ANÁLISE MORFOLÓGICA DO DESENVOLVIMENTO INICIAL IN VITRO DE CATASETUM MACROCARPUM RICH. (EX.KUNTH) ORCHIDACEAE Jack Wild P. Soares Junior 1 ; Kellen Lagares F. Silva 2 1 Aluno do Curso de Ciências Biológicas; Campus de Porto Nacional; e-mail: jackwild94@hotmail.com PIBIC/UFT 2 Orientador(a) do Curso de Ciências Biológicas; Campus de Porto Nacional; e-mail: lagares@uft.edu.br RESUMO As orquídeas representam um dos grandes grupamentos taxonômicos, especialmente entre as monocotiledôneas, apresentando características altamente especializadas e singulares. O cerrado se apresenta como um bioma bem heterogêneo, possuindo rica diversidade animal e vegetal, logo é de vital importância ecológica e econômica. Dentre as espécies de plantas nativas do cerrado, tem-se várias espécies de orquídeas, incluindo a espécie tratada nesse estudo, Catasetum macrocarpum. O gênero Catasetum Rich possui cerca de 70 espécies descritas, espalhadas por países da América do Sul e Central. As técnicas de cultivo in vitro têm sido extremamente convenientes no estudo de aspectos morfológicos e ecológicos de espécies vegetais, tanto por prover recursos que faltam no ambiente natural quanto pela facilidade de manipulação. Buscou-se neste estudo a compreensão de fenômenos e processos relacionados ao desenvolvimento da espécie alvo, bem como aspectos ecológicos tais quais o epifitismo e a associação com fungos micorrízicos, aspectos estes possíveis graças a adaptações, que são estudadas através das análises morfológicas e anatômicas. Dessa forma torna-se mais fácil a preservação da espécie. Palavras-chave: Cerrado; Protocormo; Plântula. INTRODUÇÃO A Família das Orquidáceas constitui cerca de 7% das Angiospermas, possui cerca de 800 gêneros e mais de 25 mil espécies, representando um dos grandes grupamentos taxonômicos, especialmente entre as monocotiledôneas (HEW & YONG, 1997; CHASE et al., 2003). O gênero Catasetum Rich conta com aproximadamente 70 espécies, distribuídas entre países das Américas do Sul e Central, sendo cerca de 200 gêneros e 2500 espécies encontradas no Brasil (PABST & DUNGS 1975, 1977) entre elas a espécie que será objeto de estudo no presente trabalho, Catasetum macrocarpum. Esta espécie é facilmente identificável por suas flores Página 1
estaminadas, não ressupinadas, labelo carnoso com lobo mediano indefinido, calosidade central entre os lobos laterais eretos e pétalas com máculas castanhas (BASTOS & VAN DEN BERG, 2012). O Cerrado, bioma bem heterogêneo, é de fácil adequação a várias espécies de orquídeas, além de possuir número significativo de espécies endêmicas (GIULIETTI, 2000). A maioria das orquídeas possui sementes praticamente imperceptíveis, com 0,005 a 6 mm de comprimento (ARDITTI, 1992). Os embriões constituem-se de pequenos corpos elipsoidais que por sua vez são formados por poucas células que acumulam reservas (DRESSLER 1993; CLEMENTS, 1999). Apesar de algumas variações de espécie para espécie, as orquídeas tendem a apresentar um padrão geral no desenvolvimento. Primeiramente a semente se intumesce, provocando o rompimento do tegumento seminal e liberação do embrião, que se modifica em uma estrutura esférica, geralmente clorofilada, chamada Protocormo (ARDITTI, 1992). As fases que se seguem são diferenciadas pelo número de folhas que emergem do protocormo e pelo aparecimento das raízes. O estudo anatômico também permite identificar as condições ótimas de crescimento e seus efeitos nos processos bioquímicos e ontogenéticos da planta. Nos últimos anos, as técnicas de cultivo in vitro têm sido bastante convenientes, pois os métodos clássicos de propagação apresentam problemas, pelo fato das sementes dessas plantas serem de tamanho extremamente reduzido, sem endosperma. Adicionalmente, a porcentagem de germinação, em condições naturais, é em torno de 2 a 3%, dependendo de associações micorrízicas (SHEEHAN, 1992; CORRIE & TANDON, 1993). MATERIAL E MÉTODOS As sementes foram inoculadas nos meios MS 50, MS 100, VW e KN. A análise anatômica foi realizada a partir de plantas crescidas em meio KN (KNUDSON, 1946) modificado. As sementes foram desinfetadas e submetidas a três lavagens em água deionizada e autoclavada, sob fluxo laminar. Em seguida, as sementes foram inoculadas, em oito repetições para cada meio, os frascos foram tampados com papel alumínio e vedados com parafilme, e colocados para germinar em uma sala de crescimento com temperatura média de 27 C e fotoperíodo de aproximadamente 16 horas. As classes de desenvolvimento foram descritas segundo com Suzuki et al, 2012. As amostras foram fotografadas com câmera Digital Sony WX100, com o auxílio de um estereomicroscopio Diagtech. Após a separação das classes e repetições, a coleta do material para montagem das lâminas foi realizada (90 dias após a inoculação), encontrando- Página 2
se tanto raízes, quanto protocormos. O material foi fixado em FAA 50. Em seguida desidratado e incluído em parafina+cera de abelha 8%, as amostras foram orientadas seguindo o plano de corte transversal e longitudinal. Os cortes foram feitos a 10µm de espessura, em micrótomo rotativo semi-motorizado (LeicaRM2245). As lâminas foram desparafinizadas em serie xilólica e os cortes corados em safranina e azul de astra 1%. As lâminas foram montadas com Bálsamodo-Canadá e as observações foram realizadas em microscópio óptico LeicaDM500, a documentação fotográfica foi feita em câmara Leica ICC50HD. RESULTADOS E DISCUSSÃO A germinação ocorreu após aproximadamente 30 dias, quando se pôde observar uma sutil camada verde na superfície do meio, indicando o aparecimento dos protocormos, os embriões intumescidos. Após cerca de 60 dias foram observadas as fases 1 (protocormos verdes) e 2 (protocormo com uma folha). As fases 3 e 4 foram observadas após 90 dias. Na fase 3 os protocormos apresentavam duas ou mais folhas e sem raiz. Na fase 4, observa-se o aparecimento de raízes. Toda a descrição está de acordo com Suzuki et al., 2012. O meio KN apresentou maior taxa de germinação, enquanto os meios VW e MS mostraram melhor desenvolvimento, respectivamente. Não foram registradas contaminações. O estudo anatômico mostrou que é difícil apontar com clareza um ponto de separação exato, entre as fases descritas segundo a morfologia externa. Inicialmente surge o protocormo. Células das periferias superiores e inferiores começam a se diferenciar. Na porção central têmse células parenquimáticas. O Meristema Apical Caulinar que surge formará as primeiras folhas, enquanto na parte inferior ocorre a formação dos rizóides e do futuro sistema radicular. Apesar de alguns autores como Suzuki et al 2012 e Stewart & Kane 2006 separarem as fases de desenvolvimento de acordo com a presença de determinadas estruturas, anatomicamente não há um consenso, visto que protocormos recém formados podem apresentar estruturas de estágios posteriores e a transição das fases é gradativa. Alvarez & Sagawa (1965), por exemplo, considera terminado o estágio de protocormo com o aparecimento da primeira raiz. Nos protocormos observados neste estudo, estavam presentes rizóides, escamas epidérmicas e estômatos. Primórdios foliares indicam possivelmente a transição da fase de protocormo para a fase 2, fato este corroborado também pela visualização de um procâmbio. Nos protocormos de C. macrocarpum, observados neste estudo, notou-se uma região meristemática na porção superior, mais densa em células e estas de tamanho reduzido. Como é de costume em certas Página 3
