RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B

RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B Nº de art.: N0803 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Germany Tel: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Fax: +49 (0) 61 51 81 02-20

1. Âmbito de aplicação Para diagnóstico in vitro. O RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B é um teste rápido imunocromatográfico para a detecção qualitativa das toxinas A e B de Clostridium difficile nas amostras de fezes e em supernatantes de cultura. 2. Resumo e explicação do teste Doenças diarreicas são efeitos colaterais relativamente frequentes das terapias antibióticas. Principalmente desde a introdução da clindamicina, no começo dos anos 70, porém, ocorreram mais frequentemente formas mais sérias da doença, que podem desenvolver-se em quadros sérios de colite pseudomembranosa (CPM). Esta diarreia associada aos antibióticos (DAA) é maioritariamente causada pelo Clostridium difficile, sendo designada também por diarreia associada a Clostridium difficile (DACD). É uma das mais frequentes infecções nosocomiais nos países industrializados. A taxa de portadores de pacientes hospitalizados subiu, entretanto, para 16-35 %. Hoje conhecem-se grupos que apresentam uma virulência acrescida devido a mecanismos de patogénese especiais, as quais tornam uma infecção por Clostridium difficile (ICD) num factor de despesa importante da saúde pública. Para o aspecto da doença, reveste especial importância a produção das toxinas A e B através de grupos toxígenos de Clostridium difficile. Estas proteínas de toxina com massa altamente molecular de respectivamente aprox. 300 kda são diferenciáveis imunológica e funcionalmente. No caso da toxina A, trata-se de uma enterotoxina, no caso da toxina B, de uma citotoxina. Ambas as toxinas actuam tanto individual como sinergeticamente. Visto que nem todos os grupos de Clostridium difficile são formadores de toxina e aprox. 2-8 % dos adultos saudáveis e até 80 % das crianças com menos de 2 anos podem ser infectados com Clostridium difficile, em caso de uma ocorrência de DACD, ganha especial importância a detecção das toxinas A e B na amostra de fezes para o diagnostico e a decisão sobre a terapia. O RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B é um teste rápido, que permite a detecção específica simultânea das toxinas A e B nas amostras de fezes de pacientes por meio de anticorpos monoclonais e policlonais. O resultado confiável do exame fica pronto já após 15 minutos, de modo que as medidas terapêuticas efectivas podem ser tomadas em um estágio inicial. 3. Princípio do teste O presente teste rápido é um teste Lateral-Flow imunocromatográfico de um estágio, que utiliza tanto anticorpos de antitoxina A e antitoxina B biotinilados como marcados a ouro. Sempre que uma amostra positiva conter as toxinas A e/ou B da Clostridium difficile, os anticorpos antitoxina A e antitoxina B formam imunocomplexos, que passam, de seguida, pela membrana. A streptavidina existente na linha de teste T liga os imunocomplexos afluentes através da biotina acoplada à antitoxina A e a antitoxina B e causa, por consequência, uma coloração RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 2

vermelha/roxa da linha T. Na seguinte linha de controlo C são ligados os anticorpos de passagem não complexos, marcados a ouro. Nas amostras negativas, por consequente, não tem lugar uma ligação de imunocomplexos marcados a ouro na linha T, mas apenas na linha C. A linha C vermelha indica sempre se a realização do teste foi válida. 4. Conteúdo da embalagem Os reagentes de uma embalagem são suficientes para 25 doses Cassette 25 doses 25 cartuchos de teste embalados individualmente Reagent A 13,5 ml Anticorpos de antitoxina A e antitoxina B específicos; contém 0,05 % de azida, pronto para o uso, de cor azul Reagent B 13,5 ml Anticorpos de antitoxina A e antitoxina B específicos; contém 0,05 % de azida, pronto para o uso, de cor amarela Pipet 25 unidades Saco com 25 pipetas descartáveis Reagent vial 25 unidades Saco com 25 vasos de reacção Pipet Tip 25 unidades Saco com 25 pontas de pipetas Microlit Pipet 1 unidade Pipete para volume de 150 µl 5. Reagentes e sua armazenagem A embalagem pode ser armazenada a 2 25 C e deve ser usada até a data de expiração impressa. Após a expiração da data de validade, nenhuma garantia de qualidade pode ser oferecida. Do mesmo modo, a capacidade de uso dos cartuchos não pode mais ser garantida se a embalagem dos cartuchos estiver danificada. 6. Reagentes adicionais necessários equipamento necessário - Mixer Vortex (opcional) - Contentor para lixo com uma solução de hipocloreto de sódio de 0,5% 7. Medidas de precaução Apenas para o diagnóstico in vitro. Este teste só deve ser executado por pessoal de laboratório instruído. As regras para o trabalho nos laboratórios médicos devem ser observadas. As instruções de uso para a execução do teste devem ser estritamente seguidas. RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 3

