Introdução às Práticas Laboratoriais em Imunologia Prof. Helio José Montassier
Principais preparações antigênicas usadas em atividades experimentais em imunologia: Antígenos particulados: apresentam dimensão de uma célula e, ao se adicionar um diluente apropriado, forma-se uma suspensão. Ex: bactérias e células eucariontes, como hemácias (carneiro, galinha). Antígenos solúveis: apresentam dimensão de macro-molécula e, ao se adicionar um diluente apropriado, forma-se uma solução. Ex: proteínas (ovoalbumina, gamaglobulina) e polissacarídeos.
Tipos de diluentes:- Solução Salina (NaCl 0,15 M) PBS ou Tampão Fosfato com Salina (NaCl a 0,15M e Fosfatos Ácido e Básico de Sódio a 0,04 M)
Sangue colhido c/ anticoagulante e s/ centrifugar Sangue colhido c/ anticoagulante e centrifugado p/ separar a fração líquida do sobrenadante Sangue colhido s/ anticoagulante e depois de coagulado é centrifugado
Esquema de Componentes Ppais. e Ativação da Via de Coagulação do Sangue
PLASMA é o sobrenadante obtido após a centrifugação do sangue total, colhido em tubo com anticoagulante. Os anticoagulantes mais utilizados no laboratório clínico são : heparina, EDTA e Citrato de sódio. A heparina previne a coagulação pois liga-se à trombina, já o EDTA e o Citrato ligam-se ao Ca²+ e Mg²+, cuja interferência se dá nas enzimas cálcio e magnésio-dependentes envolvidas na cascata de coagulação. O citrato é utilizado em coletas de sangue para transfusão. SORO é o sobrenadante obtido após coleta de sangue total e deixado para coagulação espontânea (que leva de 30 a 45 minutos). Durante o processo de coagulação, o fibrinogênio é convertido em fibrina, é a clivagem proteolítica da trombina, e a sua maior diferença entre plasma e soro é a ausência de fibrinogênio no soro.
SOROLOGIA Imunologia e Sorologia:- Imunologia é o ramo da biologia que estuda o sistema imune. Funcionamento do sistema imune de um indivíduo (vertebrado) no estado sadio ou não. Características físicas, químicas e fisiológicas dos componentes do sistema imune.
SOROLOGIA Doenças diagnosticadas por técnicas imunológicos a partir do soro (+ frequente), do plasma (- frequente) ou do sangue total (- frequente):- Doenças Infecciosas Doenças autoimunes Reações de Hipersensibilidade (Alergias) Seleção de doadores de sangue (Imuno-hematologia) Seleção de doadores de órgãos ou tecidos para transplantes
SOROLOGIA Exames e técnicas laboratoriais para a detecção de anticorpos (+frequente) ou de antígenos (-frequente). ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) cinomose, peste suína clássica, toxoplasmose, etc. Reação de Imunofluorescência (RIF) leishmaniose, toxoplasmose, leptospirose, etc. Látex Aglutinação Detecção de Fator Reumatóide, Proteína C Reativa, rotavirus, coronavirus, etc. Rádio-Imuno-Ensaio Dosagem de hormônios.
Técnica de Diluições Seriadas Importância permitir a determinação das quantidades relativas de anticorpos em testes sorológicos
Técnica de diluições seriadas: -Séries com razão constante e diluições sucessivas. -Nesta técnica, transferem-se volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou quantidade adequada de diluente.
Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2:- 1) Distribuir numa série de tubos com 1 ml de diluente. 2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material. 3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2. 4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. 5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. Ao final as diluições obtidas serão: 1:2; 1:4; 1:8; 1:l6; 1:32; 1:64
Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a 10:- 1) Distribuir 0,9ml de diluente numa série de tubos. 2) Ao tubo 1 adicionar 0,1 ml do material não diluído. 3) Transferir 0,1 ml do tubo 1 para o tubo 2. 4) Transferir 0,1 ml do tubo 2 para o tubo 3. 5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1:100.000.
Problemas: - 1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800? 2. Como você procede para diluir um vírus de 10-3 a 10-8?
Perguntas:- 1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica de hemácias a 5%, sem fazer a aferição por espectrofotometria? 2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a 0,1%, num volume final de 5ml? 3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a obtenção de soros: a) Precipitantes b) Aglutinantes 4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições seriadas? 5. O que são: a) Solução anti-coagulante de Alsever b) Solução salina d) Soro c) Plasma e) Solução salina tamponada