UNIVERSIDADE DO VALE DO RIO DOS SINOS - UNISINOS UNIDADE ACADÊMICA DE GRADUAÇÃO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CÍNTIA DE LORENZO

UNIVERSIDADE DO VALE DO RIO DOS SINOS - UNISINOS UNIDADE ACADÊMICA DE GRADUAÇÃO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CÍNTIA DE LORENZO DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES BASEADA APENAS NA SOBREVIVÊNCIA É SUFICIENTE? SÃO LEOPOLDO 2011

CÍNTIA DE LORENZO DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES BASEADA APENAS NA SOBREVIVÊNCIA É SUFICIENTE? Artigo apresentado como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas, pelo Curso de Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Rio dos Sinos UNISINOS. Orientador: Prof. Dr. Uwe Horst Schulz SÃO LEOPOLDO 2011

Dedico este trabalho ao meu pai Carlos Ricardo, minha mãe Lorecilda e aos meus irmãos Ricardo e Letícia.

AGRADECIMENTOS Aos professores que no percurso da minha vida estudantil acrescentaram uma bagagem com os mais diversos ensinamentos. Ao Laboratório de Ecotoxicologia da UFRGS por abrir as portas e acreditarem numa menina sem experiência nenhuma na área ambiental, em especial ao coordenador do laboratório Dr. Alexandre Arenzon por ter gentilmente fornecido a proposta desse trabalho e fornecido os conhecimentos ao longo dos anos que venho trabalhando com ele. As Mestras Nade Janara Coimbra e Carina Michele Portela pela ajuda fundamental na elaboração do projeto do presente estudo, pelos valorosos ensinamentos e experiências compartilhadas, pela vivência científica, mas principalmente por todo carinho, amizade e dedicação. Ao Biól. Carlos Eduardo, por me ensinar a ser uma profissional cada dia melhor. Aos técnicos e a equipe toda atual e que passou pelo Laboratório da UFRGS e do Laboratório Ecotox Marcelo, Karla, Roberta, Joana, Clarissa, Lílian, Kim, Márcia, Solange, Thássia, Regina, Renato, Júnior, Luíza, Douglas pelo bom convívio e pelas boas risadas. Em especial a Bruna Piñeiro pela parceria. Ao meu orientador, Prof Dr. Uwe Horst Schulz, pela sua aposta neste trabalho, confiança, e ensinamentos compartilhados ao longo desse estudo. Aos queridos amigos que fiz durante a graduação: Joana Rocha, Felipe Pinheiro, Gabriel Berbigier, Bruna Brum, Tiziane Horbach, Gisele Ribeiro, Aline Johnson, Caroline Cabreira, Michele Oliveira, Lúcia, Rogério, e também aos que não me lembro agora, muito obrigada pela amizade, saídas a campo, trabalhos, pelas conversas no trem e boas risadas. A minha família, meu pai Carlos Ricardo e minha mãe Lorecilda pelo cuidado, dedicação e carinho. Aos meus irmãos Ricardo e Letícia pelo exemplo para seguir, pelo carinho e dedicação.