Os reagentes contêm azida de sódio como conservante. Deve-se evitar o contacto com a pele ou as mucosas. Não pipetar as amostras ou reagentes com a boca. Evitar qualquer contacto com a pele ou as mucosas. Durante o manuseamento de amostras, deve usar luvas descartáveis e, após o término do teste, lavar as mãos. Nas áreas, em que se trabalha com as amostras, não fumar, comer ou beber. Todos os materiais e reagentes, que vêm junto com as amostras potencialmente infecciosas, devem ser manejados, tal como as mesmas, com desinfectantes adequados (p. ex. hipocloreto de sódio) ou autoclavados durante pelo menos 1 hora a 121 C. 8. Recolha e armazenamento das amostras As amostras de fezes devem ser colectadas em vasos limpos sem aditivos e armazenadas antes do teste a 2 8 C. No caso de uma armazenagem de mais de 3 dias, a amostra deve ser congelada a - 20 C. Neste caso, a amostra é descongelada totalmente antes do teste e exposta a temperatura ambiente. Deve-se evitar o congelamento e descongelamento repetido da amostra. Se forem utilizadas recolhas anais, deve-se observar que esteja disponível material de fezes suficiente (aprox. 50 mg) para a realização do teste. 9. Execução do teste 9.1. Disposições gerais Antes da utilização, as amostras, os reagentes e os cartuchos de teste devem ser colocados em temperatura ambiente (20 25 C). Os cartuchos de teste só devem ser retirados um pouco antes da utilização da sua embalagem individual. Os cartuchos não podem ser usados mais de uma vez. Deve ser evitada a luz do sol directa durante a realização do teste. O reagente restante não deve ser colocado novamente nos vasos, dado que poderia causar uma contaminação. 9.2. Preparativos prévios ao teste das provas Num vaso de reacção Reagent vial marcado são introduzidos respectivamente 0,5 ml (aprox. 12-14 gotas) do Reagente A Reagent A e do Reagente B Reagent B. Dever-se-á observar prioritariamente a graduação de 0,5 ml e 1,0 ml no vaso de reacção, independentemente do respectivo número de gotas dos reagentes A e B. Os reagentes A e B devem ter uma relação de 1+1. RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 4

9.2.1 Utilização de amostras de fezes No caso de amostras de fezes líquidas, são suspensos 50 μl na mistura de reagentes apresentada por meio de uma pipeta descartável Pipet (até ao segundo espessamento). Em caso de amostras de fezes sólidas são suspensos analogicamente 50 mg. De seguida, o vaso de reacção é bem fechado e homogeneizada a amostra através de uma mistura minuciosa (opcionalmente no mixer Vortex). Depois, deixar sedimentar a suspensão homogénea durante 5 minutos até que se forme um supernatante maioritariamente livre de partículas. Para a sedimentação, o vaso de reacção pode ser colocado numa das três aberturas centrais do encaixe dos reagentes. 9.2.2. Utilização de culturas líquidas e sólidas de Clostridium difficile São pipetados e misturados 50 µl de um caldo nutriente (por ex. caldo de tioglicolato) em 1,0 ml da mistura de reagentes, formada pelo reagente A (0,5 ml) e o reagente B (0,5 ml), previamente preparada no vaso de reacção. Desta mistura são utilizados 150 µl para o teste das provas (ponto 9.3.). Caso forem utilizados meios de cultura sólidos, é removido o maior número possível de colónias da placa dos meios de cultura, os quais são, num primeiro passo, completamente suspensos em uma solução de água destilada ou soro fisiológico de 1 ml (solução NaCl de 0,9%). São pipetados e misturados 50 µl desta suspensão em 1,0 ml da mistura de reagentes, formada pelo reagente A (0,5 ml) e o reagente B (0,5 ml), previamente preparada no vaso de reacção. Desta mistura são utilizados 150 µl para o teste das amostras (ponto 9.3.). 9.3. Teste das amostras O cartucho de teste Cassette, retirado da embalagem individual, é depositado numa superfície plana. Em seguida, é colocada uma ponta de pipeta Pipet Tip não utilizada na pipeta Microlit Pipet e colhidos 150 µl de supernatante do respectivo vaso de reacção e pipetado no campo de aplicação do cartucho de teste. Deve-se observar que o líquido passe sem problemas pela membrana. Em caso de realização correcta, a tira de controlo aparece após aprox. 3 minutos na linha de controlo C. Caso a linha de controlo não for visível após 3 minutos, qualquer nova amostra deve apresentar um grau de sedimentação mais elevado (a obter, como opção, através de uma centrifugação de 2 minutos a 2000 g) e ser pipetada no campo de aplicação de um novo cartucho de teste. O resultado do teste pode ser sempre lido após 15 minutos. A coloração das tiras e a sua intensidade pode mudar durante todo o período de reacção e após a secagem da tira de vermelha/roxa para azul e cinzenta/roxa. RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 5

