomas (GAGE, 1998; KUFLIK et al., 2000; GLORIA e GRAHAM, 2001; GRAHAM e BARHAM, 2003). O oxigênio líquido (-182.9 ºC) foi utilizado pela primeira vez como criógeno em 1920 para o uso clínico. Irving e Turnacliff (1929) descreveram bons resultados no tratamento de verrugas e outras doenças de pele. Entretanto, nos anos seguintes, o oxigênio líquido tornou-se perigoso devido ao fato dele ser inflamável e gerar possíveis explosões, não conseguindo competir com o dióxido de carbono (GAGE, 1998; KUFLIK et al., 2000). Entre 1936 e 1940, o neurocirurgião chamado Temple Fay, usou técnicas locais e gerais de refrigeração para tratar cânceres grandes e inoperáveis da cervix uterina e da mama, com irrigação de soluções frias resfriadas e aplicações de porções de gelo. Ele ainda usou cápsulas de metal implantadas conectadas a um sistema externo de irrigação fria em tumores do cérebro. Assim como James Arnott descreveu 90 anos mais cedo, o resultado foi redução no tamanho do tumor e amenização dos sintomas da dor (GAGE, 1998; THEODORESCU, 2004; YIU et al., 2007). Após a segunda guerra mundial, o nitrogênio líquido (-196 ºC) tornou-se disponível comercialmente. Em 1950 Allington introduziu este criógeno na prática clínica pela utilização de swabs mergulhados em nitrogênio líquido para tratar uma variedade de doenças não neoplásicas e neoplásicas de pele, como verrugas, queratoses, leucoplaquias, hemangiomas e quelóides. Entretanto, o uso de nitrogênio líquido e dióxido de carbono ainda estavam limitados aos seus tipos de sistemas dispersores, e ofereciam pouca penetração e volume de destruição tecidual (GAGE,

18 1998; KUFLIK et al., 2000; THEODORESCU, 2004; YIU et al., 2007; MORAIS, VELHO e MAGALHÃES, 2008). Finalmente, em 1961 o médico neurocirurgião Irving Cooper juntamente com o engenheiro Arnold Lee, com o intuito de tratar pacientes com doença de Parkinson, desenvolveram uma sonda difusora de criógeno, capaz de produzir lesão criogênica localizada no cérebro. A partir daí, deu-se início a chamada moderna criocirurgia, atualmente conhecida como 1ª geração. (GAGE, 1998; KUFLIK et al., 2000; COOPER e DAWBER, 2001; HAN e BELLDEGRUN, 2003; GRAHAM e BARHAM, 2003; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; LUCAS, 2004; THEODORESCU, 2004; YIU et al., 2007; GAGE e BAUST, 2007; MORAIS, VELHO e MAGALHÃES, 2008; EURIDES et al., 2009; SABEL, 2009; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009; TATLI et al. 2010). O princípio utilizado com o auxílio do aparelho desenvolvido por Cooper e Lee, serviu de protótipo para inúmeros equipamentos empregados até os dias de hoje (COOPER e DAWBER, 2001; LUCAS, 2004). Trabalhando em conjunto com engenheiros, principalmente George Garamy em 1964 e 1965, Douglas Torre desenvolveu um equipamento que lançava o nitrogênio líquido em forma de spray que ainda poderia ser utilizado juntamente com ponteiras crioterápicas de vários tamanhos e formas, convertendo as linhas de condutividade para um sistema fechado. Deste modo, usado para lesões benignas, vários tipos de carcinomas, basal e de células escamosas, tornaram-se sensíveis ao manejo criocirúrgico (KUFLIK et al., 2000). Em 1967, Setrag Zacarian descreveu um dispositivo similar que era efetivo, mas tornou-se pouco usado devido ao seu tamanho, portabilidade e longas linhas de condutividade (KUFLIK et al., 2000). No ano seguinte, desenvolveu juntamente com o engenheiro Bryne (Brymill Co), o primeiro aparelho de criocirurgia comercialmente viável e que depois daria origem ao Cry-Ac (KUFLIK et al., 2000; COOPER e DAWBER, 2001; GLORIA e GRAHAM, 2001; GRAHAM e BARHAM, 2003; LUCAS, 2004; EURIDES et al., 2009). Nesse mesmo período, estudos clínicos e em animais já demonstravam várias possibilidades de benefícios pelo congelamento, encontrando aplicação em ginecologia, neurologia, proctologia e ortopedia, dentre outras (LUCAS, 2004; YIU et al., 2007). Inclusive nesta época, em 1967, Yantorno e colaboradores chamaram atenção, pela primeira vez, para a produção de anticorpos contra tecidos do

19 sistema reprodutivo de coelhos pós-criocirurgia (YIU et al., 2007; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009). Hoje essa resposta é conhecida como crio-imunologia e seus efeitos são o alvo de inúmeros estudos atualmente na criocirurgia. Em 1965, Andrew Gage, um cirurgião, e colaboradores relataram a eficácia da criocirurgia em cânceres orais, além do tratamento de cânceres inoperáveis do reto em 1968 e juntamente com Riley e Fazekas (1965), o congelamento de veias e ductos biliares sem excisão. Ele foi o responsável pela organização da Sociedade de Criocirurgia do Colégio Americano de Criocirurgia (KUFLIK et al., 2000). A partir daí Gage continuou com essa linha de pesquisa até os dias de hoje e é uma referência no assunto. A década de 70 foi marcada pela reavaliação na utilização da criocirurgia e algumas das suas utilizações caíram em desuso. Uma delas foi na aplicabilidade dos cânceres de próstata, pois os cateteres prolongados geravam um alto índice de complicações, como por exemplo, as fístulas retais. O surgimento da resecção transureteral para os casos de doenças benignas prostáticas também favoreceu para o desuso da criocirurgia nesta área (THEODORESCU, 2004). Entretanto, outros motivos para essa queda principalmente no início da década de 1980, foi o uso sem o controle deste procedimento, o que gerou com frequência diversas complicações, mormente quando aplicado em lesões de grandes dimensões ou em órgãos internos (HAN e BELLDEGRUN, 2003; LUCAS, 2004; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004). Em 1981, Myers e Donovan publicaram um artigo que utilizava a lidocaína associada com epinefrina na anestesia local cutânea em suínos, com o objetivo de avaliar o seu efeito no tamanho das lesões produzidas pela criocirurgia em comparação àquelas produzidas quando se utilizava apenas solução salina ou apenas lidocaína. A análise histopatológica realizada após uma semana do procedimento evidenciou uma área maior de tecido necrótico (até 47% maior) nas áreas da anestesia local de lidocaína com epinefrina em relação às áreas sem lidocaína e com solução salina. Eles sugeriram que a epinefrina diminui a perfusão tecidual e retardaria o descongelamento da periferia da lesão aumentando a eficiência da criocirurgia. A maioria dos estudos continuou principalmente na área da urologia. O interesse na criocirurgia para o câncer de próstata persistiu devido aos benefícios potenciais,

20 incluindo possivelmente uma resposta imunológica favorável, assim como a remissão de metástases após o tratamento do tumor primário (THEODORESCU, 2004). No final da década de 80 e na década de 90, com o desenvolvimento de técnicas de imagem, como a ultrassonografia (ultrassom transretal), tomografia computadorizada e ressonância magnética e avanços de modelos matemáticos houve o ressurgimento da criocirurgia, atualmente referida como a 2ª geração. Aperfeiçoamento nos equipamentos criocirúrgicos e acessórios acompanharam essa evolução, possibilitando a melhora na precisão da técnica e minimizando as complicações (HAN e BELLDEGRUN, 2003; LUCAS, 2004; THEODORESCU, 2004; GAGE e BAUST, 2007). Além disso, o desenvolvimento de endoscópios e equipamento para acessos percutâneos estimularam o uso da criocirurgia em doenças de vísceras e principalmente tumores intracavitários (GAGE e BAUST, 2007). A 3ª geração da criocirurgia ocorre a partir de 2000, quando as invenções de máquinas mais modernas possibilitaram comprimir o gás argônio (-185.7 ºC) e pelo uso do efeito Joule-Thomson (quando um gás passa sobre pressão por um orifício pequeno e posteriormente se expande, a temperatura cai bruscamente), o que permitiu o uso de sondas de menor diâmetro, em comparação com aquelas que utilizavam o nitrogênio líquido para criocirurgias percutâneas (HAN e BELLDEGRUN, 2003; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; THEODORESCU, 2004; GAGE e BAUST, 2007; TATLI et al., 2010). Os equipamentos disponíveis atualmente oferecem vantagens potenciais comparados àqueles previamente desenvolvidos. Apesar dessas novas máquinas também utilizarem o efeito Joule-Thomson do gás argônio para o congelamento, elas também utilizam o gás hélio para o reverso do efeito Joule-Thomson, ou seja, para o aquecimento das sondas, o que acelera o tratamento e segurança da técnica (THEODORESCU, 2004; GAGE e BAUST, 2007). A crioablação percutânea tem se mostrado segura e efetiva no tratamento de tumores do rim, fígado, próstata, mama, cânceres intramusculares e fibroses uterinas (TATLI et al., 2010).

21 2.1.1 Criocirurgia na Medicina Veterinária A criocirurgia é uma técnica bastante difundida na Medicina Humana, sobretudo na especialidade dermatológica, onde há inúmeros relatos caracterizando sua aplicabilidade e indicações. Entretanto, na Medicina Veterinária, comparando os relatos do emprego da criocirurgia com aqueles da Medicina Humana pôde-se verificar que até meados deste século raros eram os trabalhos relativos ao emprego de agentes criógenos em lesões evidenciadas em animais (LUCAS e LARSSON, 2006). Borthwich e Lane por volta da década de 70 na Inglaterra foram os primeiros autores a descreverem a aplicação prática da criocirurgia veterinária como tratamento de uma variedade de afecções (GOLOUBEFF e OLIVEIRA, 1999; LUCAS e LARSSON, 2002; QUEIROZ, 2004). Em 1975, Farrell tratou pela primeira vez um caso de sarcóide equino utilizando gelo seco e em 1978, quando queria testar a efetividade do frio no controle da dor em cães, utilizando um fragmento de gelo seco recoberto por bandagens, observou despigmentação pilar local. Como histologicamente os folículos continuavam intactos, esse autor propôs o termo: criocirurgia homocelular, que ficou, posteriormente, internacionalmente conhecido por sua aplicação na identificação de animais (KUFLIK et al., 2000; LUCAS, 2004; EURIDES et al., 2009). Em 1981, após uma década do começo da utilização da criocirurgia Veterinária para fins terapêuticos, ocorreu um encontro no Colégio Americano de Criocirurgia em Arlington, Virginia (EUA), onde foram apresentados alguns trabalhos realizados até então. Desta forma, este encontro pode proporcionar diretrizes para aplicações aceitáveis da criocirurgia e promover observações preliminares para serem avaliadas clinicamente. Muitos dos artigos foram baseados em estudos experimentais controlados e descreveram os resultados da aplicação clínica da criocirurgia em comparação às modalidades de tratamento convencionais. Naquele tempo, a criocirurgia ganhou aceitação ampla em todas as áreas da prática Veterinária (FARRIS e VESTRE, 1982). No Brasil, a criocirurgia Veterinária começou a ser utilizada por Lucas e Larsson a partir de 1992. Estes autores fizeram um estudo entre 1992 e 1998, no qual avaliaram a praticabilidade, exequibilidade e efetividade da técnica em dermatoses de caninos,

22 quando trataram 50 animais, com um total de 254 lesões. Utilizaram o aparelho Cry- Ac 3 com a técnica de spray ou sondas. A maioria dos tratamentos (95,3%) alcançou resultados excelentes com remissão total e em 90% dos animais obteve-se a cura. Levando-se em conta que 86% dos animais tratados apresentavam-se originalmente com neoplasias (LUCAS e LARSSON, 2002). Estes mesmos autores, num período semelhante, de 1992 até 2001, trataram 50 felinos portadores de carcinoma espinocelular com criocirurgia, utilizando o mesmo aparelho e técnicas. Obtiveram 72% de involução plena e desaparecimento das lesões, concluindo que a criocirurgia pode ser empregada em lesões de prognóstico bem reservado, em animais de distintas faixas etárias, consistindo em uma técnica alternativa exequível, prática e efetiva (LUCAS e LARSSON, 2006). Lucas (2004) utilizou a tomografia computadorizada e o microscópio anatomopatológico para correlacionar as medidas do raio e profundidade de congelamento e a profundidade da crionecrose, respectivamente, no congelamento cutâneo de cães sadios. Avaliou quatro técnicas de congelamento, sendo elas: sonda fechada, derramamento e spray (com distintos tempos de congelamento). Com isso, elaborou um modelo matemático para cada técnica, podendo-se assim obter a medida necessária do diâmetro do congelamento, pré determinando-se a profundidade da necrose pretendida, pelas diferentes técnicas de aplicação do nitrogênio líquido. Além disso, concluiu que os métodos mais eficientes são o do derramamento e do spray com maior tempo de aplicação (135 segundos), pois oferecem a maior relação profundidade de necrose e o diâmetro de congelamento. Também em 2004, Queiroz avaliou a eficácia da criocirurgia no tratamento de tumores em pele e/ou partes moles de cães e gatos, e obteve 82,5% de remissão total em 40 animais tratados e em relação às lesões, 85,96% apresentaram remissão total. Desta forma, pode concluir que a criocirurgia foi eficaz no tratamento de neoplasias de pele e/ou partes moles de cães e gatos. Além disso, enfatizou que a eficácia da criocirurgia está relacionada ao tempo de congelamento / descongelamento bem como ao número de ciclos aplicados. Silva (2007) avaliou a relação da epinefrina na anestesia local em cães, submetidos à criocirurgia cutânea. Utilizou apenas um ciclo de congelamento de 60

23 segundos e realizou bloqueios locais com lidocaína com e sem epinefrina. Neste estudo não foram observadas diferenças significativas entre as alterações histológicas encontradas em cada tratamento, não havendo grande variação na reação tecidual que pudesse corroborar com a diferença encontrada por Myers e Donovan em 1981. A criocirurgia Veterinária no Brasil atualmente está bastante difundida, apesar de ainda existirem poucos trabalhos importantes relacionados nesta área. 2.2 CRIOBIOLOGIA Os cientistas da criobiologia começaram com estudos na criopreservação, experimentos e trabalhos clínicos em pacientes com lesões causadas pelo frio. Subsequentemente, Cooper concluiu que uma temperatura de -20ºC mantida por um minuto causaria necrose tecidual. Durante os anos de 1960 e 1970, a importância de um rápido congelamento, descongelamento lento e a repetição do ciclo de congelamento / descongelamento foram reconhecidos como importantes no estudo da lesão causada pela criocirurgia (THEODORESCU, 2004). Em geral, a maioria das células dos mamíferos pode resistir fracamente às temperaturas não congelantes. Entretanto, essas condições podem afetar diversos aspectos das funções celulares. A membrana celular é uma estrutura que possui uma bicamada lipídica com proteínas que se estendem através dela. A membrana celular, em geral, é impermeável, exceto quando as proteínas de membrana permitem ocorrer transferência de massas. Em temperaturas baixas, o lipídio passa a um estado de gel, ou numa estrutura com energia livre baixa. Durante este processo, as proteínas da membrana se separam e perdem a capacidade de controlar a transferência de massas. A membrana torna-se mais permeável e permite que os íons passem para dentro e para fora das células mais facilmente. Como resultado, a composição iônica celular se altera e os danos ocorrem (GAGE e BAUST, 1998; YIU et al., 2007).

24 2.3 MECANISMOS DE MORTE CELULAR INDUZIDOS PELA CRIOCIRURGIA A maioria dos autores classifica a destruição de tecidos por congelamento como direta (ou imediata) ou indireta (ou tardia) (LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; LUCAS, 2004; QUEIROZ e MATERA, 2004; SKANES et al., 2004; THEODORESCU, 2004; BAUST e GAGE, 2005; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; YIU et al., 2007; GAGE, BAUST e BAUST, 2009; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). Trabalhos mais recentes começam a levar em consideração o efeito da crioimunologia causando a morte celular por estimulação do sistema imune contra as células tumorais, mas ainda há opiniões diversas a respeito desse mecanismo (SABEL, 2009; NISHIDA et al., 2011). Por este motivo, este assunto será tratado aqui dentro da fase indireta. Lucas (2004) e Eurides e colaboradores (2009), chegam a considerar três fases: imediata, retardada (que equivale à fase indireta) e tardia (relacionada à fase imunologia). De acordo com Kuflik (1994), a ação do gelo nos tecidos está relacionada aos efeitos diretos nas células e na estase vascular que se desenvolve após o descongelamento. Esta ação depende de diversos fatores: quantidade de calor perdida pelo tecido, da taxa de reaquecimento, da concentração de solutos, do tempo de exposição das células à variação de temperatura e as temperaturas mais baixas no tecido alvo. A maioria dos trabalhos que estudam os mecanismos de morte celular pelo frio tem sido diretamente em células e tecidos in vitro, porque a remoção das células do hospedeiro elimina todos os outros tipos de lesões indiretas (por exemplo, vascular e imunológica). A evidência de que o congelamento causa a morte celular é bem aceita, e as pesquisas com criocirurgia foram amplamente baseadas em se maximizar a morte celular in vitro. Devido ao fato de eventos similares ocorrerem, sem dúvida, esta forma de dano também ocorre in vivo (HOFFMANN e BISCHOF, 2002).

25 2.3.1 Fase direta ou imediata Esta fase ocorre durante o ciclo de congelamento ou imediatamente após o descongelamento (LUCAS, 2004). Desta forma, ocorrem duas mudanças biofísicas na água no interior das células durante o congelamento que estão relacionadas com os danos celulares (HOFFMANN e BISCHOF, 2002). Durante o processo de congelamento ocorre a formação de cristais de gelo intracelular e extracelular, que vão depender principalmente da velocidade e da temperatura mínima atingida no congelamento dos tecidos. Quando o congelamento se fizer de forma lenta haverá a formação de grandes cristais de gelo no meio extracelular, o que altera o gradiente osmótico, fazendo com que a água no interior das células passe do meio intra para o meio extracelular, levando a um estado hiperosmolar, devido a desidratação da mesma. Desta forma, ocorre um aumento da concentração de eletrólitos no meio intracelular, o que por si só já é tóxico para a célula e acarreta num dano irreversível. A agressão a organelas intracelulares e a membranas lipoproteicas interfere na homeostase celular, levando a incapacidade da célula de regular a entrada e saída de íons e consequente alterações no ph nas macromoléculas. Este mecanismo é observado na periferia da região congelada, na transição entre o tecido congelado e o tecido normotérmico, onde a cristalização da água ocorre de maneira mais lenta. Nesta região a temperatura se encontra entre 0ºC e -20ºC (MULDREW e MCGANN, 1990; GRAHAM e BARHAM, 2003; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; LUCAS, 2004; QUEIROZ e MATERA, 2004; SKANES et al., 2004; THEODORESCU, 2004; BAUST e GAGE, 2005; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; YIU et al., 2007; EURIDES et al., 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). Um congelamento rápido à temperatura baixa (menor que -40ºC) resulta numa maior quantidade de pequenos cristais intracelulares, pois a célula não é capaz de perder água para o meio externo, na tentativa de manter o equilíbrio. Estes pequenos cristais são mais prejudiciais, pois podem vir a romper tanto a membrana quanto as organelas intracelulares, o que leva a morte imediata da célula. Este rompimento ocorrerá à medida que vai havendo o descongelamento lento da célula. É neste instante que ocorre o fenômeno da recristalização, quando os pequenos cristais se

26 unem, formando grandes cristais e estes sim, vão levar a ruptura de membranas e organelas (MULDREW e MCGANN, 1990; GRAHAM e BARHAM, 2003; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; LUCAS, 2004; QUEIROZ e MATERA, 2004; SKANES et al., 2004; THEODORESCU, 2004; BAUST e GAGE, 2005; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; YIU et al., 2007; EURIDES et al., 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). Recentes investigações in vitro têm identificado a apoptose, ou gene regulador de morte celular, como um mecanismo de dano direto à célula. Células em apoptose são encontradas cerca de oito a doze horas após o congelamento, principalmente na periferia da lesão criogênica, onde a temperatura não foi suficientemente baixa para matar todas as células. O processo de apoptose aumenta progressivamente no período de duas a oito horas após o congelamento. Na periferia da lesão, algumas células vão morrer e outras vão sobreviver. Algumas células ainda sobrevivem por alguns dias e depois morrem, com sinais de apoptose. Em dois experimentos in vivo, onde foram transplantados adenocarcinomas de pulmão em ratos, Forest e colaboradores em 2005 e 2006, e Wen e colaboradores em 2007, notaram células em processo de apoptose após oito a 16 horas do congelamento na periferia da lesão. Pensa-se que a alteração apoptótica é causada pelo dano mitocondrial devido ao aumento da expressão da proteína bax e ativação da caspase. Estes experimentos in vivo confirmaram a importância da apoptose como um mecanismo de morte celular após a criocirurgia, especialmente na periferia da lesão do tecido previamente congelado e ao mesmo tempo mostra a ligação entre os estudo in vitro e in vivo (GAGE, BAUST e BAUST, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). 2.3.2 Fase indireta ou tardia Esta fase acarretada pela estase vascular ocorre algumas horas após o final do ciclo de congelamento / descongelamento (LUCAS, 2004). Recentemente na moderna criocirurgia, muitos estudos experimentais com diversos tecidos mostraram a sequência de eventos que se seguiam após o congelamento e descongelamento e que resultavam em falha na circulação. Quando o

27 tecido descongela, este se torna congesto e edematoso, e se estende por algumas horas. A causa do edema é devido aos danos às células endoteliais que se manifesta como defeitos nas junções destas células a partir do descongelamento até duas horas após este, resultando em aumento de permeabilidade capilar, edema, agregação plaquetária e, finalmente, trombose. A perda de suporte sanguíneo resulta em necrose exceto na periferia do tecido previamente congelado, onde a temperatura do tecido está na faixa de 0 a -20ºC (MULDREW e MCGANN, 1990; GRAHAM e BARHAM, 2003; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; LUCAS, 2004; QUEIROZ e MATERA, 2004; SKANES et al., 2004; THEODORESCU, 2004; BAUST E GAGE, 2005; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; YIU et al., 2007; EURIDES et al., 2009; GAGE, BAUST e BAUST, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). Outra possibilidade de causa de morte celular induzida pelo frio é a formação de radicais livres durante a isquemia e o descongelamento. O primeiro mecanismo seria que a cadeia transportadora de elétrons do interior da membrana das mitocôndrias poderia reduzir durante a isquemia, levando a formação de radicais de oxigênio. A segunda possível fonte de radicais é a da peroxidação dos lipídios de membrana durante a isquemia, levado por um aumento da produção do ácido graxo e do ácido aracdônico. No descongelamento, o fluxo sanguíneo retorna e o ácido aracdônico acumulado é metabolizado pela via da lipoxigenase e cicloxigenase, levando ao aumento da formação de tromboxano e superóxidos. Outro mecanismo proposto é a produção de radicais de oxigênio pelo metabolismo da hipoxantina, pela via da xantina oxidase durante o descongelamento. As células endoteliais são as principais fontes de xantina oxidase nos vasos sanguíneos, implicando na importância da interação das células endoteliais com os radicais livres durante o congelamento e o descongelamento. A teoria dos radicais livres é controversa porque existem relatos que falham em demonstrar estas conclusões (YIU et al., 2007). 2.3.2.1 Fase imunológica A fase imunológica tem sido revelada como outra possível vantagem da criocirurgia. O fato de se congelar o tumor e deixá-lo no animal, sem ser feito excisão

28 cirúrgica posterior, levaria o organismo a criar uma resposta imunológica contra os antígenos específicos do tumor no tecido congelado (GRAHAM e BARHAM, 2003; EURIDES et al., 2009; SABEL, 2009). O efeito imunológico da criocirurgia foi documentado inicialmente por Yantorno e colaboradores (1967), como já citado anteriormente. Eles demonstraram haver produção de anticorpos contra o tecido prostático de coelhos após o congelamento, atingindo um pico de produção cerca de sete a dez dias depois da criocirurgia, parecendo ser tecido e espécie específicos (GAGE, BAUST e BAUST, 2009; SABEL, 2009; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009). Blackwood e colaboradores (1967) fizeram tratamento paliativo com criocirurgia em 13 pacientes com cânceres avançados ou com metástases e acharam níveis de anticorpos aumentados após a criocirurgia, mas não observaram respostas clínicas. Ablin (1972) observou a regressão de metástases em pacientes com câncer de próstata cujo tumor primário foi tratado com crioablação. Mesmo não se tendo certeza absoluta que esta regressão das metástases foi imunomediada, pelo menos um paciente apresentou no soro anticorpos contra o tecido prostático após a crioablação, sugerindo uma resposta de base humoral. A existência de uma resposta crio-imunológica permanece controversa, pois alguns autores descrevem benefícios, mas outros não, e os mecanismos pelo qual isto pode ocorrer são desconhecidos (GAGE, BAUST e BAUST, 2009; SABEL, 2009), mas algumas teorias têm sido propostas. A primeira teoria é a produção de anticorpos antitumorais. Quando as células tumorais morrem, os antígenos dentro dela são liberados e fagocitados por células apresentadoras de antígenos. Células B com anticorpos específicos contra o antígeno são estimuladas e transformadas em células plasmáticas. A formação de anticorpos induz a fixação de complemento, levando a quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos. Estas células liberam radicais livres e enzimas, que matam as células do tumor deixadas para trás (YIU et al., 2007). O segundo mecanismo de envolvimento imunológico é através da indução de células T citotóxicas. Normalmente antígenos intracelulares são transferidos para a membrana celular e reconhecidos por células T citotóxicas, que liberam enzimas e

29 matam as células. Foi proposto que a criocirurgia poderia sensibilizar as células T citotóxicas ou mudar a apresentação do antígeno (YIU et al., 2007). O terceiro mecanismo possível é que a criocirurgia poderia estimular a atividade das células natural killer. Entretanto, a relação da criocirurgia com a atividade destas células ainda não foi determinada. Contudo, a resposta do sistema imune à criocirurgia parece ser tipo celular depentente (YIU et al., 2007). Em 1972, Blackwood e Cooper examinaram a resposta gerada pela criocirurgia em aplicações de linhagens de miossarcoma e carcinossarcoma em ratos. Neste modelo, a criocirurgia gerou uma resposta imune, prevenindo uma nova aplicação das células tumorais e causando a regressão dos tumores secundários. Uma descoberta interessante deste estudo foi que a resposta imunológica foi suprimida quando a maior parte do tumor congelado foi deixada no animal. Entretanto, se apenas uma pequena quantidade do tecido congelado for deixada, a regressão é mais rápida e completa. Estes resultados sugerem que existe um limiar de estimulação do antígeno e o excesso de antígeno pode ser prejudicial para a resposta imune (YIU et al., 2007; SABEL, 2009). Resultado semelhante foi encontrado por Urano e colaboradores, em 2003, duas semanas após gerarem metástases em baço por aplicação de células tumorais de fígado em ratos, realizando a crioablação nos nódulos surgidos no fígado. Três grupos foram utilizados: grupo controle, grupo com apenas um nódulo congelado e grupo com três nódulos congelados. Duas semanas após a crioablação, os ratos foram sacrificados e o tumor primário no baço foi medido, assim como os tumores no fígado foram contados. Os autores descobriram que a ablação de um único nódulo no fígado levou a uma significante redução no número de focos metastáticos. Entretanto, a crioablação de diversos nódulos realmente elimina este efeito, resultando num maior número de lesões. Em contraste, muitos experimentos não têm demonstrado benefícios que poderiam ser atribuídos a uma resposta imune. Hoffmann e Bischof (2002) utilizando ratos com tumor de próstata Dunning AT-1, para examinar os benefícios da resposta imune, encontraram uma considerável resposta imune pelos níveis de anticorpos no soro, mas não houve inibição do crescimento tumoral.