espécies de orquídeas, a formação das primeiras folhas ocorre primeiro que a emergência da raíz. As escamas epidérmicas têm sido descritas por alguns autores como adaptações foliares (VERA LUCIA SCATENA & SIMONE SEGECIN, 2005; ELISA M. AOYAMA & MARIA DAS GRAÇAS SAJO, 2003). As escamas epidérmicas observadas nas amostras estão relacionadas principalmente com defesa por possuírem ráfides, que contém cristais de oxalato de cálcio e provocam efeito urticante e/ou perfurante a animais que mordam as folhas. Nas amostras classificadas como fase III, a observação anatômica não apontou diferenças que pudessem contradizer a classificação segundo a morfologia externa. O protocormo apresentou duas folhas, sobrepostas, mas não havia formação de raiz. Na fase IV já ocorre o surgimento das raízes e determina o fim da fase de protocormo e início da fase de plântula. Certas plântulas mostraram duas raízes e uma comunicação do tecido vascular destas, com os da folha em formação, mostrando a origem endógena dessas raízes. Um corte transversal na raiz mostrou o xilema voltado para o exterior e no centro encontra-se a medula, com sifonostelo típico. Foi possível observar ainda o início do estabelecimento do velame. LITERATURA CITADA ALVAREZ, M.R. & SAGAWA, Y. 1965. A histochemical study of embryo development in Vanda (Orchidaceae). Caryologia 18: 251-261. AOYAMA, E. M., SAJO, M. G., 2003. Estrutura foliar de Aechmea Ruiz &Pav. subgênerolamprococcus (Beer) Baker e espécies relacionadas (Bromeliaceae). RevistaBrasil. Bot., V.26, n.4, p.461-473 ARDITTI, J., 1992. Fundamentals of orchid biology. John Wiley & Sons, New York. BASTOS, C. A. & BERG, C. V. D., 2012 Catasetum(Orchidaceae) da Bahia. Universidade Estadual de Feira de Santana, Departamento de Ciências Biológicas. Sitientibus série Ciências Biológicas 12(1): 83 89. CHASE, M. W.; CAMERON, K. M.; BARRET, R. L.; FREUDENSTEI, J. V., 2003. DNA Data and Orchidaceae Systematics: A New Phylogenetic Classification. In: DIXON, K.W.; KELL, S.P.; BARRETT, R.L.; CRIBB, P.J. (Eds). Orchid Conservation. Natural History Publications. Sabah, p. 69-89. CLEMENTS, M. A. 1999. Embryology. In: PRIDGEON, A. M.; P. J. Cribb& M. W. Chase (eds.). Genera Orchidacearum: general introduction, Apostasioideae, Cypripedioideae. Oxford University Press, Oxford, v.1; 38-58. Página 4
CORRIE, S. & TANDON, P., 1993. Propagation of Cymbidium giganteum Wall. Through high frequency conversion of encapsulated protocorms under in vitro and in vivo conditions. Indian Journal of Experimental Biology 31; 61-64. DRESSLER, R. L., 1993. Phylogeny and classification of theorchid family. Dioscorides Press, Portland. GIULIETTI, A. M., 2000. Caracterização e endemismos nos campos rupestres da cadeia do espinhaço. In: Tópicos atuais em botânica. Sociedade Botânica do Brasil/Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Brasília, p. 311-318. HEW, C. S.; YONG, J. W. H., 1997. The physiology of tropical orchids in relation to the industry. Singapore: World Scientific,.p. 331. KNUDSON, L. 1946. A new nutrient solution for germination of orchid seeds. American Orchid Society Bulletin 15; 214-217. KRAUS, J. E.; KERBAUY, G. B.; MONTEIRO, R. 2006. Desenvolvimento de protocormos de CatasetumpileatumRchb. f. in vitro: aspectos estruturais e conceituais. Hoehnea 33: 177-184. PABST, G. F. J. & DUNGS, F. 1975. Orchidacea e Brasiliensis. Vol. 1. Brucke-Verlag, Hildesheim. PABST, G. F. J. & DUNGS, F. 1977. Orchidacea e Brasiliensis. Vol. 2. Brucke-Verlag, Hildesheim. SCATENA, V. L., SEGECIN S., 2005. Anatomia foliar de Tillandsia L. (Bromeliaceae) dos Campos Gerais, Paraná, Brasil. Rev. bras. Bot. vol.28 no.3 São Paulo. SHEEHAN, T. AND SHEEHAN, M., 1992. An illustrated survey of orchid genera.timber Press, Portland, Oregon. SILVA, I. V., SILVA, A. B., PESSOA, M. J. G., JÚNIOR, N. G. R., 2013. Anatomia foliar de sete espécies de Catasetum (Orchidaceae) da região do portal da Amazônia, MT. 64º Congresso Nacional de Botânica, Belo Horizonte. SUZUKI R. M., MOREIRA V. C., NAKABASHI M., FERREIRA W. M., 2009. Estudo da germinação e crescimento in vitro de Hadrolaelia tenebrosa (Rolfe) Chiron& V. P. Castro (Orchidaceae), uma espécie da flora brasileira ameaçada de extinção. Hoehnea 36; 657-666 AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil "O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT Página 5