10. Controlo de qualidade Sinais de expiração do reagente O teste só deve ser avaliado se o cartucho de teste estiver intacto antes da pipetagem da suspensão de amostras e o mesmo não apresentar modificações coloridas ou tiras. Além disso, após o período de incubação de 15 minutos, deve ser pelo menos visível a tira de controlo vermelha/roxa. Se esta não aparecer, verificar o seguinte antes de repetir o teste: - Durabilidade dos cartuchos de teste e dos reagentes utilizados - Execução correcta do teste - Contaminação dos reagentes Se após a repetição do teste com um novo cartucho de teste a tira de controlo ainda não for visível, entre em contacto com o fabricante ou com o seu distribuidor local R-Biopharm. 11. Avaliação e interpretação Só podem aparecer duas tiras no máximo, vistas do campo de aplicação das amostras na seguinte sequência: Uma tira de reacção vermelha/roxa na linha de teste T e uma tira de controlo vermelha/roxa na linha de controlo C. Se faltar a tira de controlo, o teste não pode ser avaliado e torna-se inválido! As seguintes interpretações são positivas: - Clostridium difficile toxina positiva: Ambas as tiras são visíveis. - Clostridium difficile toxina negativa: Somente a tira de controlo é visível. - Inválido: Nenhuma tira visível ou configuração diferente da acima referida. Do mesmo modo, as colorações das tiras que só aparecem bastante mais tarde do que após 15 minutos não têm valor diagnóstico e não permitem avaliação. 12. Limites do método O RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B detecta as toxinas A e/ou B de Clostridium difficile nas amostras de fezes após o seu enriquecimento em culturas de Clostridium difficile. Uma relação entre a intensidade das tiras específicas visíveis e a ocorrência ou gravidade dos sintomas clínicos não pode, no entanto, ser deduzida. Os resultados alcançados devem sempre ser interpretados em conjunto com o quadro clínico. Um resultado positivo não exclui a presença de outros agentes patogénicos ou causas infecciosos. Um resultado negativo não exclui uma possível infecção com Clostridium difficile. Pode ter sido causado pela segregação intermitente dos agentes de toxina ou por uma quantidade muito pequena de toxinas na amostra. Em caso de suspeita anamnesticamente fundada de uma RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 6

infecção com o agente patogénico procurado, deveria ser examinada uma outra amostra de fezes do paciente. Uma amostra de fezes em excesso pode causar uma coloração castanha da tira de teste, a qual acaba por cobrir a coloração vermelha/roxa da tira de teste específica. Nestes casos, é necessário fazer um novo teste com uma quantidade menor de fezes ou uma suspensão de fezes mais apurada através de centrifugação, a fim de verificar se a amostra contém toxinas de Clostridium difficile, que, no entanto, foram cobertas por uma matriz de fezes em excesso. 13. Características de desempenho 13.1 Sensibilidade e especificidade clínicas Num estudo de validação com 181 amostras de fezes congeladas e previamente caracterizadas com métodos PCR (116 amostras negativas e 65 positivas) o teste rápido RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B foi comparado com 5 kits ELISA disponíveis no mercado. Para tal, as amostras de fezes foram descongeladas, homogeneizadas e utilizadas nos 5 diferentes testes em conformidade com as instruções dos fabricantes. Foram avaliados os resultados das sensibilidades e especificidades relativas de todos os kits de teste utilizados, os quais encontram-se resumidos na tabela 1. Tab1. Sensibilidade e especificidade do RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B em comparação com 5 kits de teste Elisa disponíveis no mercado para a detecção das toxinas A e B de Clostridium difficile nas amostras de fezes. [ % ] RIDA QUICK ELISA 1 ELISA 2 ELISA 3 ELISA 4 ELISA 5 Sensibilidade 100 97 100 93 87 83 Especificidade 91 99 89 96 91 97 13.2 Sensibilidade analítica A fim de determinar a sensibilidade analítica do teste rápido RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B, as toxinas A e B puras foram misturadas e diluídas em série com uma concentração definida numa amostra de fezes negativa. Os distintos estágios de diluição foram verificados a respeito da sua reactividade tanto no RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B como em dois testes rápidos imunocromatográficos disponíveis no mercado. Os resultados estão resumidos na tabela 2. RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 7

