Bicarbonato, albumina sérica bovina e heparina afetam a integridade do acrossomo do espermatozoide bovino pós-descongelação?

Bicarbonato, albumina sérica bovina e heparina afetam a integridade do acrossomo do espermatozoide bovino pós-descongelação? Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari Beatriz Ramos Bertozzo Monica Yurie Machado Shiroma Paulo Roberto Rojas Scaldelai Eliane Vianna da Costa e Silva RESUMO O trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do bicarbonato, albumina sérica bovina e heparina sobre a integridade do acrossomo do espermatozoide bovino criopreservado, durante incubação in vitro. Doses comerciais de sêmen de dez touros foram submetidas às análises de motilidade, vigor, integridade da membrana plasmática (eosina/nigrosina-en) e status acrossomal (trypan blue/giemsa-tbg), nos momentos pós-descongelação, pós-wash e pós-incubação por 5 horas a 37ºC. Após a descongelação e lavagem por centrifugação em solução salina 0,9% (wash), as doses foram fracionadas e submetidas aos seguintes tratamentos: (controle); sem bicarbonato; sem albumina sérica bovina e; acrescido de heparina. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Duncan. Todas as características espermáticas sofreram efeito do tempo de incubação, diferindo significativamente dos valores obtidos pós-descongelação. Houve efeito significativo de tratamento para reação acrossomal verdadeira, com os maiores percentuais nos tratamentos controle (2,72±0,40) e com heparina (2,31±0,44), sendo que este último não diferiu dos demais. Houve interação significativa entre os momentos de avaliação e os tratamentos para a variável reação do acrossomo verdadeira, com os maiores valores nos tratamentos controle e com heparina (4,65±0,79 e 4,30±0,94%, respectivamente), não havendo diferença entre si. De acordo com os resultados obtidos conclui-se que a presença do bicarbonato ou da albumina sérica bovina no meio de cultivo, leva ao aumento de espermatozoides apresentando reação do acrossomo verdadeira. Palavras-chave: Capacitação. Criopreservação. Sêmen. Touro. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari Universidade Federal de Mato Grosso do Sul; Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal; Departamento de Zootecnia; Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia; Campo Grande/MS Brasil; Professora Associada II; E-mail: zuccari@nin.ufms.br Beatriz Ramos Bertozzo, Monica Yurie Machado Shiroma e Paulo Roberto Rojas Scaldelai são Bolsistas de Iniciação Científica (PIBIC CNPq) Curso de Medicina Veterinária; Faculdade Medicina Veterinária e Zootecnia; Universidade Federal de Mato Grosso do Sul; Campo Grande/MS Brasil. Eliane Vianna da Costa e Silva Universidade Federal de Mato Grosso do Sul; Departamento de Medicina Veterinária; Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia; Campo Grande/MS Brasil. Professora Adjunta IV. Endereço para correspondência: Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari. Rua Mário de Andrade, 251 Casa 33. Campo Grande/MS. CEP 79032-260. Fone: (67) 3345.3634. 70 Veterinária em Foco Veterinária Canoasem Foco, v.8 v.8, n.1, jul./dez. p.70-79 2010 jul./dez. 2010

Bicarbonate, bovine serum albumin and heparin affect acrosomal integrity of bovine post-thawing? ABSTRACT The aim of this work was to evaluate de effect of bicarbonate, bovine serum albumin and heparin on sperm acrosome integrity of bovine cryopreserved semen, during in vitro incubation. Commercial doses from ten bulls were submitted to analysis of motility, vigour, plasmatic membrane integrity (eosin/nigrosin EN) and acrosomal status (trypan blue/giemsa), after thawing, wash and 5 hours incubation at 37ºC. After thawing and washing by centrifugation with saline solution at 0.9%, doses were fractionated and submitted to following treatments: (control); bicarbonate free; bovine serum albumin free and; plus heparin. Data were submitted to ANOVA and means were compared by Duncan s test. All sperm characteristics changed along incubation time with values differing significantly from those observed after thawing. Treatment had significant effect on the percentage of true acrosome reaction with the highest values being observed in control (2.72±0.40) and heparin (2.31±0.44) groups, this last being equal to the others. There was significant interaction between moments and treatments for true acrosome reaction variable with the highest values being observed in control and heparin groups (4.65±0.79 and 4.30±0.94%, respectively), although none difference had been found between these values. These results indicate that the presence of bicarbonate or bovine serum albumin in culture medium enhance the number of spermatozoa showing true acrosome reaction. Keywords: Bull. Capacitation. Cryopreservation. Semen. INTRODUÇÃO O processo de criopreservação causa injúrias à célula (WATSON, 2000; HAMMERSTEDT et al., 1990). Contudo, é necessária a preservação de uma população de espermatozoides com potencial fecundante, apta a passar por processos fisiológicos que incluem a capacitação espermática (CAP) e a reação do acrossomo (RA), para o sucesso da fecundação (YANAGIMACHI, 1994; AMMAN; HAMMERSTEDT, 1993). A capacitação espermática está relacionada a mudanças fisiológicas e bioquímicas da membrana plasmática, que permitem interações entre espermatozoides e ovócitos. Dentre outras, ocorrem modificações na fluidez da membrana, no fluxo de íons e efluxo de colesterol (ROLDAN; GOMENDIO, 1992; GORDON, 1994; PÉREZ et al., 1996; HARRISON; GADELLA, 2005). Oviduto e útero representam sítios fisiológicos da capacitação in vivo. No entanto, esta pode ocorrer in vitro, sob condições que mimetizam a composição eletrolítica do fluido do oviduto. Em geral, os meios contêm substratos energéticos como piruvato, lactato e glicose, uma fonte proteica como a albumina sérica bovina (ASB), íons bicarbonato e cálcio. Todavia, o exato mecanismo de ação desses compostos para promover a capacitação, em nível molecular, é pouco conhecido (VISCONTI et al., 1998). 71

O principal componente desencadeador da capacitação é o bicarbonato (HARRISON et al., 1996, FLESCH; GADELLA, 2000). Ele ativa diretamente uma adenilato ciclase espermatozoide específica que se liga a proteína kinase A (PKA), a qual, via fosforilação da tirosina da proteína, ativa direta ou indiretamente o deslocamento de fosfolipídeos, levando a uma alteração da assimetria da membrana, que resulta em células capacitadas. A ASB, além da função nutricional, é responsável pela retirada do colesterol da membrana plasmática do espermatozoide, causando alterações na sua fluidez e diminuição da relação colesterol:fosfolipídio (CROSS, 1998). A heparina remove as proteínas do plasma seminal adsorvidas à membrana espermática, portanto inibidoras da capacitação (CORMIER; BAILEY, 2003). A ligação da heparina ao espermatozoide bovino induz mudanças no ambiente intracelular, estimulando a elevação da concentração de cálcio, da adenosina monofostato cíclica (AMPc), da fosforilação da tirosina proteica e do ph (CORMIER; BAILEY, 2003; LANE et al., 1999; LECLERC et al., 1990). O trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do bicarbonato, albumina sérica bovina e heparina, sobre a integridade do acrossomo do espermatozoide bovino criopreservado, durante incubação in vitro. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Doses comerciais de sêmen de dez touros, pós-descongelação a 37ºC/30 segundos, foram acondicionadas em tubo cônico e submetidas à lavagem em solução salina a 0,9% (wash), por centrifugação a 700 G, durante 5 minutos. Ressuspendido o pellet, este foi fracionado e feita a diluição em volume final de 500 μl, de acordo com os seguintes tratamentos: 1) meio (PARRISH et al., 1988), contendo 5 mg/ml de ASB fração V livre de ácidos graxos e 25 mm de NaHCO 3 ; 2) sem adição de bicarbonato, sendo o ph corrigido com NaOH (1 N) ; 3) sem adição de albumina sérica bovina e; 4) acrescido de heparina, na concentração final de 10 μg/ml. Após a diluição as amostras foram incubadas a 37ºC por 5 horas. Alíquotas de sêmen foram submetidas às análises de motilidade/vigor, integridade da membrana plasmática (eosina/nigrosina-en) e status acrossomal (trypan blue/giemsa- TBG) nos momentos: pós-descongelação (PD), pós-wash (PW) e pós-incubação (PI). A motilidade espermática foi estimada pela deposição de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula, aquecidas a 37ºC, sob microscopia de contraste de fase, com objetiva de 40x. O resultado foi expresso em percentagem conforme a proporção total de espermatozoides móveis. O vigor foi expresso segundo escala padronizada de zero a cinco (0-5). 72

A avaliação da viabilidade espermática foi feita em esfregaço de sêmen corado pela eosina/nigrosina (1:1), conforme proposto por Hancock e modificado por Barth e Oko (1989). A eosina penetra através da membrana plasmática lesada, corando as células mortas em rosa e a nigrosina dando o contraste de fundo, permite detectar espermatozoides vivos não corados. Foram contadas, sob imersão ao microscópio ótico de campo claro (Zeiss), 200 células por lâmina. A integridade do acrossomo foi avaliada empregando-se a técnica de dupla coloração (trypan blue/giemsa TBG) descrita por Didion et al. (1989). A solução corante de Giemsa foi preparada em cubeta plástica com 27 ml de água deionizada acrescida de 3 ml da solução estoque de Giemsa (Merck). Foram armazenados 50 μl de trypan blue 0,4% (Sigma Aldrich do Brasil) com 50 μl de sêmen em tubo cônico e, incubados em banho-maria (MD 100 Fanem) a 37 C por 15 minutos. Após, foram adicionados 2 ml de solução salina, e as amostras submetidas à centrifugação (Excelsa Baby I Fanem) por 5 minutos. O pellet foi ressuspendido, o esfregaço confeccionado e a lâmina seca a temperatura ambiente. Após fixar em metanol por 5 minutos e estarem secas, as lâminas foram imersas em solução de Giemsa overnight. As lâminas foram lavadas com água deionizada, secas e avaliadas ao microscópio de campo claro (Zeiss) sob imersão. Os espermatozoides foram classificados como: vivos (TBG-V) acrossomo corado em roxo ou rosa pelo Giemsa e região pós acrossomal não corada; mortos (TBG-M) corados em azul pelo trypan blue na região pós-acrossomal e acrossomo corado em roxo ou rosa pelo Giemsa; reação do acrossomo verdadeira (TBG-RAV) acrossomo e região pós-acrossomal não coradas e; reação do acrossomo falsa (TBG-RAF) acrossomo não corado e região pós-acrossomal corada em azul. O delineamento experimental foi em parcelas subdivididas considerando o efeito fixo de tratamento e momentos de avaliação como subparcelas. Adotou-se a análise de variância, pelo procedimento GLM do Programa Estatístico SAS (1999), para o estudo dos efeitos fixos sobre as variáveis dependentes (motilidade, vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomal). As médias foram comparadas pelo teste de Duncan, em nível de 5% de significância (SAMPAIO, 1998). Quando houve interação significativa entre efeitos fixos, as médias foram ajustadas e comparadas pelo teste t de Student (p<0,05). Para o estudo da associação entre as variáveis foi usado o teste de correlação de Pearson. RESULTADOS E DISCUSSÃO Todas as características espermáticas analisadas sofreram efeito do tempo de incubação, diferindo significativamente dos valores obtidos pós-descongelação. Os valores de motilidade, vigor e integridade das membranas plasmática e acrossomal, em relação aos momentos de avaliação, estão apresentados na Tabela 1. 73

TABELA 1 Valores de motilidade, vigor e integridade das membranas plasmática e acrossomal, durante incubação in vitro a 37ºC/5 horas, do sêmen congelado de touros (n=10). Variáveis (%) * Momentos ** Pós-descongelação Pós-wash Pós-incubação Motilidade 61,25 ± 1,30 a 37,5 ± 2,37 b 27,5 ± 2,40 c Vigor (0-5) 3,13 ± 0,05 b 3,15 ± 0,10 b 3,60 ± 0,15 a EN-Vivo 48,81 ± 3,00 a 42,23 ± 2,40 a 33,60 ± 2,21 b EN-Morto 49,83 ± 3,00 c 57,60 ± 2,37 b 66,50 ± 2,21 a TBG-Vivo 41,70 ± 2,57 a 35,90 ± 2,14 a 23,60 ± 2,00 b TBG-Morto 35,24 ± 2,10 b 47,30 ± 1,72 a 43,60 ± 1,84 a TBG-RAV 1,78 ± 0,24 b 1,35 ± 0,18 b 3,13 ± 0,40 a TBG-RAF 22,36 ± 1,35 b 15,63 ± 1,24 c 28,38 ± 2,10 a * EN = eosina/nigrosina; TBG = trypan blue/giemsa; RAV = reação acrossomo verdadeira; RAF = reação acrossomo falsa. ** letras diferentes na mesma linha indicam diferença significativa entre médias pelo teste de Duncan (p<0,05). Embora tenha ocorrido uma redução significativa da motilidade pós-wash, esta não foi acompanhada pela perda da integridade da membrana plasmática, pois o percentual de células vivas não diferiu entre os momentos pós-descongelação e pós-wash, para as duas técnicas de coloração utilizadas. Houve alta correlação (r = 0,76; p<0,0001) para a categoria de células vivas entre as técnicas da eosina/nigrosina e trypan blue/ Giemsa. Os coeficientes de correlação entre motilidade e espermatozoides vivos, para eosina/nigrosina e trypan blue/giemsa, foram 0,59 (p<0,0001) e 0,64 (p<0,001), respectivamente. Garner et al. (1986) e Ericsson et al. (1993) encontraram coeficientes similares para sêmen bovino (0,55; p<0,05 e 0,78; p=0,02, respectivamente). A motilidade diferiu significativamente entre os momentos, com o menor percentual sendo observado pós-incubação e o coeficiente de correlação entre momento x motilidade foi de 0,72 (p<0,0001). De fato, a capacidade de biossíntese do espermatozoide é muito limitada, pois a maioria dos compostos necessários para sua função é sintetizada durante a espermatogênese, o que caracteriza o espermatozoide como uma célula de metabolismo catabólico (AMANN; GRAHAM, 1993). Além disso, a motilidade é o processo com maior demanda energética e apresenta correlação positiva com as concentrações de ATP, as quais diminuem ao longo do tempo, após a descongelação (JANUSKAUSKAS; RODRIGUEZ-MARTINEZ, 1995). Yamashiro et al. (2006) compararam as características espermáticas do sêmen ovino coletado em tubos contendo diluente suplementado ou não com 5% de ASB e verificaram aumento significativo da motilidade das células que entraram em contato com a albumina. O mesmo não ocorreu no presente estudo, pois não houve diferença entre os tratamentos para essa variável. 74

O vigor foi significativamente superior ao término da incubação, indicando de forma indireta uma provável ocorrência de motilidade hiperativada nos espermatozoides capacitados (HAN-CHEN; SUAREZ, 2001; YANAGIMACHI, 1994), considerando que o maior percentual de células que sofreram reação do acrossomo verdadeira também foi obtido pós-incubação (p<0,05). A capacitação espermática também foi estimada pela ocorrência da reação do acrossomo. Houve efeito significativo de tratamento para o número de células com reação acrossomal verdadeira, com os maiores valores nos tratamentos controle e com heparina, sendo que este último não diferiu dos demais (Tabela 2). TABELA 2 Valores médios (± desvio padrão) de reação do acrossomo verdadeira e falsa, no sêmen congelado de touros (n=10), de acordo com a técnica do trypan blue/giemsa, considerando os diferentes tratamentos. Tratamentos * Variável (%) (controle) sem *** NaHCO 3 sem ASB *** com heparina TBG-RAV ** 2,72 ± 0,40 a 1,62 ± 0,23 b 1,71 ± 0,33 b 2,31 ± 0,44 ab * letras diferentes na mesma linha indicam diferença significativa entre médias pelo teste de Duncan (p<0,05). ** TBG = trypan blue/giemsa; RAV = reação acrossomo verdadeira. *** NaHCO 3 = bicarbonato de sódio; ASB = albumina sérica bovina. Parrish et al. (1989) relatam que substratos glicolíticos como a frutose, glicose ou manose podem inibir a capacitação, por promoverem acidificação intracelular durante a glicólise, em oposição à necessária alcalinização induzida pela heparina. A glicose inibe a fosforilação da tirosina proteica, durante a capacitação espermática induzida pela heparina, sendo inclusive adicionada nos diluidores de sêmen com o objetivo de inibir a criocapacitação (CORMIER; BAILEY, 2003). No entanto, a composição dos meios usados no presente experimento diferiu apenas quanto à presença ou não de heparina, ou seja, possuíam lactato e piruvato como substratos energéticos, descartando-se assim um possível fator que pudesse ter levado a baixa resposta à heparina. Além disso, de acordo com Parrish et al. (1988), para que a heparina capacite o espermatozoide bovino, é necessário que esta se ligue ao gameta, sendo esse processo dependente da dose e do tempo utilizados. Apesar da concentração usada (10 μg/ml) encontrar-se dentro dos valores relatados pela literatura (CHAMBERLAND et al., 2001; PARRISH et al., 1994; UGUZ et al.,1994) e o tempo de incubação adotado (5 horas) ter sido superior ao mínimo recomendado, de 4 horas (PARRISH et al., 1994; PARRISH et al., 1989; PARRISH et al., 1988), os resultados sugerem que a heparina não foi eficaz na indução da capacitação. Contudo, é provável que essa baixa ocorrência de RAV se deva a não utilização de um agente indutor da reação do acrossomo como a lisofosfatidilcolina, normalmente empregada para se avaliar o status da capacitação (PARRISH et al., 1988; UGUZ et al., 1994; CORMIER; BAILEY, 2003). 75

Os menores valores de TBG-RAV foram observados nos meios com ausência da ASB ou do NaHCO 3. Além disso, houve interação significativa entre momentos de avaliação e tratamentos para a variável TBG-RAV, sendo maior o número de reações verdadeiras no controle, ou seja, com a presença de ASB e bicarbonato e no tratamento em que houve a adição de heparina (Tabela 3), não havendo diferença entre si. TABELA 3 Médias ajustadas da variável reação do acrossomo verdadeira (%), no sêmen congelado de touros (n=10), de acordo com a técnica do trypan blue/giemsa, considerando a interação entre os momentos de avaliação e os diferentes tratamentos. Tratamentos * Momentos (controle) sem NaHCO 3 ** sem ASB ** com heparina Pós-descongelação 2,25 ± 0,46 b 2,10 ± 0,39 b 1,06 ± 0,63 b 1,61 ± 0,39 b Pós-wash 1,25 ± 0,20 b 1,10 ± 0,28 b 2,10 ± 0,59 b 0,95 ± 0,19 b Pós-incubação 4,65 ± 0,79 a 1,65 ± 0,46 b 1,90 ± 0,48 b 4,30 ± 0,94 a * Letras diferentes na mesma linha indicam diferença significativa entre médias pelo teste t de Student (p<0,05). ** NaHCO 3 = bicarbonato de sódio; ASB = albumina sérica bovina. Davis et al. (1980) verificaram que após a incubação de espermatozoide epididimário de rato, por 5 horas, em meio Krebs-Ringer bicarbonato, acrescido de 4% de ASB, houve aumento do conteúdo de fosfolipídios na membrana plasmática e redução da proporção colesterol:fosfolipídio. Em solução aquosa a ASB se adere à membrana plasmática e ao haver a interação dos fosfolipídios com a proteína, ela se torna mais permeável. Go e Wolf (1985) relataram a existência de um fluxo bidirecional de colesterol e fosfolipídios entre as células e a proteína do meio de cultivo, resultando em decréscimo de colesterol e aumento dos fosfolipídios. Com essa redução da concentração de colesterol é acelerado o processo de fusão espontânea das membranas plasmática e acrossomal externa. De fato, resultados de pesquisa demonstraram que a albumina, como aceptora de esteroide, promove o efluxo de colesterol que, por sua vez, aumenta a permeabilidade aos íons cálcio e bicarbonato levando à ativação da adenilato ciclase, com consequente aumento da concentração do AMPc, o qual se liga a uma proteína kinase A e, via fosforilação da tirosina proteica, leva uma série de reações que, por fim, tornam a célula capacitada e apta a sofrer a reação do acrossomo (YAMASHIRO et al., 2006; GADELLA et al., 2001; FLESCH; GADELLA, 2000; VISCONTI et al., 1998). A capacitação in vitro pode ser induzida através da incubação do espermatozoide em meio específico definido, sendo que um dos componentes responsáveis por induzila é o bicarbonato (HARRISON et al., 1996; FLESCH; GADELLA, 2000) e somente espermatozoides funcionalmente maturados no epidídimo são sensíveis a ele (GADELLA; VAN GESTEL, 2004). Colenbrander (2002), em estudo in vitro com espermatozoide 76

equino, verificou o efeito do bicarbonato no processo de capacitação, levando a alteração no conteúdo e na distribuição dos lipídeos de membrana. Avaliando o efeito da heparina sobre a capacitação in vitro de sêmen suíno, Dapino et al. (2006) consideraram como meio não capacitante o preparado sem a adição de CaCl 2, bicarbonato e albumina sérica bovina; e capacitante, aquele acrescido de 15 mm de bicarbonato. Após a capacitação com heparina, a reação do acrossomo foi induzida com ionóforo de cálcio (A23187) e, pela técnica da clortetraciclina (CTC), verificaram que o percentual de células apresentando padrão B (capacitadas), não diferiu quando nos meios de incubação estavam ausentes o Ca +2 ou o HCO 3-, apesar da presença da heparina. CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos conclui-se que a presença da albumina sérica bovina ou do bicarbonato, no meio de cultivo, leva a um aumento da ocorrência de espermatozoides apresentando reação do acrossomo verdadeira. Portanto, um aspecto importante a ser considerado quando da manipulação laboratorial das amostras de sêmen durante a execução de testes que avaliam a qualidade seminal. REFERÊNCIAS AMANN, R. P.; GRAHAM, J. K. Spermatozoal function. In: McKINNON, A. O.; VOSS, J. L. Equine Reproduction. Pennsylvania: Lea e Febiger, cap. 80, p.715-45, 1993. AMANN, R. P.; HAMMERSTEDT, R. H. In vitro evaluation of sperm quality: an opinion. Journal of Andrology, v.14, p.397-406, 1993. BARTH, A. D.; OKO, R. J. Preparation of semen for morphological evaluation. In: Iowa State University Press. Abnormal Morphology of Bovine Spermatozoa. 1 ed. Iowa: Ames, 1989, p.8-18. CHAMBERLAND, A. et al. The effect of heparin on motility parameters and protein phosphorylation during bovine sperm capacitation. Theriogenology, v.55, p.823-835, 2001. COLENBRANDER, B. Capacitation dependent lipid rearrangements in the plasma membrane of equine sperm. Theriogenology, v.58, p.341-345, 2002. CORMIER, N.; BAILEY, J.A differential mechanism is involved during heparin and cryopreservation-induced capacitation of bovine spermatozoa. Biology of Reproduction, v.69, p.177-185, 2003. CROSS, N. L. Role of cholesterol in sperm capacitation. Biology of Reproduction, v.59, p.7-11, 1998. DAPINO, D. G.; MARINI, P.; CABADA, M. O. Effect of heparin on in vitro capacitation of boar sperm. Biology Research, v.39, p.631-639, 2006. DAVIS, B. K.; BYRNE, R.; BEDIGIAN, K. Studies on the mechanism of capacitation: Albumin-mediated changes in plasma membrane lipids during in vitro incubation of rat sperm cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.77, p.1546-1550, 1980. 77

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