1 DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE CRÔNICA PARA PEIXES BASEADA APENAS NA SOBREVIVÊNCIA É SUFICIENTE? Cíntia De Lorenzo 1 Uwe Horst Schulz 2 Resumo: Os ensaios ecotoxicológicos são aplicados nas atividades potencialmente poluidoras, mostrando a reação dos organismos expostos às substâncias. Um dos critérios avaliados é a toxicidade crônica, na qual, são feitas medidas dos efeitos sobre a sobrevivência e crescimento. No Brasil, para a avaliação dos efeitos crônicos de curta duração em peixes é utilizada a norma ABNT NBR 15499/2007 aplicada a duas espécies, Pimephales promelas e Danio rerio. Na análise feita com P. promelas os resultados são obtidos avaliando a sobrevivência e o crescimento. Para D. rerio, no entanto, apenas a sobrevivência é utilizada como efeito avaliativo. O objetivo proposto neste trabalho é avaliar se a toxicidade crônica observada sobre o crescimento pode ser extrapolada a partir dos dados de sobrevivência, como sugerido pela ABNT NBR 15499/2007. Foram utilizadas amostras ambientais, amostras de efluentes industriais, bem como a substância de referência cloreto de sódio, resultando em 687 ensaios crônico com P. promelas executados conforme a norma brasileira. As amostras que apresentaram alguma toxicidade foram divididas em três grupos: amostras com toxicidade sobre o crescimento exclusivamente, amostras com toxicidade somente sobre a sobrevivência e amostras que apresentaram efeito de toxicidade sobre a sobrevivência e o crescimento simultaneamente, esses últimos resultados foram submetidos à metodologia de extrapolação conforme estabelecido na norma. A sensibilidade de D. rerio e P. promelas analisando a sobrevivência para a substância de referência cloreto de sódio mostrou-se bem próxima. Os dados indicam que 64% dos ensaios caracterizaram as amostras como não tóxicas. A toxicidade exclusivamente sobre a sobrevivência dos organismos foi observada em 56% e 31% dos ensaios, para amostras ambientais e efluentes, respectivamente. Entre os ensaios de efluente onde foi detectada a toxicidade sobre a sobrevivência, 32% também apresentaram toxicidade sobre o crescimento. O efeito tóxico somente sobre o crescimento representou 44% das amostras ambientais e 37% das amostras de efluentes. Desta forma, avaliações da toxicidade crônica baseadas exclusivamente sobre a sobrevivência dos organismos podem gerar falsos resultados negativos, principalmente quando não for detectada mortalidade alguma. Palavras-chaves: Ecotoxicologia. ABNT 15499/2007. Peixe. Valor crônico extrapolado. 1 Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas (Bacharel) da Universidade do Vale do Rio dos Sinos, período 2011/2. E-mail: cintiadelorenzobr@gmail.com 2 Professor Doutor do Curso de Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Rio dos Sinos. E-mail: uwe@unisinos.br

2 1 INTRODUÇÃO A água é um meio vital para todos os organismos vivos e seu uso abusivo e descontrolado contribui para o aumento da poluição. Os principais fatores que contribuem para a degradação dos corpos hídricos são as fontes de poluições pontuais que são diretamente introduzidas no ambiente, como o dejeto de esgoto doméstico e industrial (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006). Visando a proteção dos recursos hídricos bem como dos seus ecossistemas associados, foram criadas as análises ecotoxicológicas que tem por finalidade saber se, e em qual grandeza, as substâncias químicas, isoladas ou em forma de misturas, são nocivas (KNIE; LOPES, 2004). A ecotoxicologia constitui uma importante ferramenta na prevenção, caracterização e controle da contaminação que atinge os ecossistemas aquáticos. Em vista da imensidão de compostos produzidos mundialmente e que chegam ao nosso meio, à fiscalização desde tipo de entrada de matéria ganha cada vez mais importância (PAREY, 1999). De acordo com Knie e Lopes (2004), os ensaios ecotoxicológicos têm sido aplicados em diversos países há muitos anos na rotina de órgãos ambientais, no âmbito do licenciamento e da fiscalização de atividades potencialmente causadoras de poluição, bem como do monitoramento da qualidade das águas. No Brasil, a partir de 2005 a Resolução CONAMA 357 passou a exigir ensaios ecotoxicologicos como comprovação da proteção da fauna e flora em relação ao despejo de efluentes (CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE CONAMA, 2005). Os padrões específicos de toxicidade dos efluentes ficam a critério dos Estados. No Rio Grande do Sul é a Resolução 129 de 2006 do Conselho Estadual do Meio Ambiente (CONSEMA) que dispõe sobre os critérios, prazos e padrões de emissão para toxicidade de efluentes líquidos lançados em águas superficiais no Estado (RIO GRANDE DO SUL, 2006). Posteriormente, o CONSEMA considerando o aspecto técnico inovador do conteúdo, a complexidade de ações técnicas a serem desenvolvidas por parte das atividades para o atendimento dos padrões de emissão e a dificuldade demonstrada por parte delas em atender as condições preconizadas na Resolução, os prazos definidos na Resolução CONSEMA 129 de 2006 foram prorrogados através da publicação da Resolução CONSEMA 251 de 2010 (RIO GRANDE DO SUL, 2010). A avaliação da toxicidade das substâncias, dos efluentes e das amostras ambientais sobre os organismos-teste pode ser diferenciada entre efeito agudo e efeito crônico. A toxicidade aguda é aquela que provoca efeito de letalidade ou imobilidade dentro de um curto prazo de vida do organismo. A toxicidade crônica é provocada por efeitos, tais como, aumento da letalidade e diminuição de crescimento e reprodução após um tempo maior de exposição. No ambiente aquático muitas vezes os organismos estão expostos a agentes

