W A N E S S A M A ZANEK SOUZA S U PL E M E N T A Ç Ã O C O M Ó L E O D E PE I X E E Ó L E O D E FÍGADO D E T U B A R Ã O A U M E N T A A PE R O X I D A Ç Ã O L I PÍDICA EM T U M O R D E W A L KER 256 C U R I T I B A 2 0 0 8
WANESSA MAZANEK SOUZA 2 S U PL E M E N T A Ç Ã O C O M Ó L E O D E PE I X E E Ó L E O D E FÍGADO D E T U B A R Ã O A U M E N T A A PE R O X I D A Ç Ã O L I PÍDICA EM T U M O R D E W A L KER 256 M o n o grafia apresentada para obtenção d o t í t u l o d e b a c h a r e l e m C i ê n c i a s Biológicas d a U n i v e r s i d a d e F e d e r a l P a r a n á. O r i e n t a d o r : P r o f. D r. Lu i z C l á u d i o F e r n a n d e s C U R I T I B A 2 0 0 8
3 S U M Á R I O L I S T A D E I L U S T R A Ç Õ E S............................................................... 4 L I S T A D E A B R E V I A T U R A S............................................................. 5 R E S U M O........................................................................................ 6 1. I N T R O D U Ç Ã O............................................................................ 7 1. 1 - C Â N C E R.............................................................................. 7 1. 2 - T U M O R D E W A L K E R 2 5 6...................................................... 8 1. 3 - ÁCID O S G R A X O S P O L IIN S A T U R A D O S................................... 9 1. 4 - A L Q U IL G L IC E R Ó IS............................................................. 1 0 1. 5 - Á C ID O S G R A X O S E C A N C Ê R............................................... 1 1 1. 6 - P E R O X ID A Ç Ã O L IP ÍD IC A.................................................... 1 2 2. O B J E T I V O S.............................................................................. 1 5 3. M A T E R I A L E M É T O D O............................................................. 1 6 3. 1 - L O C A L............................................................................... 1 6 3. 2 - A M O S T R A.......................................................................... 1 6 3. 3 - P R O T O C O L O E X P E R IM E N T A L.............................................. 1 6 3. 4 - O B T E N Ç Ã O E T R A N S P L A N T E D A S C É L U L A S D O T U M O R D E W A L K E R 2 5 6................................................................................. 1 7 3. 5 - P E R O X ID A Ç Ã O L IP ÍD IC A.................................................... 1 8 3. 6 - ANÁLIS E D E Á C ID O S G R A X O S P O R H P L C............................ 1 9 3. 7 - A N Á L IS E E S T A T ÍS T IC A....................................................... 2 1 4. R E S U L T A D O S........................................................................... 2 2 4. 1 - P E S O D O S T U M O R E S........................................................... 2 2 4. 2 - D E T E R M IN A Ç Ã O D O C O N T E Ú D O D E Á C ID O S G R A X O S P R E S E N T E S N O S Ó L E O S D E P E IX E E D E F ÍG A D O D E T U B A R Ã O....... 2 3 4. 3 - D E T E R M IN A Ç Ã O D O C O N T E Ú D O D E Á C ID O S P R E S E N T E S N A R A Ç Ã O......................................................................................... 2 5 4. 4 - D E T E R M IN A Ç Ã O D O C O N T E Ú D O D E Á C ID O S G R A X O S P R E S E N T E S N O T U M O R................................................................. 2 5 4. 5 - P E R O X ID A Ç Ã O L IP ÍD IC A N O T E C ID O T U M O R A L.................. 2 7 5. D I S C U S S Ã O.............................................................................. 2 9 6. C O N C L U S Ã O............................................................................ 3 4 R E F E R Ê N C I A S............................................................................. 3 5
L I S T A D E I L U S T R A Ç Õ E S 4 Fi g u r a 1 E s t r u t u r a q u í m i c a das m o l é c u l a s de alquilglicerol...10 Fi g u r a 2 - P e r o x i d a ç ã o l i p í d i c a.............................................. 1 4 Fi g u r a 3 - P e s o d o s t u m o r e s................................................... 2 2 Fi g u r a 4 - P e r f i l d e á c i d o s grax o s d o ó l e o d e p e i x e................... 2 4 Fi g u r a 5 - P e r f i l de ácidos grax o s do óleo de fígado de t u b a r ã o.. 2 4 Fi g u r a 6 - C o n c e n t r a ç ã o d e h i d r ó x i d o s l i p í d i c o s e m t e c i d o t u m o r a l.................................................28 T a b e l a 1 - P e r f i l d e á c i d o s grax o s n a r a ç ã o.............................. 2 5 T a b e l a 2 - P e r f i l d e á c i d o s grax o s d o s l i p í d e o s t o t a i s d o t u m o r... 2 7
L I S T A D E A B R E V I A T U R A S 5 A GPI Ácido grax o p o l i i n s a t u r a d o B H T - H i d r o x i t o l u e n o b u t i l a d o D H A Á c i d o d o c o s a h e x a e n ó i c o D N A Á c i d o d e s o x i r r i b o n u c l é i c o E PA Ácido eicosapentaenóico H PL C C r o m a t o grafia líquida de alta densidade I L - 1 In t e r l e u c i n a - 1 I L - 6 In t e r l e u c i n a - 6 L PO Li p o p e r o x i d a ç ã o R N A Á c i d o r i b o n u c l é i c o T N F Fator de necrose tumoral T PP trifenilfosfina W A n i m a i s n ã o s u p l e m e n t a d o s W A A n i m a i s s u p l e m e n t a d o s c o m ó l e o d e f í gado de tubarão W A O A n i m a i s s u p l e m e n t a d o s c o m ó l e o d e f í gado de tubarão e óleo d e p e i x e W O A n i m a i s s u p l e m e n t a d o s c o m ó l e o d e p e i x e ω - 3 O m e ga 3 ω - 6 Ô m e ga 6
R E S U M O 6 D a d o s d o In s t i t u t o N a c i o n a l d e C â n c e r ( 2 0 0 8 ), e s t i m a m p a r a o a n o d e 2 0 0 8 e p a r a 2 0 0 9, a i n c i d ê n c i a d e 4 6 6. 7 3 0 c a s o s n o v o s d e c â n c e r n o Brasil. A e s t i m a t i v a é d e q u e a t é o a n o d e 2 0 2 0 s e r ã o 1 5 m i l h o e s d e n o v o s c a s o s a c a d a a n o. D i a n t e d i s t o, d i v e r s o s e s t u d o s e s t ã o s e n d o r e a l i z a d o s n a t e n t a t i v a d e s e i d e n t i f i c a r a s p o s s í v e i s c a u s a s d e s s e a u m e n t o d e s o r d e n a d o d e c a s o s, e t a m b é m n a t e n t a t i v a d e a m e n i z a r o s e f e i t o s c a u s a d o s p o r e s t a p a t o l o gia. P e s q u i s a s e p i d e m i o l ó gicas s u gerem q u e 3 0 % d o s c a s o s d e c â n c e r e s t ã o l i gados à d i e t a, o n d e o c o n s u m o e x c e s s i v o d e gorduras e m e s p e c i a l a s s a t u r a d a s e d e á c i d o s grax o s p o l i i n s a t u r a d o s n - 6 ( A G P I n - 6 ), a s s o c i a d o à b a i x a i n gestão d e á c i d o s grax o s p o l i i n s a t u r a d o s n - 3 ( A G P I n - 3 ) f a c i l i t a m o a p a r e c i m e n t o d e d o e n ç a s c a r d i o v a s c u l a r e s e c â n c e r. E s t u d o s d e m o n s t r a m q u e o ó l e o d e p e i x e e o ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o, q u a n d o a d m i n i s t r a d o s i s o l a d a m e n t e, a p r e s e n t a m c a p a cidade d e r e d u z i r o c r e s c i m e n t o t u m o r a l. N o e n t a n t o, o m e c a n i s m o p e l o q u a l e s t e s ó l e o s a t u a m a i n d a n ã o é c o n h e c i d o, n e m m e s m o o e f e i t o d a s u p l e m e n t a ç ã o c o n j u n t a d e s t e s ó l e o s. N e s t e t r a b a l h o f o i p r o p o s t o i n v e s t i gar o e f e i t o d a suplementação i s o l a d a e conjunta de óleo de peixe e óleo d e f í gado d e t u b a r ã o s o b r e o c r e s c i m e n t o e a p e r o x i d a ç ã o l i p í d i c a d o t u m o r d e W a l k e r 2 5 6. P a r a i s s o f o i d e t e r m i n a d o o p e s o d o t u m o r, a c o m p o s i ç ã o d e á c i d o s grax o s d a r a ç ã o f o r n e c i d a a o s a n i m a i s, a c o m p o s i ç ã o d e á c i d o s grax o s d o t u m o r e d o s ó l e o s u t i l i z a d o s n a s u p l e m e n t a ç ã o e a t a x a d e p e r o x i d a ç ã o l i p í d i c a d o t u m o r. R a t o s W i s t a r m a c h o s d e 2 1 d i a s f o r a m d i v i d i d o s e m q u a t r o grupos: r a t o s c o n t r o l e s e m s u p l e m e n t a ç ã o ( W ), r a t o s s u b m e t i d o s a s u p l e m e n t a ç ã o c r ô n i c a c o m ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o ( W A ), ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o + ó l e o d e p e i x e ( W A O ) e ó l e o d e p e i x e ( W O ), p o r 7 0 d i a s n a d o s e d e 1 g/ K g p. c. A p ó s e s t e p e r í o d o, f o i i n o c u l a d a s u s p e n s ã o d e c é l u l a s d e t u m o r W a l k e r 2 5 6 c o n t e n d o 3 x 1 0 7 c é l u l a s / m L, 1 4 d i a s a p ó s a i n o c u l a ç ã o, o s a n i m a i s f o r a m o r t o t a n a z i a d o s e m a s s a t u m o r a l r e t i r a d a e p e s a d a. A s s u p l e m e n t a ç õ e s c o m ó l e o d e p e i x e ( W O e W A O ) e c o m ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o ( W A ) r e d u z i r a m o c r e s c i m e n t o t u m o ral n o s a n i m a i s, b e m c o m o, a p e r o x i d a ç ã o l i p í d i c a. E s s e s r e s u l t a d o s, s u gerem q u e a s u p l e m e n t a ç ã o c o m ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o, c o m ó l e o d e p e i x e e c o m ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o + ó l e o d e p e i x e p r o m o v e m a r e d u ç ã o t u m o r a l p a r c i a l m e n t e a t r a v é s d a p e r o x i d a ç ã o l i p í d i ca.