30 Blackwell, Chapman e Washington em 1999, 2000 e 2001, respectivamente, numa série de três relatos dos efeitos do congelamento sobre 35% do fígado de ratos e ovelhas, descreveram uma lesão aguda no pulmão, que estaria relacionado com a liberação de citocinas (GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Seifert e colaboradores (2002), congelando 50% do fígado de ratos, notou aumento dos níveis séricos de citocina, levando a lesões no fígado e rins, mediados pela liberação de citocinas pelo fígado. Mais recentemente, Nishida e colaboradores (2011), descreveram a indução de uma resposta imune antitumoral sistêmica pelo tratamento criocirúrgico com nitrogênio líquido de um osteossarcoma em um roedor da família Muridae. Com aumentos evidentes da habilidade de adaptação do sistema imune de lutar contra o câncer e as limitações das opções de tratamentos contra metástases, a crioimunoterapia pode proporcionar uma importante alternativa no tratamento de metástases renais e do câncer de próstata, e poderão diminuir as morbidades e mortalidades associadas com doenças metastáticas avançadas (SIDANA e RODRIGUEZ, 2009). Por outro lado, está claro que o grande volume de tecido destruído pelo congelamento, aumenta as chances de disfunções no pós-operatório em pulmões e fígado, assim como aumentam a chance de uma resposta sistêmica de falhas de múltiplos órgãos, conhecido como choque criogênico (GAGE, BAUST e BAUST, 2009). A crio-imunologia continua a evoluir e é influenciada pelas novas investigações sobre os mecanismos crio-imunogênicos e novas técnicas para se detectar doenças. A necessidade de pesquisa é evidente em vários aspectos da crio-imunologia, especialmente na melhor compreensão de como o sistema imune torna-se ativado (NISHIDA et al., 2011). Apesar de existirem diversas formas de morte celular induzidas pela criocirurgia, nem todas as células que se encontram dentro da área congelada morrem. Por este motivo, para que se tenha mais êxito nesses procedimentos, deve-se levar em consideração alguns pontos, tais como: criógeno utilizado, equipamento e técnica de aplicação, duração e temperatura máxima de congelamento, relação entre os tempos de congelamento e descongelamento, número de ciclos e fatores intrínsecos ao próprio paciente (LUCAS, 2004).

31 2.4 AGENTES CRIÓGENOS Os agentes criógenos são gases que ao serem convertidos ao seu estado líquido, são capazes de extrair calor de tecidos vivos. Esta capacidade varia de acordo com a técnica de aplicação e com o tipo de criógeno utilizado, pois, distintos gases atingem diferentes temperaturas ou pontos de ebulição (GREINER, LISKA e WITHROW, 1975; BOJRAB, 1978). Como o sucesso do tratamento depende do congelamento rápido de todo o tumor, para isso, deve-se aplicar temperaturas extremamente baixas de no mínimo - 20ºC. Embora estejam disponíveis diversos criógenos, a maioria é de uso limitado devido aos perigos de combustão ou ao potencial para agredir o ambiente (HOLMBERG, 2007). Os criógenos mais comumente utilizados atualmente são: o nitrogênio líquido e o argônio, sendo o primeiro utilizado tanto em Medicina Humana quanto em Medicina Veterinária e o segundo somente utilizado em procedimentos de crioablação em Medicina Humana ou em experimento com animais. O óxido nitroso até recentemente ainda era utilizado na Medicina Veterinária, mas por atingir temperaturas de no máximo -89ºC, ser apenas indicado para lesões cutâneas de menos de um cm, possuir sistema de spray ruim, alcançar pouca profundidade de congelamento e necessitar de um aparelho pouco prático, está perdendo seu uso (LUCAS, 2004; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; EURIDES et al., 2009). Mas, atualmente, voltou a ser utilizado em Medicina Humana com o desenvolvimento dos equipamentos que utilizam sondas com gás sobre pressão e se beneficiam do efeito Joule-Thomson (GAGE, BAUST e BAUST, 2009). O dióxido de carbono, freons, oxigênio e o propano líquidos, são substâncias que foram sendo gradativamente abandonadas por induzirem temperaturas pouco agressivas ou, ainda, por seu risco de explosão quando manipulados (LUCAS, 2004). O nitrogênio líquido, que possui ponto de ebulição de -195,8ºC é o agente criógeno mais utilizado em criocirurgia, podendo ser utilizado como spray ou em aplicações em sondas. Embora não seja tóxico, não inflamável, inodoro, incolor e inerte, devem ser tomadas precauções quando se manipula o nitrogênio líquido, que

32 incluem: não manipular metais congelados pelo nitrogênio, não acondicionar em recipientes de vidro ou plástico pois eles tendem a se quebrar em temperaturas extremamente baixas, assim como não se deve acondicionar em recipientes selados, que não sejam aqueles apropriados, e é claro, não ter contato direto com o líquido. O armazenamento do nitrogênio líquido deve ser feito em botijões específicos para tal, com isolamento a vácuo. Outras vantagens do nitrogênio líquido são o preço de custo relativamente baixo, quando comparado com outros criógenos, ser extremamente potente, promovendo um congelamento rápido com a maior capacidade de penetração em tecidos (DAWBER, 2002; LUCAS, 2004; HOLMBERG, 2007; EURIDES et al., 2009). O gás argônio é utilizado para o congelamento percutâneo através de sondas de diâmetros bastante reduzido e, para tal, se aproveita do efeito Joule-Thomson, tanto para o congelamento, quando do efeito reverso, na utilização do gás hélio para promover o aquecimento (HAN e BELLDEGRUN, 2003; LAM, SHVARTS e BELLDEGRUN, 2004; THEODORESCU, 2004; GAGE e BAUST, 2007; TATLI et al., 2010). Ele possui várias vantagens sobre o nitrogênio líquido quando em relação à crioablação: possui temperatura equivalente; o processo de congelamento pode ser começado e interrompido quase que instantaneamente; é facilmente estocado sem evaporação e está sempre pronto para uso imediato; utiliza sondas de menor diâmetro e o equipamento é facilmente transportável (THEODORESCU, 2004). 2.5 TÉCNICAS DE PREPARO, APLICAÇÃO E EQUIPAMENTOS Alguns aspectos da técnica criocirúrgica são ótimos para uma terapia eficaz e se destina para a cura de doenças não neoplásicas ou neoplásicas. Bons resultados estão sendo alcançados em diversos problemas clínicos como taquiarritmias cardíacas e cânceres de vários tecidos e órgãos. Por outro lado, especialmente no tratamento de doença neoplásica, as técnicas de criocirurgia são menos do que ideal. Por exemplo, a incidência de câncer persistente no local tratado com criocirurgia no fígado e no câncer da próstata é na faixa de 10-40%, uma taxa que depende, em parte, dos critérios de seleção pelo médico. No entanto, esta taxa de falha também é uma indicação de que o

33 tratamento criocirúrgico era menos do que ótimo e tem necessidade de melhoria (BAUST e GAGE, 2004). A escolha do tipo de equipamento, do agente criógeno e da forma de aplicação está relacionada, principalmente, ao diagnóstico do quadro mórbido, do tipo e da fase evolutiva da lesão, do estado de higidez e do temperamento do paciente e, até mesmo, em função da estimativa de custo e da aparelhagem disponível (LANE, 1974; SEIM III, 1980; LUCAS, 2004). As razões para a persistência da doença nas lesões tratadas criocirurgicamente são várias, mas principalmente: erro na avaliação da extensão da doença, (possivelmente na interpretação da imagem fornecida por ultrassom, tomografia computadorizada ou por ressonância magnética); erro no diagnóstico da lesão; uso incorreto da técnica de criocirurgia (congelamento insuficiente ou pela dificuldade em se controlar o congelamento por qualquer método utilizado). Qualquer um destes fatores podem evoluir, a longo prazo, em um resultado insatisfatório em termos de sobrevida ou liberdade da doença (LANE, 1974; SEIM III, 1980; LUCAS, 1999; LUCAS, 2004). Para o estabelecimento do diagnóstico e da escolha da técnica mais adequada é imprescindível que se realize a biópsia seguida de exame histopatológico. Para um maior sucesso do procedimento, em caso de se tratar de pacientes idosos e de alto risco, pode-se realizar a biópsia no ato criocirúrgico (LANE, 1974; SEIM III, 1980; LUCAS, 2004). As amostras de tumores para biópsia devem ser realizadas antes do congelamento para minimizar os artefatos celulares, manter a integridade das células e também para reduzir a quantidade de tecido congelado. As lesões pequenas e superficiais, são removidas rente à pele e quando necessário, faz-se ligaduras para evitar sangramento (HOLMBERG, 2007). Desta forma, diminui o tempo de congelamento direto e permite alcançar temperaturas menores nas regiões mais profundas e periféricas do tumor (WITHROW, 2007a). Massas maiores podem ser parcialmente removidas para permitir um melhor congelamento por penetração. Os locais centrais da biópsia são fechados após o último descongelamento, e as suturas podem ficar e cair com o restante do tumor (HOLMBERG, 2007).

34 Claro que, mesmo com o diagnóstico correto e a técnica perfeita, tecidos biológicos ainda podem resistir à lesão por congelamento. A criocirurgia tem suas limitações, por isso a direção da investigação deve ser para a resolução de uma série de fatores que afetam sua eficácia (BAUST e GAGE, 2004). Apesar da existência de modernos aparelhos que utilizam o gás argônio em crioablação em Medicina Humana, na Medicina Veterinária o que se utiliza com maior frequência e por ter maior disponibilidade é o nitrogênio líquido. Normalmente utilizado em aparelhos do tipo pistola, que aspergem o criógeno tanto na forma aberta, em spray, como na forma fechada, por sondas, mas em alguns casos, ainda é utilizada a técnica de derramamento. 2.5.1 Preparação do paciente e anestesia A preparação do local para a criocirurgia é menos complicada que para a cirurgia de rotina, mas minimiza a ocorrência de complicações desnecessárias. A tricotomia da área imediatamente ao redor do tecido alvo, permite inspeção visual mais fácil do globo de gelo em expansão e a identificação de potenciais problemas com o escape de nitrogênio líquido. Evita também o acúmulo no pós-operatório de resíduos na pelagem em volta das lesões e reduz o odor. Embora não seja necessária esterilidade, é desejável a antissepsia da área circundante, se forem colocados anestésicos locais ou agulhas termossensíveis no tecido normal adjacente (HOLMBERG, 2007). A realização da tricotomia também é útil quando a lesão que deve ser congelada é provida de pelos, pois estes de certa forma dificultam o contato do criógeno com a tumoração, piorando a técnica criocirúrgica. Uma das vantagens da criocirurgia se deve ao fato de quase sempre não ser necessário o uso de anestesia geral para o tratamento criocirúrgico de pequenas lesões cutâneas. Entretanto, vários autores indicam a anestesia geral sempre, pois ajuda a conter os movimentos do animal, atenua o desconforto, a dor e o pânico que por vezes se manifestam, quando do uso da criocirurgia. Para alguns pequenos procedimentos, em pacientes calmos e num ambiente tranquilo, a utilização de uma sedação, associada a um bloqueio anestésico local, já é o suficiente. Pode-se ainda, utilizar a

35 anestesia local com duas funções. A primeira de promover analgesia propriamente dita e a segunda para promover a balonização, que nada mais é do que o afastamento da lesão de possíveis vasos pela injeção da anestesia infiltrativa por baixo da lesão, elevando-a (SEIM III, 1980; LUCAS e LARSSON, 2002; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; EURIDES et al., 2009). Holmberg (2007) sugere que a utilização de lidocaína com epinefrina na anestesia local, não só ajuda a eliminar a dor do tratamento, como também facilita um ciclo de congelamento rápido / descongelamento lento por produzir vasoconstrição local. Já Gloria e Graham (2001), na preparação de seus pacientes para criocirugia, utilizam o bloqueio anestésico local, afirmam que tanto faz ser com ou sem epinefrina. Entretanto, na literatura consultada, não foram encontrados relatos que comprovem ser significativa a diferença de tempo no caso do congelamento rápido e do descongelamento lento. 2.5.2 Instrumentação criocirúrgica e métodos de aplicação Historicamente, os criógenos têm sido utilizados em tecidos indesejados por aplicadores com ponta de algodão ou por gotejamento de líquidos diretamente sobre o tumor (técnica de derramamento). Estas técnicas são consideradas limitadas, pela ausência de controle na expansão ou término do congelamento (HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; EURIDES et al., 2009). Os mecanismos para administração de nitrogênio incluem normalmente a zaragatoa, o spray, as sondas (Figura 1) e, com menor frequência, o derramamento direto do nitrogênio. Deve-se tratar cada lesão com o equipamento mais apropriado podendo, em algumas situações, ser utilizados mais de um equipamento, dependendo da preferência e da experiência do profissional (LUCAS, 2004; EURIDES et al., 2009). A quantidade de nitrogênio líquido e a escolha da técnica dependem do tamanho, do tipo de tecido e da profundidade da tumoração. A área do corpo na qual a lesão está localizada e a profundidade de congelamento necessária também devem ser consideradas. Os fatores do paciente que devem ser incluídos são: espessura da

epiderme e estruturas subjacentes, a quantidade de água na pele e o fluxo sanguíneo local (ANDREWS, 2004). 36 Figura 1: Ilustração de três mecanismos para administração de nitrogênio líquido mais utilizadas em Medicina Veterinária: Zaragatoa, spray e sonda. Fonte: Andrews (2004). A zaragatoa é uma haste com ponta de algodão embebida em nitrogênio e aplicada direta e perpendicularmente sobre a lesão. É o procedimento mais simples e menos oneroso. O dispositivo deve ter diâmetro menor que a superfície com a qual entrará em contato, e deve ser aplicado imediatamente após a imersão no nitrogênio líquido, por sobre a lesão. A aplicação deverá ocorrer até a formação de um halo branco de congelamento ao redor da lesão. Em geral o tempo de aplicação pode variar de cinco a 45 segundos. Lesões de tamanho reduzido necessitam de um menor tempo de congelamento comparativamente às lesões maiores. Neste caso, deve-se avaliar o tamanho e a espessura da lesão, podendo o congelamento atingir profundidade de até dois mm (LUCAS, 1999; GRAHAM e BARHAM, 2003; LUCAS, 2004; EURIDES et al., 2009). O spray é o método mais difundido, mais eficaz e versátil, e baseia-se no princípio da volatilização do nitrogênio em recipiente fechado e sua saída por uma abertura existente (GREINER, LISKA e WITHROW, 1975; GOLDESTEIN e HESS, 1976; SEIM III, 1980; LUCAS, 1999; GRAHAM e BARHAM, 2003; LUCAS, 2004; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; EURIDES et al., 2009). O método permite controlar o fluxo, já que o volume é inversamente proporcional ao diâmetro da abertura

37 que pode ser modificada de acordo com a necessidade. As pistolas de pulverização utilizadas possuem autopressurização, destinando-se a liberar uma combinação de vapor e gotículas de nitrogênio líquido na superfície-alvo. A velocidade de aplicação é controlada por um gatilho existente no aparelho. É possível, com este método, tratar lesões planas ou irregulares. Na aplicação por spray, o jato é direcionado para a lesão sem empregar qualquer método para contê-lo, sendo denominado sistema aberto de aplicação (KUFLIK, 1994; LUCAS, 2004; HOLMBERG, 2007; EURIDES et al., 2009). Quando usado como spray, o criógeno líquido evapora ao contato com o tecido. Esta mudança de fase líquida para a gasosa remove comprovadamente uma quantidade maior de calor do tecido tratado, em comparação com as sondas (KUFLIK, 1994; HOLMBERG, 2007). A escolha da ponta, com seu respectivo orifício, varia de acordo com o tamanho da lesão. Sendo que quanto maior a lesão, maior deve ser o orifício. Por vezes, para se manter o halo de congelamento desejado é necessário que o jato seja intermitente, até que se atinja o tempo previsto. Com o spray há a possibilidade de tratamento de lesões lineares, nas quais se faz um movimento de vaivém (ou método de pincel ), ou de lesões geográficas onde se aplica de modo circular ou em movimentos em espiral (Figura 2) (KUFLIK, 1994; ZOUBOULIS, 1999; GRAHAM e BARHAM, 2003; LUCAS, 2004; ANDREWS, 2004). Figura 2: Esquema adaptado de Graham e Barham (2003), das diferentes formas de aplicação do spray : direto; circular e pelo método de pincel.

38 Para um melhor uso desta técnica, a ponteira da pistola deve estar perpendicular à lesão, num ângulo de 90º, a uma distância que pode variar de um a dois cm da superfície da tumoração com o jato de spray aplicado na região central da mesma (Figura 3) (ZOUBOULIS, 1999; ANDREWS, 2004). A aplicação do congelamento deve ser direta até que o halo de congelamento ultrapasse as margens da tumoração da forma desejada. O tamanho da margem depende principalmente da espessura da tumoração e se ela é benigna ou maligna. A temperatura na margem do halo de gelo é 0ºC e as temperaturas letais (-20ºC a -50ºC) são encontradas a cinco mm dentro do halo de congelamento. Para a maioria das lesões benignas, as margens podem ser de um a dois mm além do que se consegue visualizar a lesão. Em relação às lesões pré-malignas, necessita-se de dois a três mm e para as malignas, cinco a dez mm de tecido normal congelado além da lesão. Estes tamanhos de margens permitem profundidade suficiente de congelamento para garantir temperaturas de -50ºC a uma profundidade de quatro a cinco mm (Figura 3) (ANDREWS, 2004; WITHROW, 2007a; TATLI et al., 2010). Figura 3: Esquema adaptado de Andrews (2004) da formação da bola de gelo, a margem de cinco mm necessária para que o tratamento alcance a temperatura de -50ºC em toda a lesão, inclusive de profundidade e a altura que a ponteira da pistola deve ficar em relação à lesão. Uma vez alcançado o halo de congelamento adequado, o spray precisa ser mantido de forma intermitente, por tempo suficiente, para que o alvo continue congelado. Este tempo pode variar de cinco a 30 segundos além do tempo necessário

39 para se alcançar o halo de congelamento. Caso mais de um ciclo de congelamento / descongelamento seja necessário, é importante que haja o completo descongelamento da lesão para a aplicação do outro ciclo (ANDREWS, 2004). De acordo com Zoubolis (1999), a profundidade de congelamento pela técnica de spray pode ser avaliada em função da expansão lateral do halo de congelamento, e consiste em cerca de metade do raio da superfície congelada. O borrifamento intermitente do nitrogênio líquido é desejável para que se mantenha o halo de congelamento e aumente a profundidade. Mesmo assim, a profundidade pode alcançar somente dez mm, não sendo uma técnica apropriada para lesões volumosas. Nestes casos, recomenda-se a excisão de parte das lesões para aumentar a eficiência da técnica. O emprego do spray inclui-se no chamado sistema aberto, quando o jato é direcionado para a lesão, sem nenhum aparato para contê-lo. Pode ser chamado de confinado quando se utiliza algum utensílio para direcionar o jato como o cryoplate ou daqueles de otoscópios. Denomina-se, finalmente, sistema fechado quando se recorre a tubos fechados ( cryochamber ), em uma das extremidades (KUFLIK, 1994; ZOUBOULIS, 1999; LUCAS, 2004). A desvantagem da técnica do spray consiste na possibilidade de escape do gás dos tecidos durante o tratamento e o risco de insuflação dos tecidos com o gás quando o spray é utilizado em feridas abertas com úlceras ou fístulas (GAGE, 1992). Pode haver um maior número de falhas quando profissionais inexperientes utilizam a técnica do spray, do que quando fazem o uso de sondas. Isto porque é necessário que se tenha habilidade suficiente para se manter o halo de congelamento adequado, o que pode acarretar em recidivas por má utilização da técnica. É indicada a prática em moldes de gelatina ou em peças de necropsia antes de tratar os pacientes (SEIM III, 1980; WITHROW, 2007a). Entretanto, Andrews (2004) já acha que o método mais apropriado para iniciantes é o spray, por maximizar a capacidade de destruição celular com menor morbidade. As sondas criocirúrgicas podem ser resfriadas pela circulação do criógeno líquido através delas (sondas por contato) ou por liberação de um gás de alta pressão através de um pequeno orifício na ponta da mesma (sondas penetrantes). O congelamento por

40 sonda geralmente é mais fácil de controlar que um spray, porém menos letal para o tecido que a aplicação direta do criógeno, por este motivo é adequado para lesões pequenas mais ou menos esféricas, desde que esta compreenda o halo de congelamento (ANDREWS, 2004; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a). Existem vários modelos e tamanhos disponíveis, podendo adicionar versatilidade dependendo do tamanho e localização da tumoração (ANDREWS, 2004). As sondas podem ser usadas para o congelamento por contato ou por penetração. O congelamento por contato envolve a colocação da sonda congelada contra a superfície úmida do tumor, formando uma adesão (crioadesão) que irá acontecer rapidamente e esta deve ser mantida de 30 segundos até alguns minutos. Pode-se, então, aplicar uma delicada tração para erguer o tumor para fora das estruturas subjacentes, enquanto o globo de congelamento se estende aos limites monitorados. A sonda não irá se aderir a um tecido seco ou um epitélio intacto. Se a sonda se descolar prematuramente, tanto a sonda quanto o tumor deverão ser descongelados e o processo deve começar novamente. Quando a profundidade de congelamento desejada for alcançada, o congelamento ativo é parado. A sonda deverá se descolar em alguns minutos e não deve ser removida a força, com a possibilidade de ocorrer uma lesão tecidual indesejada. Quando a superfície do tumor estiver úmida (descongelada), o tumor é novamente congelado (HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a). As sondas também podem ser úteis no tratamento de lesões vasculares, onde a pressão da sonda pode ser usada para remover o sangue dos tecidos permitindo assim um tratamento mais adequado (ANDREWS, 2004). As sondas penetrantes, aquelas que utilizam o efeito Joule-Thomson, são bastante utilizadas nas crioablações em Medicina Humana e em experimentos com animais, mas na Medicina Veterinária ainda não são utilizadas como rotina. O uso do derramamento direto de nitrogênio líquido em lesões é esporadicamente utilizado. Esta técnica pode levar a extravasamentos e com isso, lesar grandes áreas de tecidos sadios. Deve-se, portanto, utilizar de forma criteriosa e com recipientes que contenham praticamente o mesmo diâmetro da lesão a ser tratada. A utilização de vaselina ao redor da borda do recipiente é indicada como isolante nestes casos (GREINER, LISKA e WITHROW, 1975).

41 Os novos dispositivos de crioablação em desenvolvimento procuram superar algumas das dificuldades que surgem quando se congela o tecido utilizando o efeito Joule-Thomson. Como os gases nobres raros (argônio e hélio) são caros, foram feitas tentativas de se criar sistemas com agulhas que congelam pela simples circulação de um criógeno líquido através delas. O desafio deste tipo de sistema é que, assim que o tecido congela na ponta da sonda, a absorção de calor a partir do tecido provoca uma transição de fase no criógeno de líquido para gás. Esta expansão rápida de gás na ponta da sonda pode bloquear o fluxo do criógeno líquido, através da agulha, num efeito denominado bloqueio de vapor. No entanto, pela circulação do gás azoto sob pressão perto do seu ponto crítico (ponto em que não há nenhuma transição de fase distinta entre líquido e gás), o bloqueio de vapor pode ser evitado. Desta forma, evita que grandes quantidades de gases de expansão sejam perdidas, como é visto com os dispositivos que utilizam o efeito de Joule-Thomson, criando com isso um potencial para a diminuição significativa do custo e economia de espaço (ERINJERI e CLARK, 2010). 2.6 MONITORAÇÃO DA TEMPERATURA Inúmeros experimentos têm focado nos métodos de monitoração do progresso de congelamento dos tecidos. A utilização das agulhas termossensíveis para a aferição da temperatura dos tecidos em locais apropriados veio se tornar comum no início da moderna criocirurgia, mas estas não promovem uma visão global do tecido congelado (BAUST e GAGE, 2004; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Apesar das agulhas termossensíveis serem ideais para a monitoração da temperatura no tecido, a observação visual e palpação da calota de gelo podem ser sugestivos para a avaliação da temperatura (WITHROW, 2007a). O uso de técnicas de imagem começou com as demonstrações de Onik e colaboradores no final dos anos 80, promovendo um método de monitoração do processo de congelamento por ultrassonografia. Isto levou a era do renascimento da criocirurgia nos anos 90. A ultrassonografia é um método comum de monitoração do processo de congelamento, mas ela tem limitações devido às sombras acústicas. Seu uso pode e deve ser combinado com as agulhas termossensíveis para locais próprios

42 no tecido (BAUST e GAGE, 2004; GAGE e BAUST, 2007; GAGE, BAUST e BAUST, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010; TATLI et al., 2010). Rapidamente foram seguidas investigações na praticabilidade do uso da tomografia computadorizada e da ressonância magnética para monitorar o congelamento dos tecidos. A tomografia computadorizada tem a vantagem de promover uma imagem tridimensional. Já a ressonância magnética além de promover uma imagem tridimensional, com o uso de um modelo de software apropriado, pode se prever as curvas de temperaturas no tecido congelado. O volume de tecido destruído é um pouco menor do que o tecido congelado o que já era esperado porque as células no tecido onde a temperatura está entre 0 e -20ºC não são completamente destruídas (BAUST e GAGE, 2004; GAGE e BAUST, 2007; GAGE, BAUST e BAUST, 2009; ERINJERI e CLARK, 2010; TATLI et al., 2010). Aproximadamente 70 a 80% do tecido congelado não vai sobreviver nesta área de temperatura (WITHROW, 2007a). Em 2009, Josan e colaboradores utilizaram a resonância magnética em caninos para a crioablação prostática com três tipos de congelamento. Verificaram que a ressonância magnética pode ser potencialmente usada para avaliar a criolesão promovida e para monitorar a resposta do tecido ao longo do tempo após a crioablação. Recentemente, Murphy e colaboradores (2011), trataram um cão com recidiva de adenocarcinoma intranasal com criocirurgia guiada por tomografia computadorizada, associado posteriormente ao uso de piroxicam. Apesar de algumas complicações no primeiro mês, como lise em osso orbital de 0,5 cm, lise em cartilagem cribiforme e ossos turbinados, após 13 meses as lises já não estavam presentes e apenas uma massa de menor tamanho era notada à tomografia computadorizada. O animal sobreviveu por 21 meses após a criocirurgia e foi eutanaziado devido a um hemoabdome. Na autópsia foi diagnosticada uma massa grande em fígado, mas não obtiveram o histopatológico. Outras técnicas de monitoração menos comuns de interesse experimental incluem a termografia e a medida da impedância, incluindo técnicas recentes envolvendo tomografia de impedância elétrica (GAGE, BAUST e BAUST, 2009).

