Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS MICROSSATÉLITES: ORIGEM, EVOLUÇÃO E PAPEL NO GENOMA DOS EUCARIOTOS Aluna:Helen Alves Penha Orientadora: Maria Lucia Carneiro Vieira Departamento de Genética Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Para a maioria das espécies, apenas uma parte do genoma consiste de genes que codificam proteínas. O restante do genoma era considerado como DNA lixo e nesta parte incluíam-se os microssatélites. Microssatélites: DNA lixo??? Entretanto, recentes estudos vêm demonstrando que diversas funções estão relacionadas àquelas sequências repetitivas, inclusive dentro de regiões codantes.
OBJETIVOS i) Demonstrar a natureza genética dos microssatélites; ii) Explicar sua gênese e mecanismos evolutivos; iii) Mostrar sua distribuição e principais funções.
NATUREZA GENÉTICA Seqüências simples repetidas - 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem. Amplamente distribuídos em genomas de eucariotos e alguns procariotos. Também conhecidos como: SSR (Simple Sequence Repeat) - Tautz, 1989. STR ( Short Tandem Repeats) - Edwards, 1991.
NATUREZA GENÉTICA Unidade repetitiva do microssatélite: Mononucleotídica: Di_ Tri_ Tetra_ Penta_ Hexa_ (G)n (GA)n (GAT)n (GATA)n (GATAC)n (GATACA)n
NATUREZA GENÉTICA Podem ser classificados como: Perfeitos:...CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT... Imperfeitos:...TGGTGTGTGTGTGTGTGTG...
NATUREZA GENÉTICA Interrompidos:...CTCTCTCTCTCCATGACCCTCTCTCT... Compostos:...GTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGA...
NATUREZA GENÉTICA Apresentam-se flanqueados por sequências únicas, podendo ser amplificados individualmente através de PCR. Possui comportamento CO-DOMINANTE os heterozigotos podem ser identificados.
NATUREZA GENÉTICA
NATUREZA GENÉTICA Marcadores: do desenvolvimento à utilização. Isolamento e caracterização das regiões de microssatélites em uma biblioteca; Construção de primers complementares às regiões flanqueadoras de microssatélites; Padronização da amplificação; Validar o loco, ou seja, amplificar o alelo esperado.
GÊNESE E EVOLUÇÃO Alto polimorfismo decorrente das altas taxas de mutação presentes nestes locos.
GÊNESE E EVOLUÇÃO A taxa de mutação dos microssatélites está em torno de 10-6 a 10-2 por geração Alguns modelos que podem explicar estas altas taxas de mutação: Crossing-over desigual; Slippage durante a replicação; Elementos transponíveis Alu. (Schlotterer, 2000)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Crossing-over desigual :
Slippage durante a replicação: (Moxon e Wills, 1999)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Autores demonstraram que não ocorre slippage quando há poucas repetições. Há três evidências para isso: 1º - É mais comum a ocorrência de mutações slippage em loci com grandes repetições (Brinkmann et al 1998); 2º- Loci com menos de 5 repetições são raramente polimórficos (Strassman et al 1997); 3º- Quando ocorre mais repetições que o esperado, se espera maior taxa de slippage. Isso não foi observado em repetições menores do que 8 nucleotídeos (Rose e Falush 1998).