1. I n t r o d u ç ã o 7 1. 1. C â n c e r C â n c e r é c a r a c t e r i z a d o p e l o a u m e n t o d e s o r d e n a d o e i n c o n t r o l a d o d o n ú m e r o d e c é l u l a s q u e, a o a l c a n ç a r e m d e t e r m i n a d a m a s s a, a c a b a m p o r i n v a d i r e c o m p r i m i r o s t e c i d o s v i z i n h o s. E s s e p r o c e s s o o c o r r e a t r a v é s d e a l t e r a ç õ e s n o s genes q u e c o n t r o l a m a p r o l i f e r a ç ã o e o c r e s c i m e n t o c e l u l a r. A s c é l u l a s geradas s ã o p r o p e n s a s a o r á p i d o c r e s c i m e n t o, f o r m a n d o t u m o r e s. O s t u m o r e s f o r m a d o s p o d e m s e r b e n i gnos o u m a l i gnos. O s t u m o r e s b e n i gnos s ã o r e v e s t i d o s p o r c á p s u l a f i b r o s a q u e garantem s u a r e t i r a d a s e m m a i o res d a n o s a o o r ganismo. E n t r e t a n t o, o s t u m o r e s m a l i gnos t ê m a p r o p r i e d a d e d e e n t r a r n a c o r r e n t e s a n guínea e v a s o s l i n f á t i c o s, e x p r e s s a n d o f o r m a s s e c u n d á r i a s d e t u m o r o u m e t á s t a s e s e m o u t r o s s í t i o s d o c o r p o ( A LBERTS et a l, 2 0 0 4 ). O c â n c e r p o d e s e r c l a s s i f i c a d o d e a c o r d o c o m o t i p o c e l u l a r o u t e c i d o d e o n d e p r o v é m ; e m q u e o s d a s c é l u l a s e p i t e l i a i s são os carcinomas; das m u s c u l a r e s e d o t e c i d o c o n e c t i v o, o s s a r c o m a s ; e n a s c é l u l a s d o s a n gue, a s l e u c e m i a s. E m b o r a a i n d a d e s c o n h e c i d a a e t i o l o gia d o p r o c e s s o c a r c i n o gênico, d i v e r s o s f a t o r e s p o d e m e s t a r e n v o l v i d o s n o d e s e n v o l v i m e n t o t u m o r a l, d e n t r e e l e s o f u m o, i n f e c ç õ e s e c a r c i n ó genos p r e s e n t e s n a d i e t a alimentar ( C U R I e t a l, 2 0 0 2 ). E s t e s f a t o r e s a c a b a m t r a n s f o r m a n d o a c é l u l a n o r m a l e m c é l u l a a n o r m a l a q u a l p r o l i f e r a - s e s e m c o n t r o l e a t é a t o t a l d e b i l i d a d e d o p o r t a d o r ( F E R N A N D E S, 1 9 9 5 ). D e t o d o s o s c a s o s, 8 0 % a 9 0 % d o s c â n c e r e s e s t ã o a s s o c i a d o s a f a t o r e s a m b i e n t a i s. A l guns d e l e s s ã o b e m c o n h e c i d o s : o c i garro p o d e c a u s a r c â n c e r d e p u l m ã o, a e x p o s i ç ã o e x c e s s i v a a o s o l p o d e c a u s a r c â n c e r d e p e l e, e a l guns v í r u s p o d e m c a u s a r l e u c e m i a ( BRASIL, M i n i s t é r i o d a S a ú d e, 2 0 0 8 ). O e n v e l h e c i m e n t o t r a z m u d a n ç a s n a s c é l u l a s q u e a u m e n t a m a s u a s u s c e t i b i l i d a d e à t r a n s formação m a l i gna. Is s o, s o m a d o a o f a t o d e a s c é l u l a s d a s p e s s o a s i d o s a s t e r e m s i d o
8 e x p o s t a s p o r m a i s t e m p o a o s d i f e r e n t e s f a t o r e s d e r i s c o p a r a c â n c e r, e x p l i c a e m p a r t e o p o r q u ê d e o c â n c e r s e r m a i s f r e q ü e n t e n e s s e s i n d i v í d u o s ( BRASIL, M i n i s t é r i o d a S a ú d e, 2 0 0 8 ). N o Brasil, a s e s t i m a t i v a s p a r a o a n o d e 2 0 0 8 e v á l i d a s t a m b é m p a r a o a n o 2 0 0 9, a p o n t a m q u e o c o r r e r ã o 4 6 6. 7 3 0 c a s o s n o v o s d e c â n c e r. O s t i p o s m a i s i n c i d e n t e s s e r ã o o s c â n c e r e s d e p r ó s t a t a e d e p u l m ã o n o s e x o m a s c u l i n o e o s c â n c e r e s d e m a m a e c o l o d o ú t e r o n o s e x o f e m i n i n o ( IN C A, 2 0 0 8 ). 1. 2. T u mo r d e W a l k e r 2 5 6 O t u m o r de W a l k e r 256 é u m c a r c i n o s a r c o m a q u e s e d esenvolveu e s p o n t a n e a m e n t e n a r e gião d a glândula m a m á r i a d e u m a r a t a grávida, e f o i d e s c r i t o e m 1 9 2 8 p o r G e o r ge W a l k e r n o J o h n `s H o p k i n s U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e. E s t a v a l o c a l i z a d o n a p a r e d e a b d o m i n a l e s q u e r d a c o m t a m a n h o s e m e l h a n t e a o d e u m a n o z. E s s e t u m o r f o i t r a n s p l a n t a d o e m r a t o s S h e r m a n p o r i n o c u l a ç ã o s u b c u t â n e a, s e n d o p a l p á v e l e m u m a s e m a n a e, l e v a n d o a m o r t e d o s a n i m a i s a p ó s s e i s s e m a n a s. A p ó s 1 5 d i a s d o t r a n s p l a n t e s u b c u t â n e o, o t u m o r f o i d e s c r i t o c o m o u m a m a s s a f i r m e, e s f é r i c a, l o b u l a d a e p a r c i a l m e n t e e n c a p s u l a d a, p r o m o v e n d o m e t á s t a s e s n o s l i n f o n o d o s p u l m o n a r e s, r e gionais e o c a s i o n a l m e n t e r e t r o p e r i t o n i a i s ( D U N N, 1 9 4 5 ; LIK E LY ; S A N F O R D ; E A R LE, 1 9 5 2 ; M ID E R ; T E S LU K ; M O R T O N, 1 9 4 8 ; M c C O Y & NEUMAN, 1956). D o i s s u b t i p o s d e c a r c i n o m a s d e W a l k e r 2 5 6 t ê m s i d o i n v e s t i gados p o r a p r e s e n t a r d i f e r e n ç a s m a r c a n t e s n a i n t e r a ç ã o c o m o o r ganismo do h o s p e d e i r o. O t i p o A, i n v a s i v o e m e t a s t a t i z a n t e, t e m u m l e n t o r i t m o d e c r e s c i m e n t o i n d u z i n d o a a n o r e x i a e caquex i a s o m e n t e n a f a s e t e r m i n a l, garantindo u m a s o b r e v i v ê n c i a m é d i a d e 2 7 d i a s. A o c o n t r á r i o, o t i p o B, n ã o i n v a s i v o e d e c r e s c i m e n t o r á p i d o, i n d u z a a n o r e x i a e a c a q u e x i a p r e c o c e c o m s o b r e v i d a d e m a i s o u m e n o s 1 5
d i a s. Lo go, e s s e ú l t i m o t o r n o u - s e u m i m p o r t a n t e m o d e l o p a r a e s t u d o s d a c a q u e x i a i n d u z i d a p e l o c â n c e r ( G U A IT A N I e t. a l., 1 9 8 3 ). 9 1. 3. Á c i d o s Graxos Poliinsaturados Á c i d o s grax o s s ã o á c i d o s c a r b o x í l i c o s p r e s e n t e s n a s gorduras n a t u r a i s e geralmente s e a p r e s e n t a m c o m o c a d e i a s l i n e a r e s c o m n ú m e r o p a r d e á t o m o s d e c a r b o n o ( A BAYASEKARA;WATHES,1999). Á c i d o s grax o s p o d e m s e r s a t u r a d o s, s e m a p r e s e n ç a d e d u p l a s l i gações; m o n o i n s a t u r a d o s, p r e s e n ç a d e u m a d u p l a l i gação, e p o l i i n s a t u r a d o s, p r e s e n ç a d e d u a s d u p l a s l i gações ( BRIT IS H N U T R IT IO N F O U N D A T IO N, 1 9 9 9 ). O á c i d o l i n o l é i c o ( 1 8 : 2 n - 6 ) é o p r e c u r s o r d o s á c i d o s grax o s ô m e ga-6 ( ω - 6 ), e n q u a n t o o á c i d o α - l i n o l ê n i c o ( 1 8 : 3 n - 3 ) é o p r e c u r s o r d o s á c i d o s grax o s ô m e ga-3 ( ω - 3 ). E s s e s á c i d o s grax o s s ã o d e n o m i n a d o s e s s e n c i a i s p o i s t e c i d o s d e a n i m a i s n ã o p o d e m s i n t e t i z á - l o s. Assim portanto esses ácidos grax o s devem ser f o r n e c i d o s n a d i e t a ( A BAYASEKARA;WATHES,1999). P a r t i c u l a r m e n t e, e m r e l a ç ã o a o ω - 3, s o m e n t e a p a r t i r d e 1 9 8 0 d e s c o b r i u - s e s u a n e c e s s i d a d e n a d i e t a, c o n s i d e r a n d o - s e s u a s p r o p r i e d a d e s p r o f i l á t i c a s n o q u e d i z r e s p e i t o a o a p a r e c i m e n t o d e d i s t ú r b i o s n e u r o l ó gicos e v i s u a i s ( C U R I; M IY A S A K A ; P R O C Ó P IO, 2 0 0 2 ). A l é m d i s s o, o c o n s u m o d e p e i x e s, grandes f o n t e s d e ω - 3 d e c a d e i a l o n ga, reduz de m a n e i r a s i gnificativa o r i s c o d e d o e n ç a s c a r d i o v a s c u l a r e s ( H E R IM M ; M E R C H A N T ; R O S N E R ; S T M P F E R ; W ILLE T T ; A S C H E R IO, 2 0 0 2 ). E n t r e o u t r o s e f e i t o s, o s á c i d o s grax o s p o l i i n s a t u r a d o s d a f a m í l i a ω - 3 q u a n d o e m grandes q u a n t i d a d e s a p r e s e n t am e f e i t o s u p r e s s o r, i n i b i n d o p r o l i f e r a ç ã o d e l i n f ó c i t o s, a p r o d u ç ã o d e a n t i c o r p o s e c i t o c i n a s, a e x p r e s s ã o d e m o l é c u l a s d e a d e s ã o e a a t i v i d a d e d e c é l u l a s c i t o t ó x i c a s ( C U R I; M IY A S A K A ; P R O C Ó P IO, 2 0 0 2 ). S u a i n gestão s o b a f o r m a d e ó l e o d e p e i x e, r e d u z a p r o d u ç ã o
1 0 d e c i t o c i n a s, i n t e r l e u c i n a 1 ( IL- 1 ) i n t e r l e u c i n a 6 ( IL- 6 ), f a t o r d e n e c r o s e t u m o r a l ( T N F ) p o r c é l u l a s m o n o n u c l e a r e s. E m a d i ç ã o, e s s e e f e i t o s e m a n t é m p o r v á r i a s s e m a n a s a p ó s a i n t e r r u p ç ã o d e s u a i n gestão ( C O O P E R ; G IBBONS; H O R A N ; LIT T LE ; R O T H W E LL, 1 9 9 3 ). 1. 4. A l q u i l g l i c e r ó i s É t e r e s l i p í d i c o s s ã o s u b s t â n c i a s q u í m i c a s c o m p r o n u n c i a d a a t i v i d a d e b i o l ó gica. O s a l q u i l gliceróis, u m d o s r epresentantes d e s s e grupo, e n c o n t r a m - s e p r e s e n t e s n a m e d u l a ó s s e a h u m a n a, n o l e i t e m a t e r n o, n o l e i t e d e v a c a e n o ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o (BROHULT, BROHULT, BROHULT, JOELSSON, 1986). O c o n t e ú d o l i p í d i c o d a s c é l u l a s d e f í gado d e t u b a r ão d e d i v e r s a s e s p é c i e s t e m s i d o e s t u d a d o e r e l a t a d o n a l i t e r a t u r a d e s d e o s m e a d o s d e 1 9 5 0. D e s t e c o n t e ú d o l i p í d i c o, c e r c a d e 3 0 % a 5 0 % c o r r e s p o n d e m a m o l é c u l a s d e a l q u i l gliceróis, gorduras c o n s t i t u í d a s p o r u m a c a d e i a h i d r o c a r b ô n i c a, s a t u r a d a o u i n s a t u r ada, u n i d a p o r l i gação d o t i p o é t e r a u m a d a s h i d r o x i l a s d o glicerol ( BROHULT e t a l., 1 9 7 7 ). O s a l q u i l gliceróis m a i s c o m u n s s ã o d e n o m i n a d o s d e á l c o o i s q u i m i l, b a t i l e s e l a q u i l, d e v i d o a o n ú m e r o d e á t o m o s d e c a r b o n o n a c a d e i a a l i f á t i c a, q u e v a r i a d e 1 6 a 1 8, e o n u m e r o d e á t o m o s d e h i d r o gênio, de 33 a 35 (Figura 1). Fi g u r a 1 : E s t r u t u r a q u í m i c a d a s m o l é c u l a s d e a l q u i l glicerol mais c o m u n s.