43 2.7 CICLO DE CONGELAMENTO / DESCONGELAMENTO Para entender os mecanismos de destruição celular e tecidual requer reconhecer os efeitos do ciclo de congelamento / descongelamento no uso da criocirurgia. Cada efeito nas fases do ciclo de congelamento / descongelamento pode produzir destruição tecidual e todas podem ser manipuladas. Além do mais, a tecnologia do efeito em cada fase do ciclo de congelamento / descongelamento é crítica, quando o objetivo é a destruição completa ou seletiva do tecido. Como os componentes do ciclo de congelamento / descongelamento são difíceis de descrever com precisão num volume de tecido congelado, seus efeitos individuais na destruição criocirúrgica têm sido avaliados em vários experimentos (CHUA e CHOU, 2009; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). O que já se sabe é que quanto mais rápida for a velocidade de congelamento, mais intenso será o grau de destruição celular e quanto mais lento for o descongelamento, por sua vez, maior será a morte celular. Já um congelamento lento seguido de um descongelamento rápido irá reduzir a morte celular causada pela criocirurgia (LANE, 1974; GREINER, LISKA e WITHROW, 1975; SEIM III, 1980; GAGE, 1992; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a; BAUST et al., 2009; EURIDES et al., 2009; ERINJERI e CLARK, 2010). 2.7.1 A velocidade de congelamento Experimentos têm mostrado que os cristais de gelo intracelulares, considerados letais para as células, são formados por uma quantidade ampla de velocidades de congelamento, incluindo os congelamentos lentos. Esta é a importância de se congelar tecido in vivo nos experimentos, porque a maioria do volume do tecido congelado é submetida apenas à velocidade de congelamento lento, que é por volta dos -10ºC por minuto ou menor. O congelamento lento tende a produzir cristais de gelo extracelulares, e estes cristais maiores, considerados menos lesivos em suspensões celulares, podem ser mais letais quando ocorrem em tecidos com aglomerados celulares (Figura 4) (WITHROW, 2007a; GAGE, BAUST e BAUST, 2009).

44 No caso das sondas, apenas o tecido perto da superfície da fonte de congelamento é congelado rapidamente. A velocidade de congelamento em locais próximos da fonte criógena, pode ter variações de aproximadamente 50 a 60ºC negativos por minuto, enquanto que o tecido a congelar que esteja próximo à periferia perderá a temperatura de forma mais lenta. Diferentes tipos de tecidos possuem diferentes características termais, o que modifica o volume de tecido congelado pela sonda (GAGE e BAUST, 2007; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). O congelamento rápido do tecido com sonda fechada até uma temperatura de -30ºC normalmente demora cerca de um minuto, já um congelamento lento para alcançar a mesma temperatura, demora cerca de três minutos (GAGE et al., 1985). Figura 4: Microscopia eletrônica de eritrócitos (em preto) de coelho. (a) descongelado; (b) congelado até -30ºC com velocidade lenta de congelamento; (c) congelado até -50ºC com velocidade moderada de congelamento; (d) congelado até -150ºC com velocidade de congelamento rápida. Observar a desidratação dos eritrócitos em (b) presença tanto de desidratação de eritrócitos quanto de gelo intracelular (c) e micro cristais de gelo dentro dos eritrócitos sem ocorrer desidratação (d). Fonte: Sun (2007). Gage e colaboradores (1985) demonstraram com experimentos in vivo que a velocidade de congelamento, seja ela rápida ou lenta, não é tão importante como outros fatores do ciclo de congelamento / descongelamento. 2.7.2 A temperatura no tecido A temperatura no tecido é um fator chave na causa de lesão tecidual. Estes congelam a uma temperatura de -0,6ºC, no entanto, esta temperatura não é letal para

45 as células. Como um guia para o tratamento de neoplasias, há vários experimentos que sugerem temperaturas de -20ºC como adequadas para destruição tecidual e devem ser avaliadas com cautela. Lesão tecidual extensiva concreta ocorre entre -20ºC e -30ºC, mas a destruição de células tumorais neste intervalo de temperatura é incerta e incompleta. Neel, Ketcham e Hammond (1971), em experimentos com tumores em animais, verificaram que a temperatura necessária para destruição de tumores é -60ºC, e há a necessidade de repetição do ciclo de congelamento / descongelamento em seguida. Em experimentos com diversos tecidos em animais têm indicado que a temperatura letal está entre -40ºC e -50ºC (BOJRAB, 1978; GAGE, CARUANA e MONTES, 1982; GRAHAM e BARHAM, 2003; QUEIROZ e MATERA, 2004; GAGE e BAUST, 2007; WITHROW, 2007a; BAUST et al., 2009; EURIDES et al., 2009; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Uma variedade de opiniões em relação à temperatura letal, ou em outras palavras, à temperatura apropriada para se alcançar o objetivo na criocirurgia em câncer, persiste ainda hoje. A razão para as opiniões divergentes é em decorrência do uso em diferentes tipos e tecidos celulares em condições experimentais distintas. A resistência das células cancerosas mostra a necessidade de uma repetição do ciclo de congelamento / descongelamento. Uma visão razoável é que as células congeladas em temperaturas menores que -40ºC são destruídas pelo dano direto na célula, mas a estase vascular terá um efeito destrutivo mais amplo sobre temperaturas de congelamento mais quentes (GRAHAM e BARHAM, 2003; QUEIROZ e MATERA, 2004; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Em relação ao comportamento dos tecidos perante o frio, os diversos tipos celulares têm diferentes sensibilidades a temperaturas de congelamento. Essas diferenças podem ser identificadas nos ciclos curtos e únicos de congelamento. Alguns experimentos mostram que as temperaturas nas quais as diferenças na sensibilidade das células podem ser identificadas estão no intervalo de zero a -30º C. Os melanócitos são os mais sensíveis e morrem em temperaturas que variam de -4 a -7ºC. As glândulas sebáceas e os folículos pilosos são perdidos na faixa de congelamento abaixo de -20ºC, porém os queratinócitos ainda podem sobrevivem até à -30ºC. Experimentos com congelamento do fêmur canino demonstraram que osteócitos são

46 mortos em cerca de -10ºC. As células normais do fígado, rim, próstata morrem em cerca de -15 a -20ºC. Os fibroblastos irão resistir à lesão por congelamento até -30ºC, e só vão morrer se a temperatura alcançar -35ºC. As células tumorais mostram sua resistência extraordinária e variável à lesão por congelamento (GAGE et al., 1966; SMITH, FRASER e MACIVER, 1978; ZOUBOULIS, 1999; GRAHAM, 2001; RUPP et al., 2002; SEIFERT et al., 2003; QUEIROZ e MATERA, 2004; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Além da sensibilidade das células à lesão por congelamento, a estrutura do tecido também é importante. Desde que os fibroblastos e as fibras colágenas resistam à lesão criocirúrgica, a arquitetura do tecido, embora desvitalizado, permanece como uma estrutura para a reparação tecidual (LI et al., 1980; GAGE, CARUANA e MONTES, 1982; SHEPHERD e DAWBER, 1984). Os grandes vasos sanguíneos continuam a funcionar normalmente, assim como os nervos permanecem intactos. A estrutura do osso aparece inalterada após a desvitalização pelo congelamento. A preservação da estrutura do tecido é de extrema importância para a cicatrização de feridas (GAGE, BAUST e BAUST, 2009). 2.7.3 O tempo de duração do congelamento A duração ideal de congelamento, isto é, quanto tempo o tecido deve ficar congelado, não é bem estabelecido, mas experiências têm mostrado que congelamentos prolongados produzem maiores efeitos destrutivos. Pode variar de 30 segundos a 20 minutos. Quando os procedimentos estão relacionados a tratamentos de dermatopatias neoplásicas, hiperplásicas e degenerativas, raramente os tempos de congelamento ultrapassam 90 segundos (GAGE et al., 1985; GLORIA e GRAHAM, 2001; LUCAS e LARSSON, 2002; DAWBER, 2002; KUFLIK, 2004; LUCAS e LARSSON, 2006; QUEIROZ, MATERA, e DAGLI, 2008). Porém, para a crioablação de neoplasias em órgãos internos, como fígado, próstata, rins, pâncreas, pulmões e ossos, os tempos necessários para o congelamento podem variar de cinco a 40 minutos (SILVERMAN et al., 2000; SEIFERT et al., 2003; CHIU et al., 2010; LEVY, AVALLONE e JONES, 2010; LI et al., 2012; NIU et al., 2012). Entretanto, em geral, a duração do

47 congelamento não é importante se o tecido for congelado a temperaturas abaixo de - 50ºC. Contudo, manter congelado o tecido com temperaturas de -10ºC até -25ºC aumenta a destruição devido aos efeitos da concentração de solutos e da recristalização (WITHROW, 2007a; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Os cirurgiões do Reino Unido recomendam um congelamento contínuo de 30 segundos; já nos Estados Unidos, preconiza-se um congelamento intermitente por 30 a 60 segundos até que os sensores termoelétricos registrem a temperatura de -50ºC ou obtenha-se um halo de congelamento de cinco mm ao redor do tumor (GRAHAM, 2001). Dawber (2002) sugere que uma lesão que deva ser congelada por 60 segundos, pode ter seu tempo dividido da seguinte maneira: 10-15 segundos de congelamento direto até que se atinja o halo desejável e o restante do tempo com congelamento intermitente, apenas para se manter o halo de congelamento criado. 2.7.4 A velocidade de descongelamento O descongelamento lento do tecido congelado é um fator primordial para a destruição celular. Experimentos com lesões provocadas no congelamento pela neve e com a criopreservação têm mostrado que o rápido aquecimento aumenta as chances das células sobreviverem. Quanto mais longa é a duração do descongelamento, maior será o dano celular devido ao efeito da concentração de solutos e maior crescimento dos cristais de gelo intracelulares pelo processo de recristalização. Os cristais de gelo maiores compartilham forças que destroem os tecidos (HOLMBERG, 2007; YIU et al., 2007; CHUA e CHOU, 2009; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Gage e colaboradores (1985) também demonstraram os efeitos deletérios no descongelamento lento. Whittaker em 1975 demonstrou que os cristais de gelo intracelulares são maiores no segundo ciclo de congelamento / descongelamento e sugere que este efeito seja devido ao maior tempo de descongelamento. Por estes motivos, a taxa de descongelamento deve ser o mais lenta possível, sendo determinada pelo descongelamento natural pelo aquecimento do próprio.

48 Alguns autores sugerem que o tempo ideal de descongelamento total deve ser igual ou maior a duas vezes o tempo de congelamento total (THAI e SINCLAIR, 1999). Gage e colaboradores (1985), em um experimento com o congelamento de pele de cães, utilizando sonda criocirúrgica e agulhas termossensíveis a cinco mm da sonda, observaram que um congelamento por cerca de um minuto (30 segundos a dois minutos) provoca um descongelamento espontâneo de cinco a sete minutos (considerado quando a temperatura registrada chegou a zero graus). 2.7.5 Repetição do ciclo de congelamento / descongelamento Desde o início da moderna criocirurgia, os relatos clínicos iniciais em 1965 mostraram a necessidade de repetição do congelamento da criocirurgia no tratamento do câncer. A dificuldade em se destruir as células cancerígenas pelo congelamento era óbvio no início daquelas experiências. O segundo ciclo produz um rápido e mais extensivo congelamento tecidual, logo o volume de tecido congelado era maior e com isso aumenta a margem de destruição na periferia do tecido congelado (BAUST e GAGE, 2005; HOLMBERG, 2007; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Com o segundo ciclo, ocorre sempre um aumento no tempo total necessário para o descongelamento naqueles tecidos submetidos a mais de um ciclo, por haver maior quantidade de água disponível, provenientes das células destruídas no primeiro ciclo. Ainda, pelo fato de haver uma maior condutividade, haverá um maior congelamento das células localizadas na periferia da lesão (SEIM III, 1980; GAGE e BAUST, 1998; HOFFMANN e BISCHOF, 2002). Para Withrow (2007a), o número de aplicações dos ciclos de congelamento / descongelamento em cada sessão de tratamento é importante. A maioria dos tumores benignos pequenos deve ser tratada com dois ciclos na mesma sessão, enquanto os tumores malignos, vasculares, densos, ou com grande volume devem ser tratados com três ciclos. Pouca vantagem é observada em relação à morte celular com a repetição de mais de três ciclos no mesmo volume tumoral. O primeiro ciclo de congelamento / descongelamento aumenta a condutividade termal do tecido causado pela ruptura celular. O segundo ciclo submete o tecido a

49 alterações físico-químicas mais extensas, enquanto passa por condições termais danosas pela segunda vez (BAUST e GAGE, 2005). Evidências experimentais confirmam o efeito destrutivo mais intenso no segundo ciclo de congelamento. O maior efeito letal na repetição do segundo ciclo é mais evidente nas temperaturas mais elevadas, isto é, nos tecidos com temperaturas entre - 20 e -30ºC. É claro que é nesta faixa que o maior efeito destrutivo é mais necessário. Nos tecidos com temperaturas de -40 a -50ºC ou mais frios, a temperatura já é suficientemente baixa para destruir os tecidos com apenas um ciclo. A maior importância de se utilizar um novo ciclo de congelamento / descongelamento é de se estender o efeito letal nas zonas congeladas mais quentes que se encontram na periferia do tecido alvo. A evidência de se utilizar um segundo ciclo é tão forte que a maioria dos clínicos que usam a criocirurgia contra o câncer tem adotado este tipo de técnica (BOJRAB, 1978; KUFLIK, 1994; ZOUBOULIS, 1999; EURIDES et al., 2009; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Com a repetição, o segundo ciclo aumenta a extensão da necrose até aproximadamente 80% do volume de tecido previamente congelado (BAUST e GAGE, 2005). Gage (1978) num estudo feito com o congelamento de palatos de cães utilizou dois tempos de congelamento (três e seis minutos), diferentes temperaturas máximas alcançadas (-40, -80, -120 e -160ºC) e dois tipos de ciclos (único e duplo). Desta forma, demonstrou que ciclos únicos com temperaturas mais altas durante um menor tempo produziam uma menor lesão tecidual do que a utilização de ciclos duplos com temperaturas mais baixas e maior tempo de congelamento. 2.7.6 O intervalo entre os ciclos de congelamento / descongelamento O intervalo entre os ciclos de congelamento / descongelamento é um fator de importância na lesão tecidual, mas pouca atenção tem sido dada a esta fase do ciclo. Whittaker em 1975 realizou experiências utilizando repetições de ciclos de congelamento / descongelamento na mucosa oral de ramisters e mostrou que os cristais de gelo intracelulares são maiores com o aumento de tempo entre os ciclos. Portanto, sugeriu que um maior tempo de descongelamento no intervalo entre ciclos irá

50 aumentar a eficácia da técnica. Um maior tempo de descongelamento permite a recristalização do gelo intracelular e danos osmóticos. Além disso, deixando o tecido no estado hipotérmico por um pouco mais, fornece o tempo para a falha da microcirculação. Na prática clínica, o desejo e a necessidade de avançar com o processo é tão grande que muitos médicos não têm paciência para aguardar a conclusão do descongelamento completo ou um intervalo prolongado entre os ciclos (BAUST e GAGE, 2005; GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Resumindo, a técnica ótima para a destruição de tumores é um congelamento rápido do tecido a uma temperatura baixa adequada, descongelamento lento e a repetição do ciclo de congelamento / descongelamento (GAGE, BAUST e BAUST, 2009). 2.8 INDICAÇÕES DA CRIOCIRURGIA Face ao seu caráter destrutivo, a criocirurgia tem sido empregada para o tratamento de diferentes enfermidades de sistemas ou órgãos. Historicamente, há uma maior indicação no sistema tegumentar, devido a grande facilidade de aplicação por equipamentos e métodos simples (LUCAS, 2004). Entretanto, diversos tecidos e órgãos têm sido objetos de experiências preliminares para a aplicação clínica da criocirurgia, principalmente para o tratamento de tumores. Estes tecidos têm sido o foco de muitas pesquisas in vivo. O uso da criocirurgia em alguns tecidos é comum na prática clínica e têm pouca necessidade de realização de novos trabalhos em animais experimentais. Alguns experimentos foram realizados em outros tipos de tecidos no início da criocirurgia, mas não foram continuados devido à falta de aplicação clínica favorável (GAGE, BAUST e BAUST, 2009). Gage, Baust e Baust (2009) em sua revisão, demonstram a aplicação e o estudo da criocirurgia em diversos tecidos, entre eles: pele; fígado; rins; próstata; pâncreas; mama; esôfago; traqueia, brônquios, pulmões, veias; coração; nervos; ossos; cérebro; olhos; útero; vesícula urinária; e menos comumente em: tireoide e adrenais. Diversos autores indicam o uso da criocirurgia para vários procedimentos dermatológicos. Dawber (2002) indicou o uso em 70 lesões benignas e em 15 lesões,

51 incluindo as pré-malignas e malignas, e entres estas estão os carcinomas de células basais e escamosas, melanomas e sarcomas. Ele obteve uma taxa de cura para as lesões malignas que variou de 74 a 98%. Já Kuflik (2004), em seu estudo apenas com lesões malignas, indicou a criocirurgia para os carcinomas de células basais, escamosas e basoescamosas, obtendo uma taxa de cura sem recidiva em cinco anos de 98,6% em 4406 lesões novas ou recidivas de cânceres de pele. De forma semelhante, Kuflik e Gage já haviam demonstrado em 1991, resposta similar em relação à taxa de cura após cinco anos do tratamento criocirúrgico, com 98% de cura em 684 novos tumores cutâneos. Em Medicina Veterinária, atualmente não há tantas indicações quanto em Medicina Humana, principalmente devido à falta de acesso às tecnologias disponíveis em relação aos aparelhos de criocirurgia Veterinária e a dificuldade de se conseguir o apoio de exames de imagem, como a tomografia computadorizada e resonância magnética para os procedimentos de crioblação de órgão internos. Em contrapartida, o uso da criocirurgia em dermatologia Veterinária vem crescendo bastante, principalmente pela disponibilidade de equipamentos e diversos aparatos nesta área. As indicações criocirúrgicas em Medicina Veterinária são: dermatofitoses, piodermites, granulomas eosinofílicos, hiperplasias e cistos, fístulas, flogoses, protozooses, dermóides, distiquíase e neoplasias benignas ou malignas; dentre estas, as neoplasias da cavidade oral e nasal, palpebrais, superfície corneana, cutâneas e/ou de tecidos moles e perianais (LANE, 1974; GREINER, LISKA e WITHROW, 1975; WITHROW, GREINER e LISKA, 1975; GOLDESTEIN e HESS, 1976; KRAHWINKEL, MERKLEY e HOWARD, 1976; BOJRAB, 1978; WILLEMSE e LUBBERINK, 1978; GOLOUBEFF e OLIVEIRA, 1999; LUCAS, 1999; LUCAS e LARSSON, 2002, LUCAS, 2004; QUEIROZ, 2004; QUEIROZ e MATERA, 2004; SILVA et al., 2006; HOLMBERG, 2007; SILVA et al., 2007; THOMSON, 2007; QUEIROZ, MATERA e DAGLI, 2008; SAGLAM e KAYA, 2008; EURIDES et al., 2009; FEATHERSTONE et al., 2009). Em 1989, Wheeler, Blanchard e Davidson, trataram cinco cães que apresentavam ceratoconjuntivite proliferativa com criocirurgia e obtiveram sucesso em todos os animais.

52 Embora pouco comum, mas viável, Abrams-Ogg e colaboradores (1993) e posteriormente, Blois e Holmberg (2008), trataram gatos com acromegalia secundária a tumor de hipófise, realizando criohipofisectomia transfenoidal. No primeiro relato, apesar da criocirurgia ter sido um sucesso, após dois meses o animal ficou dependente de altos níveis de insulina, apresentou quadros de epilepsia e cegueira, perda da propriocepção e o comportamento do animal foi se tornando cada vez pior, sendo eutanaziado após nove meses da criocirurgia. Já Blois e Holmberg conseguiram o sucesso na criohipofisectomia e na sobrevida, pois decorrentes 18 meses do tratamento, o animal não apresentava sinais de diabetes e nem de acromegalia, e com boa qualidade de vida. 2.9 CONTRAINDICAÇÕES DA CRIOCIRURGIA Há poucas contraindicações absolutas, elas incluem a urticária induzida pelo frio, crioglobulinemia, criofibrinogenemia, presença de criofibrinogênio no sangue, um tipo anormal de fibrinogênio encontrado raramente no plasma que é precipitado por resfriamento e redissolve-se quando aquecido à temperatura ambiente (THAI e SINCLAIR, 1999). Alguns tipos de tumores não devem ser congelados. É preciso ter cautela no tratamento dos mastocitomas, principalmente nos maiores, pois os mastócitos lisados pelo congelamento degranulam, liberando histamina, heparina e outras aminas vasoativas, o que pode levar a um choque hipotensivo (HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a). Dessa forma, segundo Minkowitz e colaboradores (1986), Macmahon e colaboradores (1992) e Pliego e colaboradores (2008), os tumores devem ser avaliados através de exames citopatológicos e histopatológicos e os métodos utilizados para obtenção de amostras de tecidos para estes exames são: punção por agulha fina (PAF), punção aspirativa por agulha fina (PAAF), biópsia com trocater ( core biopsy ) e biópsia excisional. Os tumores que apresentam grande envolvimento ósseo não respondem bem e provavelmente não devem ser tratados por criocirurgia. O baixo teor hídrico do osso cortical o torna um mal condutor de frio, e é difícil congelar de modo efetivo o osso

53 esponjoso altamente vascular. O congelamento do osso cortical destruirá seus elementos celulares e reduzirá sua resistência em até 70%. É possível que ocorra fraturas espontâneas em osso congelado meses após o tratamento. Pode resultar embolia de nitrogênio quando este é pulverizado na forma líquida diretamente em osso esponjoso. O nitrogênio forçado nos seios venosos evapora e pode passar para o ventrículo direito, causando parada cardíaca (GAGE et al., 1966; HOLMBERG, 2007; WITHROW, 2007a). Os tumores intranasais grandes não devem ser congelados, isto porque um congelamento agressivo nesta região irá frequentemente resultar em perda do osso palatino e criará fistulas oronasais (WITHROW, 2007a). As tumorações que englobam a circunferência anal ou qualquer outro orifício do corpo, não devem ser congeladas nos seus 360º, pelo perigo de produzir uma estrutura fibrótica no lúmen (WITHROW, 2007a). Embora sejam resistentes à lesão permanente pelo congelamento, os grandes vasos sanguíneos e nervos podem ser destruídos por necrose e perda de tecidos adjacentes. Os grandes vasos que passam pelos tecidos-alvos devem ser ligados além dos limites de congelamento para prevenir hemorragias quando a crosta cair (HOLMBERG, 2007). 2.10 VANTAGENS E DESVANTAGENS DA CRIOCIRURGIA A técnica de criocirurgia é um tratamento relativamente rápido, normalmente de fácil aplicação, de baixo custo de manutenção e segura, pois diminui o tempo de anestesia, o que é uma grande vantagem em animais idosos. É menos invasivo e apresenta menor morbidade quando comparada com a intervenção cirúrgica, podendo ser utilizado em lesões em áreas da pele onde não há tecido suficiente para aproximar, ou em lesões grandes, onde não é possível o fechamento com uma sutura (GOLDSTEIN e HESS, 1976; BOJRAB, 1978; KUFLIK, 1994; HOFFMANN e BICHOUF, 2002; QUEIROZ e MATERA, 2004; WITHROW, 2007a). A criocirurgia tem vantagens sobre um procedimento cirúrgico convencional. Uma excisão cirúrgica pode requerer uma maior recuperação pós-operatória, ocorrência

54 de dor no local no procedimento cirúrgico, irritação ao longo da linha de sutura, hemorragia durante a operação, infecção e deiscência. Associado a esses fatores, o manejo de neoplasias malignas durante o procedimento cirúrgico convencional pode precipitar a disseminação de metástases e não se tem conhecimento de que o procedimento cirúrgico convencional evoque algum benefício imunológico (LANE, 1974). A possibilidade de uma resposta imunológica positiva após um procedimento criocirúrgico é uma das principais linhas de pesquisas nesta área atualmente. Como já foi discutido anteriormente, há respostas positivas, nulas e até mesmo respostas negativas dependendo de alguns fatores: quantidade de tecido congelado, tipo celular, técnica empregada (tempo de congelamento e descongelamento, ciclos empregados, material adequado) e a própria resposta individual (URANO, 2003; YIU et al., 2007; GAGE, BAUST e BAUST, 2009; SABEL, 2009; SIDANA e RODRIGUEZ, 2009; NISHIDA et al., 2011). Dentre as desvantagens, podemos incluir o custo inicial do equipamento, que atualmente, uma pistola de nitrogênio líquido com poucas ponteiras, custa por volta de R$2,700 reais e um botijão de 20 litros para o armazenamento do nitrogênio em torno de R$3,000 reais. Entretanto, esse custo pode ser compensado na menor utilização de anestésico e no menor tempo do procedimento. Dependendo do número de procedimentos realizados semanalmente, a perda de nitrogênio líquido pela evaporação pode ser um inconveniente. Não é um procedimento cirúrgico limpo, pois a formação de crosta é visualmente ruim e o cheiro pode ser desagradável, mas se o proprietário é avisado previamente sobre essas condições, poucas reclamações surgirão (GREINER, LISKA e WITHROW, 1975; KUFLIK, 1994; QUEIROZ e MATERA, 2004; WITHROW, 2007a). Outra desvantagem é a dificuldade de se obter uma margem adequada devido à dificuldade de ser conseguir profundidade suficiente de congelamento. Para a maioria das lesões tratadas com criocirurgia (pequenas, benignas e sem tratamento prévio), este não será um problema crucial, mas poderá permitir um tempo indesejável entre um tratamento incompleto e a recidiva da tumoração (WITHROW, 2007a).

55 O tempo de cicatrização em relação a um procedimento cirúrgico normal é maior, pois a cicatrização ocorre por segunda intenção, com formação do tecido de granulação por baixo da crosta, porém, o tecido cicatricial é mais liso e de aspecto visual melhor. Na cicatrização pode gerar o crescimento de pelos brancos na periferia da lesão e áreas de alopecia na região central (KUFLIK, 1994; WITHROW, 2007a). 2.11 TUMORES CUTÂNEOS Tumores da pele e do tecido subcutâneo são os tumores mais comuns que afetam cães, ocorrendo aproximadamente em um terço de todos os tumores encontrados nesta espécie (KRAEGEL e MADEWELL, 2004; MORRIS e DOBSON, 2007b; VAIL e WITHROW, 2007; NORHT e BANKS, 2009b). Aproximadamente dois terços dos tumores de pele em cães são nódulos únicos, de natureza benigna, e se originam do epitélio ou das estruturas anexas, como as glândulas sebáceas e sudoríparas, além dos folículos pilosos (RODASKI e WERNER, 2009). Logo, cerca de 20% a 40% dos tumores cutâneos e subcutâneos primários são histologicamente malignos no cão (VAIL e WITHROW, 2007; NORHT e BANKS, 2009b). As dez neoplasias de pele mais frequentemente diagnosticadas em cães, baseado em uma pesquisa com mais de 6000 casos em quatro continentes, incluem: mastocitomas, adenomas hepatóides, lipoma, adenomas sebáceos, histiocitoma, carcinoma de células escamosas, melanoma, fibrossarcoma, tumor de células basais e hemangiopericitoma (VAIL e WITHROW, 2007). A incidência dos diferentes tipos de tumores cutâneos varia conforme a idade, a raça e o sexo (RODASKI e WERNER, 2009). Chalita (2001) em um estudo no município de São Paulo com 213 cães portadores de neoplasias cutâneas e de partes moles observaram que as raças mais acometidas foram os animais sem raça definida (34,5%), Boxer (9,9%), Poodle (8,4%), Pastor Alemão (7,0%) e Cocker Spaniel Americano (5,5%). Já Sakuma, Matera e Valente (2003) em um estudo com 25 animais sobre a aplicação clínica do retalho cutâneo pediculado em cirurgia oncológica no cão, 36% eram sem raça definida, 20% Poodle, 12% Boxer, 12% Dobermann e as outras raças que representavam 4% incluíam: Afghan Hound, Fox Paulistinha, Husky Siberiano,

56 Pastor Alemão e Pequinês. De forma semelhante, Silveira e colaboradores (2006), avaliaram 100 animais portadores de neoplasias cutâneas e as raças mais acometidas foram: 36% sem raça definida, 14% Poodle, 13% Pastor Alemão, 8% Boxer, além disso, as fêmeas foram mais acometidas (57%) e em relação à idade, 75% apresentavam idade maior ou igual a seis anos. Etiologias específicas foram provadas apenas para alguns tumores no cão e gato. Embora a etiologia dos tumores cutâneos provavelmente seja multifatorial e em grande parte desconhecida, as investigações atuais têm lançado alguns esclarecimentos sobre o assunto. Vários fatores que contribuem para o desenvolvimento de tumores de pele incluem fatores físicos (por exemplo, radiação e lesões térmicas), influências genéticas e moleculares, hormônios, vacinas, vírus e influências imunológicas (VAIL e WITHROW, 2007; RODASKI e WERNER, 2009). Em relação à classificação patológica, devido à heterogeneidade das estruturas que constituem a pele, o tecido subcutâneo e os anexos, as neoplasias cutâneas podem ser divididas em duas amplas categorias. São os tumores primários de pele e tecido subcutâneo e as neoplasias secundárias constituídas pelas metástases de pele (RODASKI e WERNER, 2009). Histologicamente, os tumores cutâneos são classificados em neoplasias epiteliais, de células mesenquimais, de células redondas e de melanócitos (VAIL e WITHROW, 2007; RODASKI e WERNER, 2009). O diagnóstico é baseado no histórico e no exame físico detalhado. Todo o tumor deve ser examinado em relação ao seu tamanho, localização, consistência, mobilidade (aderido ou não) e se há presença de úlcera. Para lesões múltiplas, é fundamental o diagnóstico diferencial de outras alterações dermatológicas como as lesões hiperplásicas, granulomatosas, inflamatórias e imunomediadas (VAIL e WITHROW, 2007; NORHT e BANKS, 2009b; RODASKI e WERNER, 2009). Uma das maneiras mais fáceis e baratas para se fazer isso é por meio do exame citológico. Teoricamente, todas as tumorações cutâneas deveriam ser avaliadas citologicamente para um melhor planejamento do tratamento. Vários tipos de tumores são facilmente identificados na citologia, assim como o mastocitoma bem diferenciado e o melanoma. A citologia muitas vezes permite a diferenciação de tumores epiteliais do

57 tecido conjuntivo, no entanto, ainda é necessário o treinamento especial para a subclassificação de muitos desses tumores. O exame citológico de linfonodos regionais deve ser realizado antes do tratamento definitivo. O praticante deve ter em mente que os tumores ulcerados ou inflamados podem causar linfadenopatia reativa sem a presença de metástase (VAIL e WITHROW, 2007; NORHT e BANKS, 2009a). O exame histológico de um tumor suspeito ou conhecido é extremamente importante para o planejamento do tratamento e elaboração de um prognóstico. O exame histológico de uma tumoração excisada permite que o patologista determine o grau de malignidade e invasão, e se a excisão cirúrgica foi adequada. O tipo de procedimento de biópsia utilizado é ditado pelo tamanho e localização do tumor. Um tumor pequeno em um local facilmente acessível, que é passível de margens cirúrgicas adequadas geralmente é tratado por biópsia excisional. É importante encaminhar toda a amostra para o exame histopatológico e análise de margem. Para tumores grandes ou em locais que não permitam fácil excisão com margens amplas (por exemplo, uma extremidade), uma punção ou biópsia incisional deve ser realizada para permitir o planejamento terapêutico ideal. Deve-se realizar uma biópsia incisional em lesões de pele pequenas, planas ou em forma de placas, antes de serem rigorosamente preparadas ou limpas para assegurar que a superfície esteja intacta para a avaliação histopatológica (VAIL e WITHROW, 2007). 2.11.1 Adenomas sebáceos Adenomas sebáceos têm uma preponderância de sebócitos com poucas células basais de reserva e dutos, enquanto adenomas sebáceos ductais têm uma preponderância de dutos com menos sebócitos e células basais de reserva. O epitelioma sebáceo é de baixo grau de malignidade, e há uma preponderância de células basais de reserva com menos sebócitos e dutos. A linha divisória entre esses tumores pode ser muito arbitrária (GOLDSCHMIDT e HENDRICK, 2002). Estes tumores são muito comuns nos cães, incomuns nos gatos e raros em outras espécies domésticas (GOLDSCHMIDT e HENDRICK, 2002). Eles aparecem

58 como verrugas e muitas vezes são pedunculados e frequentemente ocorrem em múltiplos locais (NORTH e BANKS, 2009b). Os tumores de glândula sebácea (epitelioma sebáceo, adenoma e adenocarcinoma sebáceo e hiperplasia sebácea) são os tumores cutâneos mais comuns no cão e ocorre entre 6,8% e 7,9% de todos estes tumores (VAIL e WITHROW, 2007; RODASKI e WERNER, 2009). Os cães com idade entre oito e 13 anos são os mais acometidos e as médias relatadas são de 9,1 a 9,5 anos (GOLDSCHMIDT e HENDRICK, 2002; VAIL e WITHROW, 2007; RODASKI e WERNER, 2009). Em relação à predisposição racial, Goldschmidt e Hendrick (2002), demonstraram que o Cocker Spaniel Inglês apresenta a maior incidência com 4,2%, seguido por: Cocker Spaniel Americano (3,9%), Samoieda (2,8%), Husky Siberiano (2,8%), Cock-a-poo (2,6%), Malamute do Alasca (2,2%), West Highland White Terrier (2,0%), Caim Terrier (1,9%), Dachshund (1,9%), Poodle miniatura (1,7%), Poodle toy (1,6%), Shih Tzu (1,5%), as outras raças são menos acometidas. Entretanto, Vail e Withrow (2007), descrevem como mais predispostas as raças: Schnauzers miniatura, Beagles, Poodles e Cocker Spaniels. De forma semelhante, North e Banks (2009b) e Rodaski e Werner (2009), reportam que as raças mais acometidas são os Cocker Spaniels e os Poodles. Os adenomas sebáceos são lesões tipicamente solitárias localizadas, em geral, na cabeça e nas pálpebras e apresentam diâmetro variando de três mm a dois cm. O aspecto macroscópico do adenoma sebáceo é nodular, exofítico, alopécico, algumas vezes de superfície irregular (papiliforme) e pode apresentar ulceração e infecção secundária. Ao corte, esta neoplasia exibe consistência macia a firme, coloração branca-amarelada, aspecto irregular compacto com pequenos lóbulos separados por discreto tecido conjuntivo fibroso. Já em relação ao aspecto histológico, é nodular, intradérmico, expansivo, bem delimitado, podendo ser revestido por pseudocápsula fibrosa. É formado por múltiplos lóbulos compostos de sebócitos, na maioria, maduros bem diferenciados. Não se evidencia sinais de atipia celular (GOLDSCHMIDT e HENDRICK, 2002; RODASKI e WERNER, 2009).

59 2.12 ANESTESIA LOCAL Anestésico local é toda a substância que aplicada em concentração adequada, bloqueia de maneira reversível a condução nervosa (MASSONE, 2011). Existem várias técnicas anestésicas locais, como por exemplo, as tópicas, as infiltrativas que podem ser: intradérmica, subcutânea e profunda, além das anestesias perineurais, espinhais, intravenosas (Bier) e intra-articulares (FANTONI, CORTOPASSI e BERNARDI, 2006; FUTEMA, 2010; MASSONE, 2011). Estas técnicas oferecem boas alternativas para anestesias cirúrgicas, principalmente em casos de animais que apresentam algum fator de risco aos anestésicos inalatórios ou intravenosos. A anestesia local oferece vantagens, como baixa toxicidade, baixo custo, redução das doses dos demais fármacos utilizados na anestesia, recuperação mais rápida e com analgesia residual (MAMA e STEFFEY, 2003; NATALINI, 2007; FUTEMA, 2010; MASSONE, 2011). A anestesia infiltrativa pode ser produzida mediante múltiplas injeções intradérmicas, subcutâneas e/ou intramusculares, infiltrando-se o anestésico lentamente ao longo do local onde deverá ser a incisão e na periferia deste. Após três a cinco minutos decorrida a injeção, a região deverá estar dessensibilizada (FUTEMA, 2010). A lidocaína é uma amida derivada da xilidina, aproximadamente duas vezes mais potente e mais tóxica quando comparada à procaína. Tem meia vida em torno de 90 minutos (MALAMED, 2001; MASSONE, 2011). É o anestésico local mais utilizado e as concentrações geralmente empregadas são de 1 a 2%, considerando que as doses máximas permitidas são de 7mg/Kg sem epinefrina e 9mg/Kg com epinefrina (MAMA e STEFFEY, 2003; FANTONI, CORTOPASSI e BERNARDI, 2006; NATALINI, 2007; FUTEMA, 2010; MASSONE, 2011). Os anestésicos locais do tipo amida são metabolizados pelo fígado, assim devem ser utilizados com cuidado, especialmente em doses repetidas, em pacientes com hepatopatias. Reações adversas sistêmicas graves são raras, mas podem ocorrer na superdosagem ou se houver injeção intravascular acidental. A acidose acentuada ou hipóxia podem aumentar o risco e a gravidade das reações tóxicas (MALAMED, 2001; MASSONE e CORTOPASSI, 2010).

60 A epinefrina, considerada um potente vasoconstritor, é um poderoso agonista dos receptores alfa e beta adrenérgicos, de modo que seus efeitos sobre os órgãosalvo são complexos e geralmente variam com a densidade de inervação adrenérgica (MYERS, et al., 1986). Geralmente associada aos anestésicos locais, a epinefrina (1:200.000) reduz a velocidade de absorção destes em 30%, devido a vasoconstrição, e ajuda a manter altas concentrações de anestésico nas fibras nervosas, aumentando assim o seu efeito e duração de ação até 50%. Os anestésicos locais, contendo epinefrina, não devem ser injetados em extremidades (dedos, rabo) devido ao risco de grave vasoconstrição, isquemia local e necrose. A epinefrina aumenta os riscos de arritmias cardíacas (taquicardia sinusal, taquicardia ventricular e, ainda, fibrilação ventricular em corações sensibilizados por halotano). No entanto, quando é administrada associada com a lidocaína, não se verificam essas alterações em cães, mesmo em animais suscetíveis a essas arritmias (MALAMED, 2001; FUTEMA, 2010; MASSONE e CORTOPASSI, 2010).

61 3 OBJETIVOS Avaliar a influência do bloqueio anestésico local empregando lidocaína com epinefrina nos tempos de congelamento e descongelamento da criocirurgia de adenomas sebáceos em cães, utilizando a técnica de spray aberto, em comparação ao uso do bloqueio anestésico local de lidocaína sem epinefrina, em cada um dos dois ciclos de congelamento / descongelamento. Avaliar a influência da repetição de um segundo ciclo nos tempos de congelamento e descongelamento na criocirurgia de adenomas sebáceos em cães, utilizando a técnica de spray aberto.

62 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 LOCAL DE REALIZAÇÃO O experimento foi realizado com os pacientes do Hospital Universitário de Medicina Veterinária Professor Firmino Mársico Filho da Universidade Federal Fluminense (HUVET-UFF), de março de 2010 até maio de 2012. 4.2 PACIENTES E AVALIAÇÃO CITOLÓGICA O projeto foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/PROPPi/UFF), sob o protocolo n o 0203/10. Foram selecionados nove animais, da espécie canina, com idade entre seis e 16 anos, sendo quatro machos e cinco fêmeas, de raças distintas, que apresentavam tumorações cutâneas num total de 34 adenomas sebáceos. Em todos os pacientes foi realizado o exame de citologia por PAF para o direcionamento do diagnóstico. Os animais incluídos apresentavam o resultado de adenoma sebáceo no exame citológico. O diagnóstico definitivo foi obtido pela histopatologia após a realização de biópsia incisional com punch pré-congelamento.

63 4.2.1 Grupos Os adenomas sebáceos foram separados aleatoriamente em dois grupos de acordo com o tipo de bloqueio anestésico empregado. Desta forma, no grupo 1 realizou-se bloqueio anestésico local com lidocaína com epinefrina e no grupo 2, sem epinefrina. Para cada adenoma sebáceo, realizou-se dois ciclos de congelamento / descongelamento, portanto, como foram congelados 34 tumorações, um total de 68 ciclos foram executados, divididos dentro dos grupos da seguinte maneira: Grupo 1, 17 ciclos iniciais (1º ciclo) seguindo-se de 17 repetições (2º ciclo); Grupo 2, da mesma forma que o grupo 1. O segundo ciclo de congelamento / descongelamento foi realizado logo após o término do descongelamento natural do primeiro ciclo quando a temperatura ultrapassava o zero grau, indicado pela coloração azul do laser. 4.2.2 Critérios de inclusão e exclusão dos adenomas sebáceos As lesões foram analisadas quanto ao seu aspecto macroscópico e mensuradas por meio de paquímetro digital. O número mínimo para inclusão foi de um par, podendo chegar até a três pares por animal, dependendo do peso. Os adenomas sebáceos selecionados continham entre 4,10 e 9,00mm de diâmetro, para que desta forma, não houvesse uma variação muito grande da massa tumoral e pudesse ser utilizado o assessório delimitador Cryoplate. Quanto à localização, foram excluídos os adenomas sebáceos que se encontravam nas regiões de extremidades dos membros e cauda, devido ao bloqueio anestésico com vasoconstritor, que poderia gerar isquemia nestas regiões. Além disso, as tumorações da cabeça também não foram incluídas, neste caso, para que se tivesse uma melhor homogeneidade de tecidos. Em cada par foi realizado um tratamento do grupo 1 e um tratamento do grupo 2. Desta forma, eliminou-se inúmeros fatores extrínsecos, pois se utilizou adenomas sebáceos do mesmo animal. Este número de pares foi limitado devido ao volume de anestésico local necessário para a realização do

64 procedimento, respeitando as dosagens referidas na literatura de 7mg/kg e 9mg/kg de lidocaína sem e com epinefrina, respectivamente. Todos os dados dos pacientes foram anotados em ficha propedêutica desenvolvida para este estudo, incluindo o número, o tamanho e a localização das tumorações que foram marcadas na resenha (anexo). 4.2.3 Avaliação dos pacientes pré-tratamento A condição clínica dos animais foi avaliada por exames clínico (palpação, auscultação, percussão e aferição de temperatura retal), laboratorial (hemograma completo com pesquisa de hemocitozoários e bioquímicas: Alanina aminotransferase, Fosfatase Alcalina, Uréia, Creatinina, Glicose, Proteínas Totais e frações), de imagem (Radiografia torácica em duas posições: Ventro-dorsal e Lateral esquerda) e auxiliares (eletrocardiograma). Estes exames se fizeram necessário, visto que todos os pacientes do projeto eram adultos com mais de seis anos ou idosos e foram submetidos à anestesia geral. 4.2.4 Protocolo anestésico A equipe de anestesia do HUVET-UFF, após avaliar as condições clínicas particulares de cada paciente, elaborava o protocolo anestésico que incluía a medicação pré-anestésica, indução e manutenção, para a realização da anestesia geral inalatória. Todos os animais foram monitorados antes, durante e após o procedimento anestésico (FANTONI e CORTOPASSI, 2010). Os bloqueios anestésicos locais foram efetuados com lidocaína a 2% com epinefrina 1:200.000 e sem epinefrina de acordo com os grupos, 1 e 2, realizando a técnica de botão anestésico (para biópsias) descrita por Massone (2011), na qual utiliza-se o anestésico local de forma infiltrativa no subcutâneo, abaixo da lesão a qual será realizado o procedimento. Para cada adenoma sebáceo, o volume de anestésico local foi de 0,5 ml.

65 4.2.5 Realização de biópsia Após tricotomia e antissepsia da região da tumoração, foi verificada a temperatura superficial da mesma com termômetro digital infravermelho do próprio aparelho de criocirurgia. Seguiu-se com bloqueio anestésico local de acordo com cada grupo e nova aferição da temperatura da tumoração após cinco minutos. Logo após, foi realizada a biópsia com punch de quatro mm, onde metade incluía tecido normal e a outra metade a tumoração (Figura 7). O material colhido foi colocado em microtúbulos contendo formol tamponado a 10% imediatamente após a coleta para posterior processamento e inclusão em parafina, sendo corado em hematoxilina-eosina (HE) e analisado histopatologicamente. Fonte (A): http://www.cirurgicasaopaulo.com.br Figura 5: Punch de mesmo modelo utilizado no estudo (A). Realização da biópsia com punch de quatro mm, logo antes da realização do primeiro ciclo de criocirurgia (B). HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. 4.2.6 Aparelho de criocirurgia Para a realização de todos os procedimentos de criocirurgia deste estudo, foi utilizado o aparelho Tracker (Figura 5) com a ponteira aberta C de 0,57mm da Cry- Ac (Brymill Co), com nitrogênio líquido como criógeno, além do delimitador Cryoplate (Figura 6), da mesma marca. Este aparelho emite um laser que possui três tipos diferentes de coloração de acordo com a temperatura que está sendo aferida. Desta forma, a cor azul indica que a temperatura está acima de 0ºC, a cor verde indica que a

66 temperatura está entre 0ºC e a temperatura delimitada pelo operador, que no caso foi - 30ºC. Por fim, a cor vermelha, que indica quando esta temperatura delimitada foi ultrapassada. Figura 6: Aparelho de criocirurgia Tracker (A). Em (B), tela indicadora da temperatura atual (-37), com a temperatura mínima determinada pelo operador (Tmin = -43ºC) e o tempo em segundos (1) após ultrapassar o Tmin. Em (C, D e E) variações da cor do laser de acordo com a temperatura registrada. Fonte: www.cryac.com.br/produtos_tracker.html Figura 7: Delimitador Cryoplate da Cry-Ac contendo quatro cones, com orifícios de 4, 6, 9 e 12 mm (A). Aplicação do Cryoplate durante um dos procedimentos criocirúrgicos deste estudo. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012 (B).

67 4.3 CRIOCIRURGIA A técnica de criocirurgia aplicada foi a do spray aberto. Para este procedimento realizado em seguida da biópsia, foi avaliado o tempo de congelamento direto por aferição da temperatura superficial do centro da lesão com termômetro digital infravermelho do próprio aparelho de criocirurgia até ser atingido -30ºC. Para isto, a ponteira da pistola de nitrogênio líquido ficou sempre perpendicular à lesão, num ângulo de 90º, a uma distância de dois cm da superfície do adenoma sebáceo, com o jato de spray aplicado na região central do mesmo. Como o tempo de congelamento era muito curto, esta etapa foi filmada com câmera digital e o tempo preciso foi avaliado posteriormente com a utilização do programa de computador Windows Live Movie Maker, que permitia a marcação do tempo no momento exato do início do congelamento até que a cor do laser mudasse de verde para vermelho, indicando que a temperatura de -30ºC foi ultrapassada (Figura 8). Figura 8: Sequência de fotos extraídas de uma das filmagens do período de congelamento direto. Observar a mudança nítida de coloração do laser. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. Após isso, a lesão foi mantida congelada abaixo de -30ºC (-35 a -70ºC) pela utilização de jatos intermitentes de nitrogênio líquido durante dois minutos (congelamento) sempre com aferição mútua e constante da temperatura durante este período. Logo após o congelamento, foi cronometrado o tempo de descongelamento natural que foi monitorado com o termômetro digital infravermelho até que houvesse a mudança da cor verde para a cor azul do laser, indicando que a temperatura ultrapassou os zero graus (descongelamento). Este processo foi repetido para cada um

68 dos dois ciclos de congelamento / descongelamento que foram realizados em cada adenoma sebáceo. Após a criocirurgia, o tecido congelado necrosava e formava uma crosta que servia como proteção para o processo cicatricial que ocorre por segunda intenção. 4.4 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS Como parte do pós-operatório os animais foram medicados com o antinflamatório não-esteroidal e analgésico meloxicam na dose de 0,1mg/kg, por via oral, a cada 24 horas, durante três dias. O antibiótico utilizado foi a cefalexina, na dose de 25mg/kg, por via oral, a cada 12 horas, durante 7 dias. Além disso ainda foi utilizado o antibiótico tópico rifamicina na forma de spray, a cada 12 horas, até total cicatrização. 4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA Além da estatística descritiva básica (média, desvio padrão, máximo e mínimo) para todos os dados deste trabalho, também foi realizado o teste t de Student a partir da técnica de pareamento do método de comparação de pares. De acordo com Sampaio (1998), um intervalo típico de confiança em experimentação animal é de 95% ou seja, probabilidade de erro de 0,05% (P<0,05). No caso de pesquisas em Medicina Humana, utiliza-se um intervalo de confiança de 99,9%, ou seja, 0,01% de erro. Logo, para todos os dados deste estudo foi utilizado P<0,05.

69 5 RESULTADOS Dos nove cães estudados, a idade variou entre seis e 16 anos (média de 10,9 anos), sendo quatro machos (44,44%) e cinco fêmeas (55,55%), de raças distintas, entre elas: quatro Poodles (44,44%), três Cocker Spaniels Inglês (33,33%), um Yorkshire (11,11%) e um Bull Terrier (11,11%). Os animais apresentavam 34 adenomas sebáceos, com tamanhos variando de 4,10mm a 9,00mm, totalizando 17 pares (Tabela 1). Tabela 1: Tamanho dos adenomas sebáceos em milímetros, de acordo com os grupos e seus respectivos pares. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. Número do Par Grupo 1 Grupo 2 1 6,10 5,00 2 5,90 8,20 3 5,20 5,30 4 4,90 5,10 5 6,80 5,10 6 5,90 4,30 7 5,30 9,00 8 5,00 6,60 9 7,60 4,90 10 5,00 5,10 11 8,50 4,20 12 4,90 4,10 13 4,10 5,20 14 4,60 5,10 15 5,42 6,43 16 6,57 6,49 17 4,62 6,97 Média 5,67 5,71 Desvio Padrão 1,15 1,38 Máximo 8,50 9,00 Mínimo 4,10 4,10

70 As temperaturas dos adenomas foram mensuradas com termômetro digital do próprio aparelho de criocirurgia, após a antissepsia e cinco minutos após o bloqueio anestésico local de acordo com o grupo 1 e o grupo 2 (Tabela 2). Tabela 2: Temperatura dos adenomas sebáceos após a antissepsia e cinco minutos após o bloqueio anestésico de acordo com os grupos 1 e 2. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. Número do Par Após antissepsia Grupo 1 Grupo 2 Após cinco min. bloqueio anestésico Após antissepsia Após cinco min. bloqueio anestésico 1 29 28 30 28 2 33 29 33 31 3 33 32 34 33 4 32 32 33 32 5 33 31 31 30 6 30 29 33 31 7 30 28 32 31 8 33 30 34 31 9 32 32 33 31 10 33 30 34 30 11 32 31 30 30 12 30 29 30 29 13 32 30 32 29 14 32 31 31 31 15 30 32 29 30 16 29 30 31 33 17 31 29 31 33 Média 31,41 30,18 31,82 30,76 Desvio Padrão 1,46 1,38 1,59 1,44 Máximo 33,00 32,00 34,00 33,00 Mínimo 29,00 28,00 29,00 28,00 Considerando-se a probabilidade de erro inferior a 0,5% (P<0,05), o t calculado para o grupo 1 (tc1 = 3,441) e para o grupo 2 (tc2 = 2,605) foram maiores do que o t tabelado (tt = 2,120), logo houve redução significativa da temperatura dos adenomas sebáceos após cinco minutos dos bloqueios anestésicos. Mas se considerarmos P<0,01, o t tabelado passa a ser maior (tt = 2,921) do que o t calculado para o grupo 2, indicando que somente no grupo 1 houve redução significativa da temperatura após o bloqueio anestésico local. O tempo de congelamento direto dos adenomas sebáceos até que se registrasse a temperatura de -30ºC foi marcado no 1º e 2º ciclo, tanto para o grupo 1 como para o

grupo 2 (Tabela 3). Para melhor visualização e comparação, estes dados foram expostos graficamente de acordo com os grupos (Figura 9). 71 Tabela 3: Tempo em segundos do congelamento direto dos adenomas sebáceos até a temperatura de - 30ºC tanto no 1º e 2º ciclo dos grupos 1 e 2. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012. Número do par Grupo 1 Grupo 2 1 Ciclo 2 Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 1 6,45 3,88 5,15 2,99 2 4,21 3,44 8,24 5,31 3 1,51 1,38 2,88 2,11 4 3,00 2,07 1,25 1,01 5 2,00 0,97 3,88 2,70 6 3,41 1,00 2,75 1,02 7 6,59 2,40 7,12 8,95 8 4,28 2,51 3,78 1,61 9 2,03 1,62 5,18 6,60 10 2,23 2,41 1,31 2,5 11 2,07 1,80 1,19 1,24 12 1,04 0,80 1,31 2,98 13 1,50 0,87 2,55 1,82 14 3,36 1,80 2,38 0,89 15 2,05 1,28 2,78 1,19 16 1,90 1,16 1,84 2,06 17 1,50 0,94 1,78 0,93 Média 2,89 1,78 3,26 2,70 Desvio Padrão 1,66 0,91 2,09 2,24 Máximo 6,59 3,88 8,24 8,95 Mínimo 1,04 0,80 1,19 0,89 Figura 9: Gráficos do tempo em segundos do congelamento direto dos adenomas sebáceos até a temperatura de -30ºC tanto no 1º e 2º ciclo dos grupos 1 e 2. HUVET-UFF, Niterói RJ, 2012.