Desenvolvimento de novas leveduras para o desafio da fermentação alcoólica Osmar Vaz de Carvalho Netto osmar@lge.ibi.unicamp.br Laboratório de Genômica e Expressão Instituto de Biologia - UNICAMP V Semana de Fermentação Alcoólica - Jayme Rocha de Almeida
Desenvolvimento de linhagens utilizadas para produção de etanol geneticamente melhoradas Alterar características genéticas da linhagem Banco de linhagens com características desejáveis
Introdução Levedura Saccharomyces cerevisiae Estrutura do DNA elucidada em 1996 Science, 1996
Processos biológicos de Saccharomyces cerevisiae Uva Massa Malte Cana de açúcar Etanol Pão Cerveja Vinho
Estratégia da produção de etanol Habilidade de produção e resistência Glicose Glicose reprime respiração Etanol Processo pouco eficiente (energético) S. cerevisiae Piskur, Trends in Genetics Vol.22 No.4 April 2006.
Evolução das leveduras As linhagens desenvolveram estruturas especializadas para fermentar - Física (estrutura e organização da célula) - Genética (DNA e proteínas)
Estrutura genética ~ 6000 genes DNA RNA ~ 6000 proteínas Proteína ADH1
Funções das proteínas Metabolismo: Acetaldeído Etanol ADH1 Estrutura: CWP2 Manoproteína, principal constituinte da parede celular Regulação: SPT15 Fator que promove a ativação de outros genes
Como as proteínas são produzidas no momento certo? Estímulo para ativar a produção da proteína Açúcar Etanol Temperatura Expressão gênica RNA Proteína
Vias metabólicas de S. cerevisiae
Formas de manipulações genéticas de leveduras Engenharia metabólica aleatória Modificações generalizadas e identificação das linhagens com as características de interesse Engenharia evolutiva Cultivo constante sob estresse e seleção de linhagens Engenharia metabólica direta Mudanças específicas em regiões conhecidas de interesse Engenharia metabólica reversa Identificação de uma linhagem com características de interesse e transferência das informações para outras linhagens e/ou manipulação direta
Exemplo de manipulação de leveduras de vinho Melhora o corpo do vinho Glicerol Etanol Saúde Lei seca Metabolic Engineering Vol. 9 (4), Pages 364-378
Exemplo de manipulação de leveduras de cerveja SSU1 MET14 Aumento da expressão gênica Antioxidante Preserva o sabor da bebida
Exemplos de manipulação de leveduras para etanol celulósico Celulose Hemicelulose Glicose Xilose Arabinose Ha et al., 2010. PNAS, v.108, n.2
Características da produção de etanol no Brasil Reciclo de células durante toda a safra Caldo de cana-de-açúcar não é estéril Grande quantidade de contaminantes, competição dinâmica A maioria dos contaminantes não possui características de fermentação desejáveis
Linhagens selecionadas Seleção de linhagens diretamente das Usinas a partir dos anos 90 PE-2 é uma das mais adotadas e adaptadas ao processo fermentativo
Linhagens selecionadas Características desejáveis: - Alto rendimento e produtividade - Vigor durante o processo fermentativo 100 População de células (%) 80 60 40 20 PE-2 Outras linhagens Adaptado de Basso et al., 2008. 0 0 50 100 150 200 Dias
Manipulação e estudo de linhagens Nós acreditamos que esta linhagem pode ficar ainda melhor através de manipulações genéticas pontuais Obstáculos Linhagens estudadas : laboratório importância clínica diferentes origens tecnológicas (cerveja, vinho) Não possuem aplicação direta!