1 1 A p r e s e n ç a d e grupo m e t ó x i ( - O C H 3 ) n o i n í c i o d a c a d e i a a l i f á t i c a e m s u b s t i t u i ç ã o a o h i d r o gênio, c o n f e r e e s t i m u l a ç ã o d a r e s p o s t a i m u n o l ó gica e i m u n o m o d u l a ç ã o, a t i v i d a d e a n t i f ú n gica, e e m c u l t u r a s d e c é l u l a s d e m o n s t r a r a m e f e i t o s c i t o t ó x i c o s s o b r e c é l u l a s t u m o r a i s e r e d u ç ã o d e m e t á s t a s e s ( BROHULT e t a l., 1 9 8 6 ). A l guns e s t u d o s q u e i n v e s t i garam o s e f e i t o s d o a l q u i l glicerol s o b r e a p r o l i f e r a ç ã o c e l u l a r e m d i f e r e n t e s l i n h a s d e c â n c e res h u m a n o s, m o s t r a r a m o c o r r e r r e d u ç ã o s i gnificativa n a c o l ô n i a d e c é l u l a s t u m o r a i s d a p r ó s t a t a, b e m c o m o a u m e n t o d a a p o p t o s e t a n t o n a p r ó s t a t a q u a n t o o v á r i o, e p r e d o m i n a n t e n e c r o s e e m carcinomas m a m á r i o s (KROTKIEW SKI; PRZYBYSZEW SKA;JANIK, 2003). S e u s e f e i t o s, t a m b é m e s t ã o r e l a c i o n a d o s à p r e v e n ç ã o d e l e u c o p e n i a, t r o m b o c i t o p e n i a, e a s u a a d m i n i s t r a ç ã o a p a c i e n t e s c o m c â n c e r d e c o l o u t e r i n o r e s u l t a m e m t a x a s d e s o b r e v i v ê n c i a m a i s a l t a s c o m p a r a n d o - s e a p e n a s à a d m i n i s t r a ç ã o d a t e r a p i a r a d i o a t i v a (BROHULT; BROHULT; BROHULT, 1970). 1. 5. Á c i d o s Graxos e câncer D e s d e 1 9 6 0, e s t u d o s e p i d e m i o l ó gicos s u gerem h a v e r c o r r e l a ç ã o e n t r e c o n s u m o d e d e t e r m i n a d o s á c i d o s grax o s e a p a r ecimento d e t u m o r e s ( R O Y N E T T E e t a l., 2 0 0 4 ). H á e s t i m a t i v a d e q u e 3 0 % d e t o d o s o s c a s o s e s t e j a m l i gados à d i e t a, d e m o n s t r a n d o q u e o c o n s u m o e x c e s s i v o d e gorduras s a t u r a d a s e á c i d o s grax o s n - 6, e a b a i x a i n gestão d e á c i d o s grax o s n - 3, f a c i l i t a m o a p a r e c i m e n t o d e d o e n ç a s c a r d i o v a s c u l a r e s e c â n c e r ( M c E N T E E e t a l., 2 0 0 2 ). E m p o p u l a ç õ e s c o m o à s d o A l a s c a e d a G r o e n l â n d i a, a i n c i d ê n c i a d e c â n c e r é r e l a t i v a m e n t e b a i x a q u a n d o comparada c o m a q u a n t i d a d e de gordura consumida. S u gere-se que o consumo d e grande q u a n t i d a d e d e á c i d o s grax o s n - 3, p r e s e n t e s e m a n i m ais m a r i n h o s q u e e l e s c o n s o m e m, e x e r ç a e f e i t o p r o t e t o r n e s t a s p o p u l ações
1 2 ( C U R I, 2 0 0 2 ). O s á c i d o s grax o s e s s e n c i a i s n - 3 e n - 6 s ã o m e t a b o l i c a m e n t e e f u n c i o n a l m e n t e d i s t i n t o s c o m o c i t a d o a n t e r i o r m e n t e. E n t r e t a n t o, p a r a o b o m f u n c i o n a m e n t o d o o r ganismo d e m a m í f e r o s, u m a r a z ã o 7:1 entre a i n gestão destes dois ácidos grax o s é c o n s i d e r a d a fundamental p a r a a p e r f e i t a s a ú d e e b o m d e s e n v o l v i m e n t o d o o r ganismo. E s t e s l i p í d i o s s ã o c a p a z e s d e m o d u l a r e m a p r o d u ç ã o d e e i c o s a n ó i d e s, m o d i f i c a r a e x p r e s s ã o gênica, a l t e r a r o m e t a b o l i s m o e n e r gético, f u n ç ã o i m u n i t á r i a, f l u i d e z d a s m e m b r a n as, e n t r e o u t r a s ( C U R I e t a l, 2 0 0 2 ). P o r e s t e m o t i v o, s e u s e f e i t o s n o s d i v e r s o s t i p o s d e c â n c e r, n o s p r o c e s s o s d e m e t á s t a s e e a n giogênese t ê m s i d o i n v e s t i gados. 1. 6. Peroxidação lipídica U m p o s s í v e l m e c a n i s m o p e l o q u a l o s A G n - 3 p o d e r i a m e s t a r a t u a n d o n a i n i b i ç ã o d o d e s e n v o l v i m e n t o t u m o r a l é a t r a v é s d a l i p o p e r o x i d a ç ã o ( LP O ), q u e p o d e s e r d e f i n i d a c o m o u m a c a s c a t a d e e v e n t o s b i o q u í m i c o s r e s u l t a n t e s d a a ç ã o d e r a d i c a i s l i v r e s s o b r e l i p í d i o s d e m e m b r a n a s c e l u l a r e s ( C U R I e t a l, 2 0 0 2 ). O s r a d i c a i s l i v r e s p r o m o v e m a i n c o r p o r a ç ã o d e u m o x i gênio molecular a um ácido grax o p o l i i n s a t u r a d o p r e s e n t e n a m e m b r a n a d a s c é l u l a s, f o r m a n d o h i d r o p e r ó x i d o s c o m o p r o d u t o p r i m á r i o. O s p r o d u t o s d a s u a o x i d a ç ã o ( l i p o p e r ó x i d o s ) t ê m p r o p r i e d a d e s c i t o t ó x i c a s n a s c élulas t u m o r a i s ( S U A R É Z, e t a l, 1 9 9 6 ). O s p r o d u t o s d a LP O p o d e m c a u s a r a l t e r a ç õ e s n a m e m b r a n a e e s t r u t u r a d a s c é l u l a s, a l t e r a ç õ e s d o c i t o e s q u e l e t o, l e v a n d o a c é l u l a a e n t r a r e m a p o p t o s e ( ZANETTI, R. e t a l, 2 0 0 0 ). O a c ú m u l o d e á c i d o s grax o s p o l i i n s a t u r a d o s n a m e m b r a n a p r o p i c i a o a t a q u e d e a l gumas e s p é c i e s r e a t i v a s, q u e a b s t r a e m u m á t o m o d e h i d r o gênio d o grupo m e t i l e n o d a c a d e i a e i n i c i a o p r o c e s s o d e p e r o x i d a ç ã o l i p í d i c a, a u m e n t a n d o a p r o d u ç ã o d e m a i s r a d i c a i s
l i v r e s ( F i gura 2 ). E s s e s r a d i c a i s l i v r e s a t a c a m D N A e R N A d a c é l u l a t u m o r a l, c a u s a n d o s u a d e s t r u i ç ã o ( A LBERTS et al., 2004). 1 3
1 4 Fi g u r a 2 : P e r o x i d a ç ã o l i p í d i c a : u m a r e a ç ã o e m c a d e i a. F o n t e: H a l i w e l l & Gutteridge (1991)
2. O b j e t i v o s 1 5 T e m s i d o d e m o n s t r a d o q u e o ó l e o d e p e i x e e o ó l e o d e f í gado de t u b a r ã o, q u a n d o a d m i n i s t r a d o s i s o l a d a m e n t e, a p r e s e n t a m c a p a c i d a d e d e r e d u z i r o c r e s c i m e n t o d e v á r i o s t u m o r e s. N o e n t anto, o m e c a n i s m o p e l o q u a l e s t e s ó l e o s a t u a m a i n d a n ã o é c o n h e c i d o, n e m m e s m o o e f e i t o d a s u p l e m e n t a ç ã o c o n j u n t a d e s t e s ó l e o s. E s t e t r a b a l h o t e m c o m o o b j e t i v o i n v e s t i gar o e f e i t o d a s u p l e m e n t a ç ã o i s o l a d a e c o n j u n t a d e ó l e o d e p e i x e e ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o s o b r e o c r e s c i m e n t o e a p e r o x i d a ç ã o l i p í d i c a d o t u m o r d e W a l k e r 2 5 6.
