FUNGOS ENDOFÍTICOS DE SUCUPIRA BRANCA (Pterodon emarginatus) E SUAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANAS SOBRE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS Talita Pereira de Souza Ferreira 1 ; Luiz Gustavo de Lima Guimarães 2 1 Aluna do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; e-mail: cupufer@gmail.com PIBIC/CNPq 2 Orientador do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; e-mail: lgguimaraes@mail. uft.edu.br RESUMO A partir da planta medicinal Pterodon emarginatus, foram isolados 44 fungos endofíticos morfologicamente distintos obtidos de 50 fragmentos foliares. As cepas que sobreviveram ao meio de cultura BDA foram repicadas para outras placas de Petri afim de torná-las puras. Foram cultivados ainda em meio de cultura Czapek líquido para preservação dos mesmos juntamente com glicerol em ultrafreezer. Da mesma forma, neste trabalho os bioensaios foram realizados com os fitopatógenos (Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii) isolados de plantas de Phaseolus vulgaris (feijão comum) que apresentavam os sintomas das doenças em face dos fungos endofíticos pela técnica de cultura pareada. Não foram obtidos resultados significativos, e apenas interações foram notadas entre as cepas de fungos endofíticos e os dois fitopatógenos, uma vez que nenhum deles pereceu, e sim sobreviveram juntos. A Frequência de Isolamento foi de 100% para todas as placas de Petri tornando esta planta ótima para isolamento de fungos endofíticos. A micota endofítica isolada não pôde ser identificada. Para que isto ocorra, são necessários outros tipos de experimentos, como atividade de enzimas hidrolíticas e outras técnicas de antagonismo focando a cinética de crescimento de cada fungo. Logo, é preciso ter certeza de que o fungo é relevante para dar o próximo passo. Palavras-chave: Fungos endofíticos; Pterodon emarginatus; Rhizoctonia solani; Sclerotium rolfsii. INTRODUÇÃO Os fungos fitopatogênicos são bem documentados, suas estruturas já foram identificadas taxonomicamente e suas relações ecológicas são amplamente estudadas, entretanto, poucos estudos foram realizados com os fungos endofíticos, acreditando-se que uma das causas seja a invisibilidade de
sintomas nas folhas das plantas hospedeiras (SIQUEIRA et al. 2011). Os endófitos podem ser muito importantes para bioprospecção de compostos de novas descobertas biotecnológicas. No Brasil, a aplicabilidade de agentes fúngicos antagonistas ainda é limitada, devido a nem todos os produtos serem registrados legalmente no ministério da Agricultura Pesca e Abastecimento (MAPA) e também devido ao desconhecimento dos consumidores sobre as consequências maléficas do uso intensivo de agrotóxicos. Para que esta deficiência seja superada é preciso esclarecer quais interações existem entre os agentes de biocontrole, patógenos, plantas e ambiente (MORANDI & BETTIOL, 2009). A cultura do feijão (Phaseolus vulgaris L.) constitui-se em atividade agrícola importante para o estado do Tocantins, proporcionando retorno econômico para o produtor, e são culturas que exigem mão de obra rural, consequentemente geram diversos empregos, ocasionando aumento de renda para a população. No entanto estas culturas são acometidas por diversas doenças, que não controladas causam perdas ocasionando prejuízos aos produtores. O controle químico, embora amplamente adotado, nem sempre pode impedir o progresso da doença no campo (SANTOS et al., 2006). O fejoeiro é suscetível a diversos fitopatógenos. Dentre as principais doenças causadas por estes, estão a mela, conhecida por murcha-da-teia-micélica causada pelo fungo Rhizoctonia solani, e a podridão do colo causada pelo fungo Sclerotium rolfsii (ALVES e DEL PONTE, 2010 ; MARANGONI, 2010). Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo isolar e identificar fungos endofíticos das folhas de sucupira (Pterodon emarginatus), nativas do ecossistema de cerrado do estado do Tocantins, bem como avaliar o potencial dos mesmos para a produção de compostos que possuam atividade antibiótica sobre os fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii de maneira a desenvolver meios alternativos e eficazes de controle da podridão do colo e da mela causadas por estes fitopatógenos na cultura do feijão comum. MATERIAL E MÉTODOS Isolamento dos fungos endofíticos As folhas de sucupira branca foram coletadas aos arredores da Universidade Federal do Tocantins e suas superfícies foram lavadas em água corrente e sabão para retirar impurezas. Após, foram colocadas em imersões sucessivas com álcool 70% (1 minuto), hipoclorito de sódio 2,5% (4 minutos), álcool 70% (30 segundos), seguidas de lavagem com água destilada autoclavada (6 minutos) e secadas em papel de filtro esterilizado (ARAÚJO et al., 2002). As folhas foram cortadas em
fragmentos de 5 mm de diâmetro. Posteriormente, foram inoculados em placas de Petri de 9 cm de diâmetro contendo o meio de cultura BDA (Batata, dextrose e ágar). Ao meio de cultura foram acrescentados 50 μg/ml tetraciclina ou 100 μg/ml cloranfenicol (antibióticos). Para o isolamento das culturas puras foram feitos repiques sequenciais em placas de Petri contendo o mesmo meio de cultura. Isolamento dos Fungos Utilizados nos Bioensaios Os fitopatógenos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani foram isolados de plantas de feijoeiro comum Phaseolus vulgaris com sintomas da doença (podridão do colo e podridão radicular). As partes da planta que apresentavam sintomas da doença foram cortadas e lavadas em água corrente. Em seguida estas partes foram desinfestadas superficialmente pela imersão consecutiva em etanol a 70 % por 30, solução de hipoclorito a 1 % por 40 e três vezes em água desmineralizada. Após as lavagens foram transferidas com auxílio de uma pinça esterilizada para placas de Petri contendo 15 ml de meio de cultura BDA e 1 mg de Ampicilina. Diariamente, as placas de Petri foram supervisionadas e as colônias fúngicas, que não apresentaram contaminantes foram repicadas em novas placas com o mesmo meio de cultura (VALADARES et al, 2008). A frequência de colonização das folhas foi determinada pela fórmula: FI = número de fragmentos foliares com crescimento fúngico número total de fragmentos amostrados 100. Determinação da atividade antibiótica Como atividade antibiótica, foi avaliada a capacidade de inibição do crescimento micelial in vitro dos fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. A avaliação da inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos pelos fungos endofíticos isolados foi realizada utilizando placas de Petri de 8 cm de diâmetro contendo aproximadamente 15 ml de meio de cultura BDA. Foram retirados discos de 7 mm de diâmetro contendo os micélios dos fungos endofíticos e fitopatogênicos de colônias puras com aproximadamente doze dias de crescimento em BDA. Foram colocados dois discos em lados opostos da placa de Petri, um contendo micélios do fungo endofítico e o outro contendo micélios do fungo fitopatogênico. Após o crescimento das duas culturas, foram observadas se houve ou não a presença de zonas de inibição. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 50 fragmentos foliares obtidos foram isolados 44 fungos endofíticos morfologicamente distintos das folhas de Pterodon emarginatus. As cepas que sobreviveram ao meio de cultura BDA foram repicadas para outras placas de Petri afim de torná-las puras. Foram cultivados ainda em meio de cultura Czapek líquido para preservação dos mesmos juntamente com glicerol em ultrafreezer. Os respectivos fungos endofíticos foram nomeados com as iniciais do nome científico da planta estudada (PE), tendo o primeiro isolado recebido o número 1 e assim, consecutivamente (PE-1, PE-2). A frequência de isolamento (FI) foi de 100%, sendo que a assepsia dos fragmentos em hipoclorito de sódio 2,5% foi realizada durante 4 minutos. Esta frequência de isolamento é alta, visto que Costa Neto (2002) estudando fungos endofíticos de Bactris gasipaes (Kunth), palmeira tropical pupunheira, obteve uma FI de 23,9%. Observando o