3 químicos em níveis não letais podendo não levar à morte do organismo, mas causando distúrbios fisiológicos e/ou comportamentais em longo prazo. Esses efeitos são detectados em ensaios de toxicidade crônica, o qual permite avaliar os efeitos adversos mais sutis. Conforme são apresentados por Zagatto e Bertoletti (2006) esses ensaios podem ser divididos em três variedades: a) Ensaios com todo o ciclo de vida de uma espécie, b) Ensaios com parte do ciclo de vida de uma espécie e c) Ensaio funcional, no qual, são feitas medidas dos efeitos de substância sobre várias funções fisiológicas do organismo. O tipo mais comum, por apresentar resposta rápida e economicamente mais viável são os ensaios com parte do ciclo de vida do organismo que geralmente utilizam à fase de vida mais sensível. No caso dos peixes Pimephales promelas e Danio rerio, utilizados na norma Brasileira ABNT-NBR 15499/2007 ambos são expostos no inicio do seu ciclo de vida, na fase larval. O uso de ensaios ecotoxicologicos é amplamente utilizado em diversos países. Seus métodos possuem reconhecimento científico e encontram-se padronizados por associações ou organizações de normalização tanto de reconhecimento nacional quanto internacional. Os principais métodos utilizados ficam a cargo das seguintes instituições: Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), Associação Francesa de Normalização (AFNOR), Agência de Proteção Ambiental Norte Americana (USEPA), Environment Canada, Associação Americana de Saúde Pública (Standard Methods - APHA), Instituto Alemão para Normalização (DIN); Organização Internacional para a Padronização (ISO), Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OECD). O emprego da normalização e da padronização dos organismos a serem utilizados, bem como, na metodologia dos ensaios assegura que os resultados sejam uniformes dentre os diversos laboratórios que realizam ensaios ecotoxicológicos. Fornecem assim reprodutibilidade e confiança no relatório da toxicidade da amostra. Os métodos para avaliação da toxicidade crônica com peixes das Agências Ambientais dos Estados Unidos (USEPA) e do Canadá (Environment Canada) utilizam somente P. promelas como organismo-teste, avaliando tanto a sobrevivência quando o crescimento do organismo. A Organisation for Economic Co-Operation and Development - OECD (2000) utiliza no seu procedimento a espécie D. rerio. Esse método avalia em 28 dias os efeitos da exposição prolongada de substâncias químicas sobre o crescimento, através do peso fresco de peixes juvenis. Os organismos-teste expostos no inicio do ensaio da OECD, são provinientes de uma população com idade mínima de duas semanas, na qual, já recebem alimentação. O organismo-teste P. promelas é mais amplamente utilizado para avaliação da toxicidade crônica baseada na sobrevivência e no crescimento em peso seco dos organismos. RUBINGER (2009).

4 A norma Brasileira ABNT-NBR 15499 (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS - ABNT, 2007) que regulamenta a avaliação dos efeitos crônicos de curta duração em peixe, trás na sua metodologia as duas espécies: Pimephales promelas, conhecido como fathead minnow e Danio rerio, conhecido também por peixe zebra ou paulistinha. Para a avaliação realizada com P. promelas os resultados são obtidos avaliando a sobrevivência e o crescimento dos organismos-teste, no período de exposição do ensaio. Todavia para os ensaios com D. rerio somente a sobrevivência pode ser avaliada devido à sua reduzida capacidade de ingestão do alimento de origem externa na fase larval e, conseqüentemente, o crescimento inexpressivo desse organismo (BERTOLETTI, 2009). Com isso a estimativa do efeito crônico sobre o crescimento é obtido pela extrapolação da sobrevivência. Para a avaliação do efeito crônico sobre o D. rerio é, então, usado o calculo de VCest(I) descrito na norma ABNT-NBR 15499 (ABNT, 2007), que é a multiplicação da CL(I) 15 (Concentração letal inicial que causa efeito na sobrevivência de 15% dos organismos no tempo de exposição) pelo fator 0,3 (valor fixo), sendo assim o valor crônico inicial estimado. Portanto, partindo do pressuposto que a norma ABNT-NBR 15499/2007 permite aos laboratórios a implantação do método, onde é utilizado organismo-teste que fornece resultados baseados em extrapolações, ao invés de resultados observados. E que o cálculo da extrapolação é baseado em Bertoletti (2000) que utiliza somente resultado de substâncias químicas puras, onde a mortalidade sempre é observada, não analisando os resultados em amostras de efluentes e amostras ambientais. O objetivo proposto para o presente trabalho é avaliar o risco de falsos positivos e falsos negativos quando a toxicidade crônica sobre o crescimento for extrapolada a partir dos dados de sobrevivência.