-38%
Caracterização genética de linhagens Qualquer trabalho de manipulação genética de determinada linhagem deve ser precedido por um estudo detalhado sobre a estrutura, organização e controle do genoma
Etapas do desenvolvimento de linhagens melhoradas (baseadas em PE-2) Passo 1: Caracterização da composição e estrutura do genoma de PE-2 Passo 2: Domesticação de linhagem PE-2 Passo 3: Caracterização da expressão gênica de PE-2 durante a fermentação Passo 4: Desenvolvimento de linhagens derivadas de PE-2 geneticamente melhoradas
Primeiro passo: caracterização da composição e estrutura do genoma de PE-2 Genome Res. 2009 Dezembro; 19 (12): 2258 2270. Forneceu informações para estudos de expressão e manipulação gênica
Características do genoma de PE-2 Região central conservada Plasticidade para variar o número e a organização dos genes Região periférica variável
Características do genoma de PE-2 Linhagem de laboratório PE-2 Novo gene Produção de novas proteínas
Características do genoma de PE-2 Linhagem de laboratório PE-2 Duplicação Produção de proteínas em quantidades maiores
Características do genoma de PE-2 Linhagem de laboratório PE-2 Alteração do gene Produção de diferentes proteínas
Características do genoma de PE-2 Linhagem de laboratório PE-2 Alteração no estímulo Produção de uma mesma proteína sob diferentes estímulos
Segundo passo: domesticação de PE-2 Objetivos: - Facilitar a manipulação genética da linhagem - Utilizar marcas da própria linhagem - Ser o mínimo invasivo o possível
Transformação (manipulação) de leveduras Nova característica Gene repórter Geneticina Geneticina Nova característica + Geneticina Nova característica Meio de cultivo com antibiótico
Segundo passo: domesticação de PE-2 PE-2 GEA2 URA3 TIM9 PE-2 domesticada GEA2 TIM9
Meio sem Uracila GEA2 TIM9 + URA3 Nova característica Gene repórter GEA2 URA3 Nova característica TIM9 Meio sem Uracila
Etapas do desenvolvimento de linhagens melhoradas (baseadas em PE-2) Passo 1: Caracterização da composição e estrutura do genoma de PE-2 (Finalizado) Passo 2: Domesticação de linhagem PE-2 (Finalizado)
Terceiro passo: objetivos do estudo - Determinar em que quantidade e momento os genes são ativados durante a fermentação - Selecionar genes e ativadores para serem urtilizados nos estudos de manipulação genética 20 16 Concentração (%) 12 8 4 Açúcar Etanol Início: pressão osmótica Final: toxicidade de etanol 0 1 4 7 10 12 15 Horas
Usina Nova América Maracaí-SP 900 m 3
Coleta das amostras e identificação da quantidade de proteína produzida 20 16 Fermentação industrial Concentração (%) 12 8 Açúcar Etanol 4 6 pontos: começo ao fim 0 1 4 7 10 12 15 Horas DNA RNA-Seq Determinar o número de RNAs de cada gene RNA Proteína
Exemplos de valores de expressão gênica Início da fermentação: 2 horas de processo Seqs mapeadas: 5 Seqs mapeadas: 50 Seqs mapeadas: 500 C4 A1 R3 R3 100 X > 10 X > C4 A1
Início da fermentação 2 horas Final da fermentação 15 horas Seqs mapeadas: 500 Seqs mapeadas: 50 R3 R3 Nível de expressão do gene R3 varia 10 vezes ao longo da fermentação
Sabemos onde os genes e as regiões regulatórias estão localizadas Temos uma linhagem preparada para receber as informações de interesse Temos as informações de interesse Passo 4: Desenvolvimento de linhagens derivadas de PE-2 geneticamente manipuladas
Primeira fase do desenvolvimento das linhagens Alguns genes são regulados em resposta a condições de estresses - + Etanol Número de RNAs: 5 50 500 1000
Genes regulados em resposta a estresse - Hipóteses Nesta situação, se a expressão de um gene específico de resposta a estresse está aumentando, ele deve estar protegendo a célula contra os danos causados pelo estresse O que aconteceria com a pré-ativação da expressão desse gene antes do estresse ser sentido pela célula? - + Etanol
Seleção de alguns genes de interesse Inicialmente, 10 genes foram selecionados Variação da quantidade de proteína: 2 a 96 vezes 100000 R3 G1 RPKM (Log 10) 10000 1000 100 D2 H2 T2 H1 Y6 Y4 10 1 4 7 10 12 15 Tempo (horas) M1 N4
Seleção de alguns genes de interesse Estes genes foram selecionados para serem utilizados em ensaios de manipulação visando a alteração do padrão de expressão gênica 1- Aumentar a quantidade de proteína produzida 2- Ativar a produção antes da levedura sentir o estresse Quais ativadores utilizar?