Tab 2. Sensibilidade analítica do RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B em comparação com 2 testes rápidos disponíveis no mercado para a detecção das toxinas A e B de Clostridium difficile. Concentração de toxinas Toxinas A e B RIDA QUICK C.difficileToxin A/B Rapid Immunoassay 1 Rapid Immunoassay 2 [ ng/ml ] A B A B A B 0 - - - - - - 1 - - - - - - 2 - (+) - - (+) - 4 (+) + - + + - 8 + ++ - + + (+) 16 ++ +++ (+) + ++ + A sensibilidade analítica do teste RIDA QUICK Clostridium difficile foi determinada com 4,2 ng/ml para a toxina A e 2,1 ng/ml para a toxina B, utilizando toxinas purificadas. 13.3 Precisão Para determinar a precisão do teste RIDA QUICK Clostridium difficile foram examinadas a reprodutibilidade intra-ensaio, a reprodutibilidade inter-dia (10 dias), a reprodutibilidade interoperadores (3 operadores) e a reprodutibilidade inter-lote (3 lotes). Para cada exame foram medidas 5 referências em réplicas: uma negativa, uma mediamente positiva com a toxina A e uma com a toxina B, uma fracamente positiva com a toxina A e uma com a toxina B. O teste RIDA QUICK Clostridium difficile mostrou em 100 % das medições o resultado esperado. 13.4 Actividade cruzada Vários germes patogénicos do trato intestinal foram examinados com o teste RIDA QUICK Clostridium difficile e não mostraram actividade cruzada. Os exames foram realizados com suspensões de bactérias (10 7 até 10 9 cfu/ml), com culturas de parasitas (10 7 até 10 9 organismos/ml) e com supernatantes de culturas celulares infectadas com vírus. Os resultados constam da tabela 2. Germe de teste Origem Denominação / Fonte Resultado Adenovírus Supernatante de cultura celular Micromun GmbH negativo Aeromonas hydrophila Cultura DSM 30014 negativo Astrovírus Supernatante de cultura celular Micromun GmbH negativo RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 8

Bacillus cereus Cultura DSM 22650 negativo Candida albicans Cultura DSM 11948 negativo Citrobacter freundii Cultura DSM 30039 negativo Cryptosporidium muris Cultura Waterborne Inc. negativo Cryptosporidium parvum Cultura Waterborne Inc. negativo E. coli EPEC Cultura DSM 8695 negativo E. coli ETEC Cultura DSM 10973 negativo E. coli STEC Cultura DSM 8579 negativo Enterobacter cloacae Cultura DSM 30054 negativo Enterococcus faecalis Cultura DSM 2570 negativo Giardia lamblia Cultura Waterborne Inc. negativo Klebsiella oxytoca Cultura DSM 6673 negativo Proteus vulgaris Cultura DSM 13625 negativo Pseudomonas aeruginosa Cultura DSM 288 negativo Rotavírus Supernatante de cultura celular Micromun GmbH negativo Serratia liquefaciens Cultura DSM 30068 negativo Shigella flexneri Cultura DSM 4782 negativo Staphylococcus aureus Cultura DSM 20372 negativo Staphylococcus epidermidis Cultura DSM 1798 negativo Vibrio parahaemolyticus Cultura DSM 2172 negativo Yersinia enterocolitica Cultura DSM 11502 negativo 14. Substâncias interferentes As substâncias a continuação designadas não mostraram incidência nos resultados de teste, sempre que foram misturadas em amostras de fezes positivas e negativas de Clostridium difficile Toxin A/B com as concentrações indicadas: Sulfato de bário (5 % w/w), Loperamid (antidiarreico; 5 % w/w), Pepto-Bismol (antidiarreico; 5 % v/w), Mucina (5 % w/w), Ciclamato (adoçante artificial 5 % v/w), Sangue humano (5 % v/w), Ácido esteárico / Ácido palmítico (mistura de 1:1, 40 % w/w), Metronidazol 0.5 (antibiótico 5 % v/w), Diclofenac (0.00263 % v/w). RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 9

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