5 2 MATERIAIS E MÉTODOS Os resultados apresentados neste estudo são baseados na avaliação de dados secundários do banco de dados do laboratório de Ecotoxicologia do Centro de Ecologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), assim como do Laboratório Ecotox Análise e consultoria Ambiental localizado em Porto Alegre. Foram utilizados dados provenientes de amostras ambientais (águas superficiais e subterrâneas), de amostras de efluentes industriais, bem como substâncias de referência. Os dados foram gerados de 2007 até 2011. Foram analisados 687 resultados de ensaios crônicos de curta duração com o peixe P. promelas (Figura 1) executados segundo a norma ABNT-NBR 15499/2007. Os dados foram tabulados separadamente para amostras ambientais, amostras de efluente e para a substância de referência cloreto de sódio (NaCl) da marca Merck. Para cada tipo de amostra os dados foram divididos em três grupos conforme demonstrado na Figura 2, amostras sem toxicidade, amostras com toxicidade exclusivamente sobre o crescimento, amostras com efeitos sobre a sobrevivência. Esse grupo foi dividido em dois subgrupos: Os ensaios com efeitos somente na sobrevivência e o segundo subgrupo os ensaios que apresentaram efeito de toxicidade também sobre o crescimento. Figura 1-Exemplares de Pimephales promelas fêmea (acima) e macho (abaixo). Fonte: McPhail (2011).

6 Figura 2- Grupos analisados para cada amostra. Amostras (ambientais, efluentes e substância) Sem toxicidade Com toxicidade Toxicidade somente na sobrevivência Toxicidade sobrevivência e crescimento Toxicidade somente no crescimento Cálculo do *VCest;168h. * Valor crônico estimado proposta pela norma ABNT-NBR 15499:2007. Fonte: Elaborada pela autora. Os resultados foram expressos, conforme a norma ABNT-NBR 15499 (ABNT, 2007) em: CEO(I); (concentração de efeito observado) = menor concentração nominal da amostra, no inicio do ensaio, que causa efeito deletério estatisticamente significativo na sobrevivência ou crescimento dos organismos nas condições do ensaio. CENO(I); (concentração de efeito não observado) = maior concentração nominal da amostra que não causa efeito deletério estatisticamente significativo na sobrevivência ou crescimento dos organismos nas condições do ensaio. Toxstat 3.5; Programa estatístico computadorizado utilizado para obter os resultados de CENO e CEO. V.C. (valor crônico) = média geométrica entre os valores de CEO e CENO. Usada como uma estimativa pontual de concentração segura.

7 VCest;168h (valor crônico estimado) = concentração nominal do agente químico que não causa efeito expressivo na sobrevivência e crescimento de larvas, em 168 horas de exposição, calculada multiplicando-se o fator 0,3 pela CL(I)15;168h. Análise qualitativa = foi expressa como tóxico ou não tóxico. CL(I)15 (concentração letal inicial) = concentração nominal da amostra, no inicio do ensaio, que causa efeito na sobrevivência de 15% dos organismos em 168 horas de exposição. O segundo subgrupo, amostras com efeitos sobre a sobrevivência e sobre o crescimento, foi analisado calculando o resultado em forma da CL(I)15 168h pelo método computadorizado o ICp (Inhibition Concentration). Segundo BERTOLETTI 2000, esse método mostrou-se o mais adequado para calcular os resultados dos ensaios baseados na sobrevivência de Danio rerio Os valores da CL(I)15 168h foram submetidos à metodologia proposta de extrapolação conforme estabelecido na norma Brasileira, calculado o VCest; 168h (valor crônico estimado) e comparado com o cálculo do Valor Crônico de crescimento observado em P. promelas. Valor esse obtido com auxilio do programa computacional Toxstat 3.5 computer Program (Gulley et al., 1996), amplamente utilizado em ecotoxicologia. 3 RESULTADOS Para melhor entendimento, os resultados dos 687 ensaios foram divididos em 3 grupos: ensaios realizados com substância, com amostra de efluentes e com amostras ambientais. 3.1 SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA: CLORETO DE SÓDIO Foram realizados 14 ensaios de toxicidade crônica de curta duração com P. promelas utilizando a substância química Cloreto de Sódio (NaCl), correspondendo a 2% da base de dados. Considerando o efeito crônico do NaCl sobre a sobrevivência dos organismos, a média da concentração de efeito observado (CEO) foi de 2,71 g/l. Não foram observados efeitos sobre o crescimento nas concentrações (0,5 g/l; 1 g/l; 2 g/l; 3 g/l; 4 g/l; 6 g/l; 8 g/l) avaliadas.

8 Considerando somente o efeito sobre a sobrevivência ao calcular a concentração que afeta a letalidade em 15% do organismo P. promelas, obteve-se uma média da CL(I)15 igual a 1796,1 mg/l com um coeficiente de variação (CV) de 0,04%. 3.2 AMOSTRAS DE EFLUENTES Foram avaliados 202 ensaios de toxicidade crônica de curta duração com P. promelas baseados em amostras de efluentes industriais de diferentes origens, correspondendo a 29% da base de dados. Desse total, 51% dos ensaios caracterizaram as amostras como não tóxicas. Os 49% restantes foram divididos entre três tipos de toxicidade, apresentados na figura 3. Figura 3- Ensaios crônicos de Pimephales promelas com amostras de efluentes. Fonte: Elaborada pela autora. Os resultados de efeito sobre a sobrevivência e sobre o crescimento simultaneamente foram submetidos à metodologia para o cálculo do valor crônico (VC) e o cálculo de extrapolação do valor crônico estimado (VCest) previstos na norma ABNT 15499:2007. Conforme apresentado na figura 4, nas amostras de efluentes onde foi observado efeitos sobre a sobrevivência, em 8% dos casos os valores do VCest são mais permissíveis em relação aos valores observados (VC), ou seja, as amostras foram caracterizadas como sendo menos tóxicas. Nos 92% restantes das amostras, o método de obtenção do valor crônico estimado detectou uma toxicidade superior àquela obtida pelo método de observação direta. Assim, em

11% dos casos o VCest foi mais restritivos em até 20%, 24% mais restritivos entre 20% e 50%, e em 57% dos casos mais restritivo que 50%. 9 Figura 4-Comparação dos percentuais dos valores crônicos estimados em relação aos valores crônicos observados, referente aos ensaios com P. promelas. Fonte: Elaborada pela autora. 3.3 AMOSTRAS AMBIENTAIS Foram avaliados 471 ensaios de toxicidade crônica de curta duração com P. promelas baseados em amostras de águas superficiais ou subterrâneas, correspondendo a 69% da base de dados. Deste total, 69% dos ensaios caracterizaram as amostras como não tóxicas. Dos 31% de amostras tóxicas, foram divididos entre dois tipos de toxicidade, apresentados na figura 5. Nas amostras de águas ambientais não foi observado efeito sobre a sobrevivência e o crescimento simultaneamente. Águas subterrâneas e superficiais são submetidas aos ensaios de toxicidade como amostras integrais, não havendo diluições. Portanto, quando a amostra causa mortalidade, o efeito sobre o crescimento não pode ser observado.

10 Figura 5- Ensaios crônicos de Pimephales promelas com amostras ambientais. Fonte: Elaborada pela autora. 4 DISCUSSÃO Este capítulo pretende discutir e interpretar os resultados apresentados nesse trabalho. 4.1 SUBSTÂNCIA: CLORETO DE SÓDIO O cloreto de sódio é uma substância amplamente utilizada nos ensaios ecotoxicológicos como substância de referência na avaliação da sensibilidade dos organismos-teste e no monitoramento da qualidade dos mesmos. O efeito sobre o crescimento dos organismos não foi observado. A ação da substância cloreto de sódio sobre os organismos pode estar diretamente relacionada somente a estresse osmótico provocando mortalidade, não sendo eficiente para analisar o efeito sobre o crescimento. No entanto, partindo do princípio de que foram somente sete concentrações analisadas (0,5 g/l; 1 g/l; 2 g/l; 3 g/l; 4 g/l; 6 g/l; 8 g/l), pode ter ocorrido que a concentração que afeta os organismos sobre o crescimento não tenha sido avaliada. Analisando o efeito somente sobre a sobrevivência pela metodologia de extrapolação da norma Brasileira obteve-se uma média da CL(I)15 igual a 1796,1 mg/l, resultado muito próximo ao encontrado por BERTOLETTI (2000). O Autor obteve uma CL(I)15 de 2000,0 mg/l também para o cloreto de sódio (n=5) quando avaliou ensaios ecotoxicológicos com D.rerio na fase larval (Tabela 1). Quando estimados para a metodologia da ABNT (VCest), os valores crônicos de crescimento encontrados foram de 538,4 mg/l no presente trabalho e de

11 600 mg/l por BERTOLETTI (2000). Comparando os valores crônicos estimados a partir dos dados de sobrevivência obtidos neste trabalho e os calculados por BERTOLETTI (2000), é possível concluir que, para o cloreto de sódio, D. rerio e P. promelas apresentam a mesma sensibilidade. A sensibilidade de D. rerio e P. promelas foi avaliada também em estudo realizados por STEPHAN et al (1983), que observou semelhança nos resultados e atribuiu ao fato das duas espécies pertencerem à mesma família Cyprinidae. Tabela 1-Ensaio com NaCl- Estimativas dos efeitos crônicos para P.promelas e para D. rerio, calculadas pelo método ICp. Valor crônico estimado Espécie Média das CL(I)15;168h (média das CL(I)15;168h com CV fator 0,3) Danio rerio 2000,0 mg/l a 600,0 mg/l a * Pimephales promelas 1796,1 mg/l b 538,4 mg/l b 0,04% b * Não apresentado Fonte: a) BERTOLETTI (2000); b)elaborado pela autora 4.2 AMOSTRAS DE EFLUENTES 4.2.1 Toxicidade exclusiva sobre a sobrevivência e Toxicidade sobre a sobrevivência e sobre o crescimento simultaneamente. Os resultados com amostras de efluentes que apresentaram toxicidade sobre a sobrevivência dos organismos-teste foram submetidos às metodologias para obtenção do valor crônico e do valor crônico estimado, conforme apresentado na figura 4. Observou-se que em 92% dos casos os resultados estimados (VCest) foram mais restritivos, ou seja, as amostras foram caracterizadas como sendo mais tóxicas que o valor crônico real. Pode se observar claramente que a metodologia de extrapolação prevista na norma ABNT-NBR 15499/2007 caracteriza as amostras com uma margem de segurança maior, como forma de compensar a falta de informação do valor cônico real sobre o crescimento do organismo D. rerio.

12 4.2.2 Toxicidade exclusiva sobre o crescimento O levantamento dos resultados demonstrou, conforme apresentado na figura 3, que quando há ausência de efeito tóxico sobre a sobrevivência ainda pode haver efeito sobre o crescimento dos organismos. Para os ensaios crônicos de efluente com P. promelas que apresentaram toxicidade, foi observado efeito exclusivamente sobre o crescimento em 37% dos casos. Nestas amostras não houve mortalidade em nenhuma das concentrações avaliadas. De acordo com a metodologia apresentada pela ABNT 15499:2007 o calculo do VCest sempre que não for apresentado efeito na sobrevivência em amostras ambientais não é possível calcular o valor crônico estimado sobre o crescimento, sendo, então a amostra considerada como Não Tóxica. BERTOLETTI (2009) justifica que, cerca de 45% dos resultados dos ensaios de toxicidade crônica com peixes (n=18) apontam que os efeitos sobre o crescimento deixam de ocorrer na concentração de 50% (CENO = 50%), ou seja, em 45% dos casos, os efeitos sobre o crescimento seriam observados somente na concentração de 100%. O autor argumenta que estes 45% de amostras onde a toxicidade não seria detectada estariam na faixa de variabilidade dos ensaios ecotoxicológicos. Os resultados do presente trabalho indicam que 58% dos resultados (n=21) não apresentaram mais efeitos tóxicos sobre o crescimento na concentração de 50%. Porém, deve ser ressaltado que, para 42%, a CENO foi menor que 50% (36% das amostras apresentaram CENO= 25% e 6% das amostras a CENO=12,5%) conforme Tabela 2. Desse modo, é possível verificar que, para uma porção expressiva dos resultados, 42% (n=15) encontrados nesse trabalho e 55% (n=22) encontrados por BERTOLETTI, o fator de conversão da norma perde sua utilidade, e um número significativo das amostras passam a ser caracterizadas como não tóxicas, apesar dos efeitos sobre o crescimento. A resolução do Rio Grande do Sul, CONSEMA 129 de 2006 que trata sobre os padrões de lançamento de efluente, trabalha para que após o período de 2 a 12 anos dependendo da vazão do efluente, as indústrias não possam mais apresentar nenhum efeito crônico em pelo menos dois diferentes níveis tróficos nos seus efluentes. No caso de peixes os efeitos avaliados são sobrevivência e crescimento dos organismos, considerando os efeitos observados em P. promelas é de se esperar que para o organismo D. rerio, onde não é possível verificar o efeito diretamente sobre crescimento sem o cálculo do VCest essa abordagem possa gerar resultados falsos negativos, que significa considerar o efluente tóxico, como enquadrado dentro dos padrões.

13 Tabela 2-Percentual de ensaios de amostras de efluentes com efeito crônico exclusivo sobre o crescimento de P. promelas, quando analisado a CENO. CENO Ensaios (%) 50% 58 25% 36 12,5% 6 Fonte: Elaborada pela autora. 4.3 AMOSTRAS AMBIENTAIS 4.3.1 Toxicidade exclusiva sobre a sobrevivência Um percentual de 56% das amostras ambientais avaliadas apresentou efeitos exclusivamente sobre a sobrevivência dos organismos-teste. Contudo, para amostras ambientais, mesmo apresentando mortalidade para os organismos, o valor crônico para o crescimento não é possível ser estimado, por se tratar de amostras integrais, é inexistente o cálculo da CL15 exigida pelo método para calcular o fator de extrapolação. Com isso, o fator de extrapolação da norma perde a sua aplicabilidade para amostras ambientais. 4.3.2 Toxicidade exclusiva sobre o crescimento Nos 44% restantes das amostras ambientais ensaiadas foram observados efeitos tóxicos exclusivamente sobre o crescimento dos organismos. O método de análise de águas superficiais e subterrâneas utiliza amostra não diluída. Na norma ABNT 15499 os resultados de amostras ambientais para as duas espécies de peixe são expressos qualitativamente tóxicos ou não tóxicos. Sendo possível ao final do ensaio para a espécie P. promelas a amostra ser avaliada na diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle

14 no crescimento ou sobrevivência. Porém para a espécie D. rerio as amostras ambientais, assim com as amostras de efluentes, nas situações que as amostras não apresentam letalidade para os organismos, não é possível a quantificação do efeito tóxico sobre o crescimento utilizando o fator de extrapolação, gerando falsos negativos. 5 CONCLUSÃO Tomando como base os resultados do presente estudo, a determinação da toxicidade crônica baseada apenas nos efeitos sobre a sobrevivência dos organismos proposta na NBR 15499/2007 para o peixe D. rerio pode não ser suficiente para a caracterização das amostras. A sensibilidade de D. rerio e P. promelas analisando a sobrevivência para a substância de referência cloreto de sódio mostrou-se bem próxima. A partir dos dados analisados com P. promelas foi possível determinar que, tanto em amostras de efluentes quanto para amostras ambientais, pode-se chegar a falsos negativos quando não é observada toxicidade sobre a sobrevivência. De uma forma geral, o método baseado apenas nos efeitos sobre a sobrevivência dos organismos não permite uma boa caracterização de amostras ambientais, já que estas são avaliadas sem diluição e, desta forma não é possível obter a CL15 exigida pelo método para o cálculo do fator de extrapolação. Cabe ressaltar que, nos cinco anos de vigência da norma ABNT-NBR 15499/2007, 69% dos ensaios de toxicidade crônica realizados com peixes pelos laboratórios que forneceram a base de dados para este trabalho foram realizados em amostras ambientais. Desta forma, estimativas dos efeitos de toxicidade crônica baseadas exclusivamente com resultados sobre a sobrevivência dos organismos devem ser vista com cautela por apresentarem um alto percentual de falsos negativos. Estudos complementares se fazem necessários para obter uma revisão do procedimento de ensaio crônico de curta duração com o organismo-teste Danio rerio, de forma a obterem um método onde seja possível avaliar a toxicidade sobre o crescimento e não se corra o risco de falsos negativos.

15 DETERMINATION OF CHRONIC TOXICITY TO FISH ONLY BASED ON SURVIVAL IS ENOUGH? Cíntia De Lorenzo 1 Uwe Horst Schulz 2 Summary: Ecotoxicological tests are applied in the evaluation of potentially polluting activities, showing the response in organisms exposed to substances. One of these criteria is the chronic toxicity, which may effect survival and growth of the test organisms. In Brazil, the evaluation of short-term chronic effects on fish follows ABNT NBR 15499/2007. It is conducted with two species: Danio rerio and Pimephales promelas. In the analysis with Pimephales promelas, results are obtained by evaluating survival and growth of the test individuals. However, when D. rerio is used, only the survival is evaluated. The objective of this paper is to assess whether the observed chronic toxicity on growth can always be extrapolated from the survival data, as suggested by ABNT NBR 15499/2007. Sodium chloride, environmental and industrial effluents samples were tested, resulting in 687 chronic tests with P. promelas, all of them according to the Brazilian standards. The results showed that toxicity could be divided into three groups: samples with toxicity effect on growth, samples with toxicity effect on survival and samples that showed toxicity effect on the survival and growth simultaneously. This third group was submitted to the extrapolation method according to ABNT NBR 15499/2007 standard. The results indicate that 64% of the tested samples were not toxic. The toxicity solely on the survival of organisms was observed in 56% and 31% of the tests for environmental samples and effluents, respectively. Analyzing the effluent tests where toxicity was detected on the survival, 32% also showed toxicity on growth. The toxic effect on the growth represented merely 44% of the environmental samples and 37% of the effluent samples. Therefore, chronic toxicity evaluations based exclusively on the survival of organisms may produce false negative results, especially when mortality is not detected at all Keywords: Ecotoxicology. ABNT 15499/2007. Fish. chronic extrapolated value.

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RIO GRANDE DO SUL. Conselho Estadual do Meio Ambiente CONSEMA. Resolução do CONSEMA nº 129, de 24 de novembro de 2006. Dispõe sobre a definição de Critérios e Padrões de Emissão para Toxicidade de Efluentes Líquidos lançados em águas superficiais do Estado do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 24 de novembro de 2006. Disponível em: <http://www.sema.rs.gov.br/upload/resolu%c3%a7%c3%a3o%20consema%20n%c2% BA%20129_2006%20-%20Defini%C3%A7%C3%A3o%20de%20crit%C3%A9rios%20e% 20Padr%C3%B5es%20de%20Emiss%C3%B5es_Toxicidade%20de%20Efluentes%20Liquid os_%c3%a1guas%20superficiais.pdf>. Acesso em: 13 jun. 2010. RUBINGER, C. F. 2009. 71 f. Seleção de métodos biológicos para avaliação toxicológica de efluentes industriais. Dissertação (Mestrado em Saneamento) Departamento de Engenharia sanitária e Ambiental, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, 2009. STEPHAN, C. E. et al. 1983. Guidelines for deriving numerical national water quality criteria for protection of aquatic life and its uses. Draft (July, 5) U.S.EPA. p.83. ZAGATTO, P. A. Avaliação de risco e do potencial de periculosidade ambiental de agentes químicos para o ambiente aquático. In: ZAGATTO, P. A; BERTOLETTI, E. (Ed.). Ecotoxicologia aquática: princípios e aplicações. São Carlos: RIMA, 2006. cap. 16, p 383-411. ZAGATTO, P. A.; BERTOLETTI, E. Validação de testes de toxicidade com organismos aquáticos. In: In: ZAGATTO, P. A; BERTOLETTI, E. (Ed.). Ecotoxicologia aquática: princípios e aplicações. São Carlos: RIMA, 2006. cap. 11, p. 251-267 17