Seleção dos ativadores Valor constante durante a fermentação Diferentes níveis de valor entre os ativadores selecionados 100000 S1 Valor médio 26180 RPKM (Log 10) 10000 1000 A1 F1 T1 C4 13060 10790 6170 1640 100 P1 730 I2 465 10 1 4 7 10 12 15 Tempo (horas) RPKM (Log 10) 100000 10000 1000 100 10 1 4 7 10 12 15 R3 G1 D2 H2 T2 H1 Y6 Y4 M1 Tempo (horas) N4
Estratégia para alteração dos ativadores Gene repórter Região ativadora Produto alvo KanMX4 pc4 DNA original + H2 DNA com a região ativadora alterada KanMX4 pc4 H2
Alteração da quantidade de proteína produzida 30 linhagens: 10 genes / 3 diferentes ativadores cada Expressão gênica esperada KanMX4 pc4 H2 Elevada KanMX4 pt1 H2 Bem elevada KanMX4 pa1 H2 Altamente elevada
Ensaios de competição 30 linhagens alteradas (marcadas com antibiótico Kan) Caldo de cana de açúcar (18%) a 30C Inóculo inicial: ~50% cada PE-2 KanMX4 pt1 H2 X + YPD+Kan YPD 400 800 Razão: Colônias resistentes a Kan (400) Total de colônias (meio rico) (800) Razão = 0.5
Ensaios de competição PE-2 X KanMX4 pt1 H2 + 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% Dia inicial Ciclo 1 Ciclo 5 Ciclo 10
Ensaio de competição controle X PE-2 PE-2 KanMX4 + Razão: Colônias resistentes a Kan Total de colônias (meio rico) 0,7 0,6 Razão 0,5 0,4 0,3 Parental vs. Parental+Kan 0,2 0 5 10 Ciclo
Vigor de crescimento durante a competição 0,7 0,6 Razão 0,5 0,4 0,3 H1 pc4 D2 ps1 0,2 0 5 10 Ciclo Efeito neutro: 16 de 30 0,7 0,7 0,6 0,6 Razão 0,5 0,4 0,3 Y4 pt1 H2 pt1 Razão 0,5 0,4 0,3 R3 ps1 H2 pc4 0,2 0 5 10 Ciclo 0,2 0 5 10 Ciclo Efeito negativo: 5 de 30 Efeito positivo: 9 de 30
Linhagens com efeito neutro ou positivo Ensaios de tolerância a estresses: PE-2 X Modificada Etanol Açúcar Temperatura 15% 17% 17% 20% 30C 37C 19% 21% 23% 26% 34C 40C
Ensaios fermentativos para as linhagens com efeito neutro ou positivo (perspectivas) 45 45 Etanol (g/l) 30 15 PE-2 LGE1 Etanol (g/l) 30 15 PE-2 LGE2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas Horas 45 45 Etanol (g/l) 30 15 PE-2 LGE3 Etanol (g/l) 30 15 PE-2 LGE4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas Horas
Características desejadas das linhagens desenvolvidas Tolerância a estresses Desempenho fermentativo LGE2 LGE3 = LGE6 =
Vantagem das linhagens desenvolvidas (perspectivas) População de células (%) 100 80 60 40 20 PE-2 Outras linhagens 100 76% 90% População de células (%) 80 60 PE-2 derivada 40 Outras linhagens 20 0 0 50 100 150 200 Dias 0 0 50 100 150 200 Dias Aumento da produção! - Vigor - Rendimento - Produtividade
Sistema automatizado para cultivo de leveduras - Cultivo de 6000 leveduras individuais - Coleta de amostras - Detecção de compostos presentes no meio (etanol, sacarose, glicerol, entre outros) - Seleção por competição (Engenharia Evolutiva)
Outras condições analisadas Dornas com alta concentração de açúcares Condição típica X Dornas em temperaturas elevadas Leveduras floculadas
Condição típica X Dornas com alta concentração de açúcares A Condição típica X Dornas em temperaturas elevadas B Condição típica X Leveduras floculadas C
Linhagens de interesse para melhoramento genético PE-2 CAT-1 Linhagem específica da Usina - Novas linhagens selecionadas - Linhagens de outros processos (vinho, cerveja, cachaça...) - Adicionar novas características em linhagens previamente melhoradas (PE-2, CAT-1)
Agradecimentos Prof. Gonçalo Pereira Marcelo Carazzolle Luciana Mofatto Aline Rodrigues Marina Pessoa Nádia Sampaio Pedro Tizei Paulo Teixeira Felipe Galzerani Sílvio Andrietta Maria da Graça Andrietta Prof. Lucas Argueso Osmar Vaz de Carvalho Netto osmar@lge.ibi.unicamp.br