3. M a t e r i a i s e M é t o d o s 1 6 3. 1. L o c a l E s t e t r a b a l h o d e c o n c l u s ã o d e c u r s o f o i r e a l i z a d o n o La b o r a t ó r i o d e M e t a b o l i s m o C e l u l a r, n o D e p a r t a m e n t o d e F i s i o l o gia, S e t o r d e C i ê n c i a s Biológicas da Universidade Federal do Paraná. 3. 2. A mo s t r a P a r a o s e x p e r i m e n t o s f o r a m u t i l i z a d o s r a t o s d a l i n h a gem W i s t a r d o s e x o m a s c u l i n o c e d i d o s p e l o Biotério do Setor de Ciências Biológicas d a U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o P a r a n á. T o d o s o s a n i m a i s r e c e b e r a m á gua e r a ç ã o à v o n t a d e, f o r a m s u b m e t i d o s a c i c l o c l a r o / escuro d e 1 2 / 1 2 h o r a s e m a n t i d o s e m a m b i e n t e c o m t e m p e r a t u r a c o n t r o l a d a ( 2 3 C ± 2 C ). T o d o s o s p r o c e d i m e n t o s e n v o l v e n d o a n i m a i s f o r a m a p r o v a d o s p e l o C o m i t ê de Ética em Experimentação Animal do S etor d e C i ê n c i a s Biológicas. 3. 3. Protocolo experimental O s a n i m a i s, a p ó s o d e s m a m e ( 2 1 d i a s ), f o r a m s e p a r a d o s e m q u a t r o grupos c o n t e n d o c i n c o a n i m a i s c a d a, d e a c o r d o c o m o t i p o d e s u p l e m e n t a ç ã o : grupo n ã o s u p l e m e n t a d o ( W ), grupo s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e p e i x e ( W O ), grupo s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e p e i x e e ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o ( W A O ) e grupo s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e f í gado de tubarão (WA). E s t e s grupos r e c e b e r a m s u a s r e s p e c t i v a s s u p l e m e n t a ções ( 1 g/kg p. c. ) c o m a u x í l i o d e m i c r o p i p e t a a t é c o m p l e t a r e m 7 0 d i a s. A p ó s e s t e p e r í o d o, t o d o s o s a n i m a i s d o s d i f e r e n t e s grupos s o f r e r a m i n o c u l a ç ã o s u b c u t â n e a n o f l a n c o d i r e i t o d e 1 m L d e s u s p e n s ã o d e c é l u l a s d o t u m o r d e W a l k e r 2 5 6, c o n t e n d o 3 x 1 0 7 c é l u l a s / m L, e c o n t i n u a r a m
1 7 r e c e b e n d o s u p l e m e n t a ç ã o p o r m a i s 2 s e m a n a s. O s a n i m a i s f o r a m o r t o t a n a s i a d o s n o 1 4 º d i a a p ó s a i n o c u l a ç ã o d o t u m o r. O t u m o r f o i e n t ã o r e t i r a d o, p e s a d o, e f r a gm e n t o s f o r a m s e p a r a d o s e c o n gelados p a r a d e t e r m i n a ç ã o d e h i d r o p e r ó x i d o s e p a r a a n á l i s e d a c o m p o s i ç ã o d e á c i d o s grax o s p o r c r o m a t o grafia l í q u i d a d e a l t a p e rformance ( H P LC ). D u r a n t e t o d o e x p e r i m e n t o, o s a n i m a i s f o r a m p e s a d o s a c a d a d o i s d i a s n o p e r í o d o d a m a n h ã. 3. 4. O b t e n ç ã o e t r a n s p l a n t e d a s c é l u l a s d o t u mo r d e W a l k e r 2 5 6 E m u m r a t o m a c h o a d u l t o f o i i n j e t a d o i n t r a p e r i t o n e almente 1 m L d e s u s p e n s ã o d e 2 x 1 0 7 c é l u l a s d o t u m o r d e W a l k e r 2 5 6 t i p o B. A p ó s u m p e r í o d o d e c i n c o d i a s, q u a n d o c o n s t a t a d a a a s c i t e, o a n i m a l f o i o r t o t a n a s i a d o e i n j e t a d o 1 0 m L d e s o l u ç ã o s a l i n a 0, 9 % e m s u a c a v i d a d e a b d o m i n a l. E m s e guida, s e u a b d ô m e n f o i m a s s a geado e a t r a v é s d e l a p a r o t o m i a m e d i a n a, f o i r e t i r a d o d a c a v i d a d e a b d o m i n a l, c o m p i p e t a d e p l á s t i c o t i p o P a s t e u r, o f l u i d o c o n t e n d o a s c é l u l a s t u m o r a i s. A c o n t a gem d o n ú m e r o d e c é l u l a s t u m o r a i s f o i r e a l i z a d a a t r a v é s d o u s o d e c â m a r a d e N e u b a u e r. D a a s c i t e o b t i d a, o m e s m o n ú m e r o d e c é l u l a s f o i i n o c u l a d o s u b c u t a n e a m e n t e n o f l a n c o d i r e i t o, n o s a n i m a i s e m e x p e r i m e n t a ç ã o. A s c é l u l a s t u m o r a i s, f o r a m c e d i d a s gentilmente p e l o D r. R u i C u r i d a U S P e m 1 9 9 2, e a p a r t i r d e e n t ã o, s ã o m a n t i d a s n o l a b o r a t ó r i o d e m e t a b o l i s m o c e l u l a r d a U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o P a r a n á p a r a a i n d u ç ã o e m r a t o s e x p e r i m e n t a i s, m i m e t i z a n d o a s s i m o c o m p o r t a m e n t o o n c o l ó gico e m r e l a ç ã o a o s c â n c e r e s e n c o n t r a d o s e m s e r e s h u m a n o s.
3. 5. Peroxidação lipídica 1 8 F o i u t i l i z a d a a m e t o d o l o gia d e s c r i t a p o r N o u r o o z - Zadeh e t a l ( 1 9 9 4 ), a p l i c a d a a o e x t r a t o m e t a n ó l i c o d a s a m o s t r a s. O e x t r a t o m e t a n ó l i c o f o i o b t i d o p e l a h o m o geneização d e 3 0 0 m g d e t e c i d o e m 1 m L d e m e t a n o l, u t i l i z a n d o - s e u m homogeneizador (Bosch GGS 27). O h o m o genato f o i e n t ã o c e n t r i f u gado a 5 0 0 0 g, p o r 5 m i n u t o s, a 4 C. P a r a c a d a a m o s t r a, a l í q u o t a s d e 9 0µL d o s o b r e n a d a n t e f o r a m c o l o c a d a s e m t u b o s d e e n s a i o ( 1, 5 m L d e c a p a c i d a d e ). E m t r ê s d e s t e s t u b o s f o r a m a d i c i o n a d o s 1 0µL d e s o l u ç ã o m e t a n ó l i c a d e t r i f e n i l f o s f i n a ( T P P, S i gm a ) a 1 0 m M, p a r a o c o r r e r a r e d u ç ã o s e l e t i v a d e h i d r o p e r ó x i d o s ( o s grupamentos h i d r o p e r ó x i d o s, e s p e c i f i c a m e n t e o s p r e s e n t e s e m l i p í d i o s, s ã o c o n v ertidos a grupamentos h i d r o x i l a p e l a t r i f e n i l f o s f i n a ). A s a m o s t r a s c o n t i d a s e m o u t r o s t r ê s t u b o s r e s t a n t e s r e c e b e r a m a p e n a s 1 0µL d e m e t a n o l. T o d o s o s t u b o s f o r a m a gitados v i gorosamente e e n t ã o i n c u b a d o s e m t e m p e r a t u r a a m b i e n t e p o r 3 0 m i n u t o s. A o f i n a l d e s t e p e r í o d o d e i n c u b a ç ã o f o i a d i c i o n a d o a c a d a t u d o 9 0 0µL d o r e a gente F O X 2. E s t e r e a gente f o i r e p a r a d o n o m o m e n t o d o u s o, c o n s i s t i n d o d e x i l e n o l l a r a n j a 1 0 0µM, h i d r o x i t o l u e n o b u t i l a d o ( BHT) 4 m M, á c i d o s u l f ú r i c o 2 5 m M e s u l f a t o f e r r o s o d e a m ô n i o 2 5 0µM, e m m e t a n o l 9 0 % ( v : v, e m á gua). A p ó s a gitação, a s a m o s t r a s f o r a m i n c u b a d a s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e p o r m a i s 3 0 m i n u t o s. N e s t a e t a p a, o s c á t i o n s f e r r o s o s ( F e ² + ) d o r e a t i v o d e F O X 2 s ã o o x i d a d o s p e l o s h i d r o p e r ó x i d o s p r e s e n t e s n a a m o s t r a ( t a n t o p e l o s h i d r o p e r ó x i d o s l i p í d i c o s q u a n t o p o r o u t r o s t i p o s d e h i d r o p e r ó x i d o s p r e s e n t e s n a a m o s t r a ). C o m o t o d o s o s h i d r o p e r ó x i d o s l i p í d i c o s d a s a m o s t r a s t r a t a d a s c o m T P P f o r a m r e d u z i d o s, a p r o d u ç ã o d e F e ³ + s e r á m e n o r n e s t a s d o q u e n a s a m o s t r a s n ã o t r a t a d a s c o m T P P. O F e ³ + f o r m a d o é e n t ã o q u e l a d o p e l o x i l e n o l l a r a n j a, o q u e f a z a c o r d e s t e i n d i c a d o r p a s s a r d e l a r a n j a a a z u l - p ú r p u r a ( p a s s a a a b s o r v e r l u z e m 5 6 0 n m ). Ao final do t e m p o d a i n c u b a ç ã o, a a b s o r b â n cia f o i m e n s u r a d a
1 9 a 5 6 0 n m. S u b t r a i u - s e e n t ã o o v a l o r d a a b s o r b â n c i a d a s a m o s t r a s t r a t a d a s c o m T P P ( s e m h i d r o p e r ó x i d o s l i p í d i c o s ) d o v a l o r d a a b s o r b â n c i a das amostras sem TPP. O valor o b t i d o p o r e s s a s u b t r a ç ã o, r e f e r e n t e a p e n a s a q u a n t i d a d e d e f e r r o o x i d a d o p o r h i d r o p e r ó x i d o s l i p í d i c o s, f o i u t i l i z a d o n a f ó r m u l a d a c u r v a p a d r ã o d e p e r ó x i d o d e h i d r o gênio, o b t i d a c o m s o l u ç õ e s p a d r ã o d e d i f e r e n t es c o n c e n t r a ç õ e s ( 1 0 0. 0, 5 0. 0, 2 5. 0, 1 2. 5, 6. 2, 3. 1 e 1. 6 µm ) s u b m e t i d a s a o s m e s m o s p r o c e d i m e n t o s d e s c r i t o s a c i m a p a r a a d o s a gem d e h i d r o p e r ó x i d o s ( c o m e x c e ç ã o a o t r a t a m e n t o c o m T P P ). O r e s u l t a d o o b t i d o f o i r e f e r e n t e à c o n c e n t r a ç ã o d o h i d r o p e r ó x i d o s l i p í d i c o s. D i v i d i u - s e o v a l o r d a c o n c e n t r a ç ã o d e h i d r o p e r ó x i d o s l i p í d i c o s p e l a c o n c e n t r a ç ã o d e p r o t e í n a s t o t a i s d o e x t r a t o m e t a n ó l i c o. O s r e s u l t a d o s f o r a m e x p r e s s o s e m n m o l d e h i d r o p e r ó x i d o s / m g de proteína. 3. 6. A n á l i s e d e á c i d o s g r a x o s p o r H PL C 3. 6. 1. E x t r a ç ã o L i p í d i c a A e x t r a ç ã o l i p í d i c a f o i r e a l i z a d a s e gundo o m é t o d o d e F O LC H e t a l. ( 1 9 5 7 ). A s a m o s t r a s f o r a m a d i c i o n a d a s a 4 0 0µL d e P BS, 5 0 0µL d e m e t a n o l e 1 m L d e c l o r o f ó r m i o. A p ó s a gitação e c e n t rifugação p o r 1 m i n a 4 C e 4 5 3 g, a f a s e i n f e r i o r f o i t r a n s f e r i d a p a r a o u t r o t u b o. E s s e p r o c e d i m e n t o f o i r e p e t i d o p e l a a d i ç ã o d e 5 0 0µL d e m e t a n o l e 5 0 0µL d e c l o r o f ó r m i o n a s a m o s t r a s. A o s e x t r a t o s l i p í d i c o s f o i a d i c i o n a d o 1 m L d e s o l u ç ã o d e F o l c h ( c l o r o f ó r m i o / m e t a n o l / á gua, 3 : 4 8 : 4 7 ) s e guida d e a gitação e c e n t r i f u gação n a s m esmas c o n d i ç õ e s. O s o b r e n a d a n t e f o i d e s c a r t a d o e a f a s e o r gânica e v aporada e m f l u x o d e n i t r o gênio gasoso.
3. 6. 2. S a p o n i f i c a ç ã o 2 0 A p ó s a e x t r a ç ã o l i p í d i c a, f o i r e a l i z a d a a s a p o n i f i cação p e l o m é t o d o d e H A M ILT O N ; H A M ILT O N ( 1 9 9 2 ), m o d i f i c a d o p o r N IS H IY A M A - N A K U R E e t a l. ( 1 9 9 8 ). O s e x t r a t o s l i p í d i c o s f o r a m r e s s u s p e n d i d o s e m 1 0 0µL d e m e t a n o l e a e l e s foram adicionados 2 m L d e N a O H 0, 5 M e m m e t a n o l 9 0 %. A s a m o s t r a s f o r a m h o m o geneizadas e i n c u b a d a s s o b a gitação p o r 2 h a 3 7 C, p a r a h i d r ó l i s e a l c a l i n a. E m s e guida f o r a m r e s f r i a d a s e m i s t u r a d a s c o m 1, 5 m L d e á c i d o c l o r í d r i c o 1 M p a r a a c i d i f i c a ç ã o. O s á c i d o s grax o s f o r a m e n t ã o e x t r a í d o s t r ê s v e z e s c o m 1 m L d e h e x a n o. A s a m o s t r a s f o r a m s e c a s e m f l u x o d e n i t r o gênio gasoso. 3. 6. 3. D e r i v a t i z a ç ã o A d e r i v a t i z a ç ã o f o i r e a l i z a d a d e a c o r d o c o m o m é t o d o d e s c r i t o p o r A BUSHUFA e t a l. ( 1 9 9 4 ). A s a m o s t r a s f o r a m r e s s u s p e n s a s e m 1 0 0µL d e a c e t o n i t r i l a ( M e r c k ) e a gitadas. A p ó s 3 0 s e gundos, 1 0 0µL d o r e a gente A ( b r o m o m e t i l - m e t ó x i - c u m a r i n a 1 m g/ml e m a c e t o n i t r i l a ) e 1 0 0µL d o r e a gente B ( 1 8 - C r o w n - 6 e c a r b o n a t o d e p o t á s s i o e m a c e t o n i t r i l a e á gua) f o r a m a d i c i o n a d o s, s e guida d e a gitação e i n c u b a ç ã o p o r 1 5 m i n a 6 0 C e m b a n h o s e c o. A m i s t u r a f o i f i l t r a d a e a r m a z e n a d a a 8 C a t é o m o m e n t o da análise da composição dos ácidos grax o s p o r c r o m a t o grafia líquida de alta eficiência (HPLC ). 3. 6. 4. C r o ma t o g r a f i a L í q u i d a d e A l t a E f i c i ê n c i a O s á c i d o s grax o s f o r a m s e p a r a d o s e m u m a c o l u n a C - 8 d e f a s e r e v e r s a ( 2 5 0 m m c o m p r i m e n t o x 4, 6 m m d i â m e t r o i n t e rno x 5µm d i â m e t r o d a s p a r t í c u l a s ) e u m d e t e c t o r d e f l u o r e s c ência. O c o m p r i m e n t o d e o n d a d e e x c i t a ç ã o f o i d e 3 2 5 n m e d e e m i s s ã o d e 3 9 8
2 1 n m. O v o l u m e i n j e t a d o f o i d e 5 0µL e m f l u x o d e 1, 0 m L/ m i n. A f a s e m ó v e l e r a c o m p o s t a p o r a c e t o n i t r i l a e á gua, c u j o gradiente i n i c i a l e r a d e 7 7 % e 2 3 % e f i n a l d e 9 0 % e 1 0 % r e s p e c t i v a m e n t e. O t e m p o d e c o r r i d a f o i d e 5 5 m i n. F o r a m u t i l i z a d o s o s s e guintes padrões de á c i d o grax o s : á c i d o l á u r i c o ( C 1 2 : 0 ), á c i d o m i r í s t i c o ( C 1 4 : 0 ), á c i d o p a l m í t i c o ( C 1 6 : 0 ), á c i d o p a l m i t o l é i c o ( C 1 6 : 1 ), á c i d o e s t e á r i c o ( C 1 8 : 0 ), á c i d o o l é i c o ( C 1 8 : 1 ), á c i d o l i n o l é i c o ( C 1 8 : 2 ), á c i d o l i n o l ê n i c o ( C 1 8 : 3 ), á c i d o a r a q u i d ô n i c o ( C 2 0 : 4 ), á c i d o e i c o s a p e n t a e n ó i c o ( C 2 0 : 5 ) e á c i d o d o c o s a h e x a e n ó i c o ( C 2 2 : 6 ). 3. 7. A n a l i s e e s t a t í s t i c a O s d a d o s e s t ã o a p r e s e n t a d o s c o m o m é d i a ± e r r o p a d r ã o d a m é d i a. O s r e s u l t a d o s f o r a m s u b m e t i d o s à a n á l i s e d e v a r i â n c i a d e u m a v i a s e guido d e p ó s - t e s t e d e T u k e y. V a l o r p a r a p < 0, 0 5 f o i u t i l i z a d o p a r a a v a l i a r s i gnificância e s t a t í s t i c a. T e s t e t d e S t u d e n t f o i u t i l i z a d o e m a l gumas situações.
4. R e s u l t a d o s 2 2 4. 1. Peso dos tumo r e s O p e s o t u m o r a l d o s a n i m a i s n ã o s u p l e m e n t a d o s f o i d e 1 7, 1 ± 2, 1. A s s u p l e m e n t a ç õ e s c o m ó l e o d e p e i x e ( W O ), ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o ( W A ) e ó l e o d e p e i x e + ó l e o d e f í gado d e t u b arão ( W A O ) p r o m o v e r a m r e d u ç ã o d e c e r c a d e 5 0 % n o p e s o d o s t u m o r e s e m r e l a ç ã o a o grupo W ( p < 0, 0 0 1 ). N ã o h o u v e d i f e r e n ç a s i gnificativa e n t r e o s grupos W A e W A O, e e n t r e W A e W O ( p > 0, 0 5 t e s t e t ). O grupo W O f o i s i gnificativamente menor que WAO (p<0,05 teste t) (Figura 3). 20 gramas (g) 10 a a # a 0 W WA WO WAO F i g u r a 3. P e s o d o s t u m o r e s ( g ). W, s e m s u p l e m e n t a ç ã o ; W A, s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e f í g a d o d e t u b a r ã o ; W O, s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e p e i x e ; W A O, s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e f í g a d o d e t u b a r ã o e ó l e o d e p e i x e. R e s u l t a d o s o b t i d o s d e 3 e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d e n t e s. a p < 0, 0 0 1 e m r e l a ç ã o a W A N O V A d e u m a v i a e p ó s -t e s t e d e T u k e y # p < 0, 0 5 e m r e l a ç ã o a W A O t e s t e t
4. 2. D e t e r mi n a ç ã o d o p e r f i l d e á c i d o s g r a x o s p r e s e n t e s n o s ó l e o s d e p e i x e e d e f í g a d o d e t u b a r ã o 2 3 N a a m o s t r a d e ó l e o d e p e i x e a n a l i s a d a p o r H P LC ( F i gu r a 4 ) f o i e n c o n t r a d o 26,1% de ácido eicosapentaenóico (EPA) e 18,9% de á c i d o d o c o s a h e x a e n ó i c o ( D H A ). T a m b é m e s t a v a p r e s e n t e á c i d o p a l m í t i c o ( 1 3, 5 % ), á c i d o m i r í s t i c o ( 1 1, 4 % ), á c i d o p a l m i t o l é i co ( 1 0, 1 % ), á c i d o o l é i c o ( 8, 7 % ) e á c i d o l á u r i c o ( 7, 1 % ). O s á c i d o s l i n o l ê n i c o, a r a q u i d ô n i c o, l i n o l é i c o e e s t e á r i c o a p r e s e n t a r a m - s e e m c o n c e n t r a ç õ e s i n f e r i o r e s a 2 %. O s á c i d o s grax o s i n s a t u r a d o s c o r r e s p o n d e r a m a 6 6, 6 % d o s á c i d o s grax o s t o t a i s d o ó l e o d e p e i x e, e n q u a n t o o s s a t u r a d o s a 3 3, 4 %. N o ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o f o i d e t e c t a d o 5, 4 % d e E P A e 1 2 % d e D H A, o q u e r e p r e s e n t o u u m a m e n o r c o n c e n t r a ç ã o d e á c i d o s grax o s p o l i i n s a t u r a d o s n - 3 q u e a e n c o n t r a d a n o ó l e o d e p e i x e. N e s t e ó l e o t a m b é m f o i d e t e c t a d o á c i d o l á u r i c o ( 2 8, 3 % ), á c i d o o l é i c o ( 2 4, 3 % ), á c i d o p a l m í t i c o ( 1 3, 2 % ), e o á c i d o m i r í s t i c o ( 4, 8 % ). O s á c i d o s l i n o l ê n i c o, a r a q u i d ô n i c o, l i n o l é i c o e e s t e á r i c o a p resentaram-se e m c o n c e n t r a ç õ e s i n f e r i o r e s a 2 %. O s á c i d o s grax o s i n s a t u r a d o s c o r r e s p o n d e r a m a 47,1% dos ácidos grax o s t o t a i s do óleo de fígado d e t u b a r ã o, e n q u a n t o o s s a t u r a d o s c o r r e s p o n d e r a m a 5 2, 9 % ( F i gura 5).
2 4 Porcentagem (%) 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 EPA DHA F i g u r a 4. P e r f i l d e á c i d o s g r a x o s c o n t i d o s n o ó l e o d e p e i x e. O c o n t e ú d o d e á c i d o s g r a x o s f o i d e t e r m i n a d o p o r H P L C e o s r e s u l t a d o s f o r a m e x p r e s s o s c o m o % e m r e l a ç ã o a o s l i p í d e o s t o t a i s. E P A á c i d o e i c o s a p e n t a e n ó i c o, D H A á c i d o d o c o s a h e x a e n ó i c o. Porcentagem (%) 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 EPA DHA F i g u r a 5. P e r f i l d e á c i d o s g r a x o s c o n t i d o s n o ó l e o d e f í g a d o d e t u b a r ã o. O c o n t e ú d o d e á c i d o s g r a x o s f o i d e t e r m i n a d o p o r H P L C e o s r e s u l t a d o s f o r a m e x p r e s s o s c o m o % e m r e l a ç ã o a o s l i p í d e o s t o t a i s. E P A á c i d o e i c o s a p e n t a e n ó i c o, D H A á c i d o d o c o s a h e x a e n ó i c o.
4. 3. D e t e r mi n a ç ã o d o p e r f i l d e á c i d o s g r a x o s p r e s e n t e s n a r a ç ã o 2 5 A f r a ç ã o l i p í d i c a d a r a ç ã o f o i c o n s t i t u í d a p o r 3 7, 0 % d e á c i d o p a l m í t i c o, 3 4, 9 % d e á c i d o l i n o l é i c o e 2 2, 8 % d e á c i d o o l é i c o. O s á c i d o s grax o s i n s a t u r a d o s s o m a r a m 6 0, 1 %, e n q u a n t o q u e o s s a t u r a d o s s o m a r a m 3 9, 9 %. E P A e D H A n ã o f o r a m d e t e c t a d o s T a b e l a 1. P e r f i l d e á c i d o s g r a x o s c o n t i d o s n a r a ç ã o u t i l i z a d a n a a l i m e n t a ç ã o d o s a n i m a i s. O p e r f i l d e á c i d o s g r a x o s f o i d e t e r m i n a d o p o r H P L C e o s r e s u l t a d o s f o r a m e x p r e s s o s c o m o % e m r e l a ç ã o a o s l i p í d e o s t o t a i s. Á c i d o g r a x o P o r c e n t a g e m ( % ) L i n o l ê n i c o 2, 3 M i r í s t i c o 0, 2 P a l m i t o l é i c o 0, 2 L i n o l é i c o 3 4, 9 P a l m í t i c o 3 7, 0 O l é i c o 2 2, 8 E s t e á r i c o 2, 7 4. 4. D e t e r mi n a ç ã o d o p e r f i l d e á c i d o s g r a x o s p r e s e n t e s n o t u mo r O s p r i n c i p a i s á c i d o s grax o s e n c o n t r a d o s n o t u m o r d o grupo c o n t r o l e ( W ) f o r a m o p a l m í t i c o, o l é i c o e l i n o l é i c o, o s q u a i s c o r r e s p o n d e r a m a 2 4, 4 ± 1, 1 %, 2 3, 5 ± 0, 4 % e 2 2, 8 ± 4, 5 %, r e s p e c t i v a m e n t e. T u m o r e s o b t i d o s d e a n i m a i s s u b m e t i d o s à s u p l e m e n t a ç ã o i s o l a d a, e à q u e l e s c o m ó l e o d e p e i x e e ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o a p r e s e n t a r a m o m e s m o p e r f i l d e s t e s á c i d o s grax o s q u a n d o c o m p a r a d o s c o m o grupo controle (Tabela 2).
2 6 E P A e D H A f o r a m e n c o n t r a d o s n o s t u m o r e s d o s d i f e r e n t e s grupos n a m e s m a p o r c e n t a gem. O s grupos s u p l e m e n t a d o s n ã o a p r e s e n t a r a m d i f e r e n ç a s i gnificativa n o c o n t e ú d o d e E P A e D H A e m r e l a ç ã o a o grupo c o n t r o l e. O s grupos s u b m e t i d o s à s u p l e m e n t a ç ã o c o m ó l e o d e p e i x e ( W O ) e ó l e o d e p e i x e + ó l e o d e f í gado d e t u b a r ã o ( W A O ) a p r e s e n t a r a m u m a u m e n t o s i gnificativo d e á c i d o l i n o l ê n i c o, e m r e l a ç ã o a o grupo W e W A, e u m a r e d u ç ã o n a q u a n t i d a d e d e á c i d o a r a q u i d ô n i c o, e m r e l a ç ã o a o grupo c o n t r o l e ( W ). O s á c i d o s l á u r i c o, m i r í s t i c o, p a l m i t o l é i c o, l i n o l é i c o, p a l m í t i c o e o l éico n ã o a p r e s e n t a r a m d i f e r e n ç a s i gnificativa entre os grupos.
2 7 T a b e l a 2. P e r f i l d e á c i d o s g r a x o s n o t u m o r, m e n s u r a d o p o r H P L C. O s r e s u l t a d o s f o r a m e x p r e s s o s c o m o m é d i a p e r c e n t u a l ± e r r o p a d r ã o d a m é d i a. R e s u l t a d o s o b t i d o s d e 3 e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d e n t e s. W c o n t r o l e, W A s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e f í g a d o d e t u b a r ã o, W A O s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e f í g a d o d e t u b a r ã o e ó l e o d e p e i x e, W O s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e p e i x e. A c. Graxos W W A W A O W O L á u r i c o 0, 5 ± 0, 3 0, 2 ± 0 0, 4 ± 0, 1 0, 5 ± 0, 2 E P A 0, 5 ± 0, 2 0, 7 ± 0, 3 0, 7 ± 0, 2 0, 6 ± 0, 1 L i n o l ê n i c o 0, 2 ± 0, 1 0, 2 ± 0, 2 0, 8 ± 0, 2 a b 0, 7 ± 0, 2 a b D H A 1, 2 ± 0, 1 2, 9 ± 0, 2 3, 0 ± 0, 7 3, 1 ± 1 M i r í s t i c o 3, 4 ± 1, 1 2, 4 ± 1, 1 2, 4 ± 0, 8 1, 8 ± 0, 6 A r a q u i d ô n i c o 1 4, 5 ± 1, 9 1 0, 9 ± 2, 2 7, 1 ± 2, 1 c 5, 7 ± 2, 7 c P a l m i t o l é i c o 1, 2 ± 0, 3 0, 7 ± 0, 3 1, 6 ± 0, 3 1, 0 ± 0, 4 L i n o l é i c o 2 2, 8 ± 4, 5 2 3, 1 ± 1, 2 2 5, 5 ± 4 2 2, 6 ± 2, 8 P a l m í t i c o 2 4, 4 ± 1, 1 2 4, 6 ± 2, 2 2 4, 7 ± 1, 4 2 2, 2 ± 1, 4 O l é i c o 2 3, 5 ± 0, 4 2 2, 6 ± 0, 8 2 5, 5 ± 1, 2 2 2, 3 ± 1, 6 E s t e á r i c o 1 5, 1 ± 1, 5 1 5, 0 ± 1, 5 1 0, 1 ± 1, 3 7, 5 ± 1 d e a b c d e p < 0, 0 1 e m r e l a ç ã o a W p < 0, 0 0 1 e m r e l a ç ã o a W A p < 0, 0 5 e m r e l a ç ã o a W p < 0, 0 1 e m r e l a ç ã o a W p < 0, 0 5 e m r e l a ç ã o a W A
4. 5. Peroxidação lipídica no tecido tumo r a l 2 8 N a f i gura 6 e s t ã o a p r e s e n t a d o s o s d a d o s d e l i p o p e r o x i d a ç ã o n o t e c i d o t u m o r a l o b t i d o d o s d i f e r e n t e s grupos. A s u p l e m e n t a ç ã o c o m ó l e o d e f í gado de tubarão (WA) incrementou a lipoperoxidação em 1, 6 v e z e s, e f o i s i gnificativamente m a i o r e m r e l a ç ão a o c o n t r o l e ( W ) ( p < 0, 0 5 ). A s u p l e m e n t a ç ã o c o m ó l e o d e p e i x e ( W O ) e l e v o u a p e r o x i d a ç ã o e m 3, 3 v e z e s q u a n d o c o m p a r a d o a o c o n t r o l e ( W ) ( p < 0, 0 0 1 ) e e m 2 v e z e s e m r e l a ç ã o a o W A ( p < 0, 0 1 ). A a s s o c i a ç ã o d e a m b a s a s s u p l e m e n t a ç õ e s ( W A O ) n ã o p r o m o v e u e f e i t o d i f e r e n t e d a q u e l e j á o b s e r v a d o p e l a s u p l e m e n t a ç ã o c o m ó l e o d e p e i x e ( p > 0, 0 5 W A O v s. W O ). nmol hidroperóxido/ mg de proteína 150 100 50 # ab a 0 W WA WO WAO F i g u r a 6. C o n c e n t r a ç ã o d e h i d r o p e r ó x i d o s l i p í d i c o s e m t e c i d o t u m o r a l. W, s e m s u p l e m e n t a ç ã o ; W A, s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e f í g a d o d e t u b a r ã o ; W O, s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e p e i x e ; W A O, s u p l e m e n t a d o c o m ó l e o d e f í g a d o d e t u b a r ã o e ó l e o d e p e i x e. O s r e s u l t a d o s f o r a m e x p r e s s o s c o m o m é d i a p e r c e n t u a l ± e r r o p a d r ã o d a m é d i a. R e s u l t a d o s o b t i d o s d e 3 e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d e n t e s. a b p < 0, 0 0 1 e m r e l a ç ã o a W A N O V A c o m p ó s -t e s t e d e T u k e y p < 0, 0 1 e m r e l a ç ã o a W A A N O V A c o m p ó s -t e s t e d e T u k e y # p < 0, 0 5 e m r e l a ç ã o a W t e s t e t