GÊNESE E EVOLUÇÃO Threshold model um número mínimo de repetições é necessário para que depois DNA slippage possa estender esse proto- microssatélite. (Rose e Falush, 1998)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Os microssatélite evoluem por um mecanismo similar ao slippage, começando com a duplicação de poucas bases, formando um proto-microssatélite de duas repetições. Mas como surgem estes proto-microssatélites? A partir de outros processos de mutação, como substituições e inserções. (Zhu et al, 2000)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Human Gene Database - usado para explorar as origens de repetições em tandem. Há duas vantagens em se estudar estas origens com esta base: 1- a sequência normal (não mutada) é conhecida, identificando se então deleções e inserções; 2- a base é grande e contém numerosas mutações em vários genes. Foram buscados mutações e possíveis formações de novas repetições em suas regiões flanqueadoras. (Zhu et al, 2000)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Foram checados todos os genes que continham alguma inserção de 2-4 pares de base. Usou-se um programa de computador para identificar quais substituições criaram repetições. (Zhu et al, 2000)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Substituições geram maior parte dos proto microssatélites, mas apenas uma pequena porcentagem geram novas repetições (16%) (Zhu et al, 2000)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Inserções responsáveis pela geração de novas repetições. (Zhu et al, 2000)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Um exemplo de resultado da expansão de um proto microssatélite: Filogenética de primatas: Ancestral: ATGTGTGT Mutação de G A (loco da η-globina) ATGTATGT (ATGT)n (ATGT) 5 - humanos (ATGT) 4 -macacos africanos (Messier et al, 1996)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Outro mecanismo para a geração de microssatélites: Família Alu SINEs (short interspersed elements) - candidata para contribuir na gênese dos microssatélites, devido a presença de regiões ricas em A no terminal 3 e no meio de sua seqüência. (Arcot et al, 1995)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Enquanto tal associação têm sido relatada para um grande número de organismos, uma alta densidade de elementos transponíveis nem sempre coincide com alta densidade de microssatélites. (Lin et al 1999)
GÊNESE E EVOLUÇÃO Fatores que contribuem a ocorrência de evolução dos microssatélites: 1-) Número de repetições; 2-) Tipo de repetição; 3-) Sequência flanqueadora; 4-) Recombinação. (Schlötterer, 2000)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Comparação de densidade de microssatélites por espécie: Arabidopsis thaliana Zea mays Tetraodon nigroviridis Homo sapiens (cromossomo 22) Caenorhabditis elegans Saccharomyces cerevisae 0,85% 0,37% 3,21% 1,07% 0,21% 0,30% (Morgante et al, 2002)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Mas os microssatélites aleatória? estão distribuídos de forma NÃO!!! Há padrões específicos de distribuição dos diferentes motivos repetidos nos diferentes tipos de seqüências: codantes, não codantes, íntrons e regiões intergênicas.
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Esses padrões ainda variam entre táxons, em termos da freqüência de microssatélites e de tipos de repetições preferenciais. Esta especificidade pode ser explicada, em parte, pela interação de mecanismos evolutivos através da seleção diferencial em regiões do genoma e em diferentes espécies.
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Comparação de número de repetições/ motivo de microssatélites em diferentes espécies: (Gupta et al, 2001)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em regiões diversas regiões do genoma: Arroz Arabidopsis (Fujimori et al, 2003)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em regiões diversas regiões do genoma: Humano Camundongo (Fujimori et al, 2003)
FUNÇÃO/EFEITOS DOS MICROSSATÉLITES: Organização da Cromatina Regulação dos processos Metabólicos do DNA Regulação da Atividade Gênica Organização Cromossômica Estrutura do DNA Centrômero Telômero Transcrição Sítio Alvo Protéico Transporte do RNAm Replicação do DNA Recombinação Mismatch Repair System MMS Ciclo Celular (Adaptado de Li et al, 2002)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em regiões codantes: (Morgante et al, 2002)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Exon Intron (Fujimori et al, 2003)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em éxons - doenças neurológicas Efeitos nas regiões codantes no fenótipo tem sido muito estudado somente em doenças humanas, revelando desordem neuronal e câncer. Expansão de repetições CAG em éxons produzem proteínas tóxicas mutantes que causam doenças humanas (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em éxons: doenças neurológicas (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em éxons: câncer (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em regiões 5 UTR: (Fujimori et al, 2003)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em regiões 3 UTR: Causa slippage na transcrição e produz RNAm expandido, interrompendo o splicing e outra função celular Exemplo: Distrofia miotônica tipo 1 (DM1) o RNAm mutante contém uma repetição expandida, que inibem a diferenciação de culturas de mioblastos, levando à distrofia muscular miotônica. (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em introns: elemento regulatório da transcrição gênica (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em introns: elemento regulatório da transcrição gênica (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em introns: elemento regulatório da transcrição gênica (Li et al, 2004)
DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO Microssatélites em introns: elemento co- regulatório da transcrição gênica (Li et al, 2004)
Pelas razões apresentadas, os microssatélites sendo utilizados em diversos estudos, como: Construção de mapas genéticos; vêm Associação de instabilidade entre o número de repetições e doenças humanas; Prático uso em estudos de estruturagenética populações; Análises de paternidade. de
Obrigada!!!