trabalho de Cannon e Simmons (2002), dos 2520 fragmentos, 23% das amostras não apresentaram crescimento de endofíticos. Concluiram que fragmentos menores devem ser o ideal, pois microrganismos das bordas das placas podem interferir no crescimento dos mais distantes. Nas placas de Petri que continham o inóculo da água de lavagem, após a correta assepsia das folhas (controle negativo), não foi observado crescimento de microrganismos epifíticos. Este resultado indica que a desinfecção superficial foi eficiente confirmando que os microrganismos isolados correspondem realmente aos fungos endofíticos. Bernardi-Wenzel e seus colaboradores (2012) isolaram fungos endofíticos de Glycine max (soja) resultando em 31 cepas purificadas de suas folhas com o propósito de avaliar o potencial destes fungos contra os fitopatógenos Alternaria solani (Sorauer, 1896), Rhizoctonia solani (Kühn, 1858), Phomopsis sp., Fusarium solani (Mart.) pela técnica da cultura pareada. Da mesma forma, neste trabalho os bioensaios foram realizados com os fitopatógenos (Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii) isolados de plantas que apresentavam os sintomas das doenças em face dos fungos endofíticos pela técnica de cultura pareada. Não foram obtidos resultados significativos, e apenas interações foram notadas entre as cepas de fungos endofíticos e os dois fitopatógenos, uma vez que nenhum deles pereceu, e sim sobreviveram juntos. Os fungos endofíticos isolados não puderam ser identificados. Para que isto ocorra, são necessários outros tipos de experimentos, como atividade de enzimas hidrolíticas e outras técnicas de antagonismo focando a cinética de crescimento de cada fungo. Logo, é preciso ter certeza de que o fungo é relevante para dar o próximo passo. LITERATURA CITADA
ALVES, R.C., DEL PONTE, E.M. Requeima da batata. In: Del Ponte, E.M. (Ed.) Fitopatologia.net - herbário virtual. Departamento de Fitossanidade. Agronomia, UFRGS. Disponível em: <http://www.ufrgs.br/agronomia /fitossan/herbariovirtual/ ficha. php? id=101>. Acessado em: 29 de julho de 2013. ARAÚJO, W. L.; AZEVEDO, J.L.; MARCON J.; SOBRAL, J.K.; LAVACA, P.T. Manual: isolamento de microrganismos endofíticos. CALQ, Piracicaba, 2002. Bernardi Wenzel, J.. ISOLAMENTO E ATIVIDADE ANTAGONÍSTICA DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE SOJA (Glycine max (L.) Merrill). SaBios-Revista de Saúde e Biologia, América do Norte, v. 7, n. 3, p. 86-96, 2012. CANNON, P.F.; SIMMONS, C.M. Diversity and host-preference of leaf endophytic fungi in the Iwokrama Forest Reserve, Guyana. Mycologia, v. 94, p. 210-220, 2002. COSTA-NETO, P.Q. Isolamento e Identificação de fungos endofíticos da pupunha (Bactris gasipaes Kunth) e caracterização por marcadores moleculares. 2002. 86f. Dissertação (Mestrado em Genética e Evolução) Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2002. MORANDI, M.A.B. E BETTIOL, W. - Controle biológico de doenças de plantas no Brasil. In: Bettiol, W; Morandi, M.A.B. (Ed.). Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna, Embrapa Meio Ambiente, p.07-14, 2009. MARANGONI, R. E. Podridão radicular (Sclerotium rolfsii Sacc) no feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). Disponível em< http://fitopatologia1.blogspot.com.br/2010/03/podridao-radicular-dofeijoeiro_30.html> acessado em 10 de julho de 2013. SANTOS, G. R.; CAFÉ-FILHO, A. C.; REIS, A. C., REIS, A. Resistência de Didymella bryoniae a fungicidas no Brasil. Fitopatologia Brasileira, v. 31, n. 5, p. 476-482, 2006. SIQUEIRA, V. G.; CONTI, R.; ARAÚJO, M. J.; SOUZA-MOTTA, C. M. Endophytic fungi froms the medicinal plant Lippia sidoides Cham. And their antimicrobial activity. Springer Science+Business Media B. V., 2011. VALADARES, R. B. S.; PEREIRA, M. C.; KASUYA, M. C. M.; CARDOSO, E. J. B. N. Isolamento e Identificação de Fungos Micorrízicos de Gomeza sp. (Orchidaceae) em uma Floresta de Araucária do Estado de São Paulo. In: Fertbio, 2008, Londrina. Anais... 255-258, 2008. AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil"