Replicação do DNA e Cromossomos
Características básicas da replicação do DNA In Vivo É semiconservativa, Inicia-se em origens únicas Geralmente é bidirecional a partir de cada origem de replicação.
A replicação do DNA é Semiconservativa Cada fita serve de molde A complementaridade do pareamento de bases determina a sequência da nova fita Cada fita da hélice parental é conservada
Modos possíveis para replicação do DNA John Wiley & Sons, Inc.
Centrifugação de equilíbrio por gradiente de densidade com CsCl John Wiley & Sons, Inc.
O experimento de Meselson-Stahl: A replicação do DNA em E. coli é semiconservativa John Wiley & Sons, Inc.
A Origem de Replicação em E. coli John Wiley & Sons, Inc.
Replicação Bidirecional do Cromossomo Circular de E. coli John Wiley & Sons, Inc.
A Replicação é Bidirecional John Wiley & Sons, Inc.
A Replicação é Bidirecional John Wiley & Sons, Inc.
Pontos principais A replicação do DNA ocorre por um mecanismo semiconservativo: a medida que os dois filamentos complementares da dupla hélice se desenrolam e se separam, cada filamento serve de molde para sínteses de um novo filamento complementar. Os potenciais de ligação de hidrogênio das bases nos filamentos molde especificam sequências de base complementares nos filamentos de DNA nascentes. A replicação inicia-se em origens únicas e geralmente prossegue nas duas direções a partir de cada origem.
Replicação do DNA em Procariotos A replicação do DNA é um processo complexo, que exige a ação conjunta de um grande número de proteínas.
Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Replicon: 1. Origem + Término 2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 3. O genoma de uma célula procariótica constitui um único replicon
Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas
Fita contínua (líder) Fita descontínua
Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I PolII PolIII Polimerização 5 3 + + + Exonuclease 3 5 + + + Exonuclease 5 3 + - - Número de subunidades 1 4 10 Tamanho em kda 103 90 ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000 Processividade 3-200 1500 500000 (nt adicionados antes da dissociação do molde)
DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica
E. coli DNA Polymerase III Holoenzyme John Wiley & Sons, Inc.
DNA Polimerase
Necessidades das DNA Polimerases Primer DNA com 3'-OH livre Molde de DNA para especificar a sequência da nova fita Substrato: dntps Mg 2+ John Wiley & Sons, Inc.
DNA Polimerases Síntese de DNA: adição de nucleotídeos a extremidade 3 OH da cadeia em crescimento. Matéria-prima: desoxiribonucleosídeo 5 trifosfato Sentido da síntese sempre é 5 3 As DNA-polimerases tem atividade revisora
Desoxiribonucleosídeo 5 trifosfato (precursor) Fita sendo polimerizada Fita molde
correto Pareamento de bases incorreto
Atividade revisora 3 5 garante a fidelidade da replicação
Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli DnaA DnaB (helicase) DnaC HU Primase (DnaG) Single strand binding (SSB) RNA polimerase DNA girase Dam Metilase Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos Desenrola o DNA Auxilia a ligação de DnaB na origem Proteína do tipo histona que estimula a iniciação Sintetiza os primers de RNA Liga a fita simples de DNA Facilita a ação da DnaA Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita Metila as sequências GATC na OriC
Pré-iniciação da replicação em oric in E. coli
As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado
A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA Síntese da Fita descontínua Fita descontínua Fita contínua Síntese da Fita Contínua
RNA Primers são usados para iniciar a síntese de DNA John Wiley & Sons, Inc.
Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras
A DNA ligase sela as quebras
Mecanismo de ação da DNA ligase
Síntese das fitas contínua e descontínua é independente
O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas
DNA Helicase catalisa o desenrolamento da dupla hélice parental John Wiley & Sons, Inc.
Proteína de ligação ao DNA unifilamentar (SSB) John Wiley & Sons, Inc.
Helicases evitam a formação de super-hélices John Wiley & Sons, Inc.
DNA Topoisomerase I Produz quebras unifilamentares John Wiley & Sons, Inc.
DNA Polymerase III em E. coli John Wiley & Sons, Inc.
A replicação em E. coli John Wiley & Sons, Inc.
E. coli: Replisomo John Wiley & Sons, Inc.
Aspecto únicos da replicação em Eucariotos Embora as principais características da replicação de DNA sejam iguais em todos os organismos, alguns processos ocorrem apenas em eucariotos. John Wiley & Sons, Inc.
genoma eucariótico vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/s Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
John Wiley & Sons, Inc. Múltiplos replicons por cromossomo
O Replisomo eucariótico John Wiley & Sons, Inc.
O problema do Telômero John Wiley & Sons, Inc.
Telomerase John Wiley & Sons, Inc.
Comprimento do Telomero e envelhecimento A maioria das células somáticas perde atividade da telomerase. Telomeres curtos são associados com senescência e morte celular. Doenças que causam envelhecimento prematuro são associadas com encurtamento de telômeros. John Wiley & Sons, Inc.
Pontos chave Replicação bidirecional com múltiplas origens. Duas ou três DNA polimerases ( e/ou e) estão presentes na forquilha de replicação. Telomeros são adicionados ao cromossomo por uma enzima chamada telomerase. John Wiley & Sons, Inc.