Prevenção do câncer de colo uterino: testes biomoleculares para HPV Cervical cancer prevention: HPV DNA testing At u a l i z a ç ã o Abstract Resumo O câncer de colo uterino é a terceira neoplasia maligna mais comum em mulheres no Brasil. Geralmente, o rastreamento tem sido feito pela citologia cérvico-vaginal, e as pacientes com alterações citológicas são encaminhadas para a colposcopia. A infecção do colo uterino por HPV (papilomavírus humano) de alto risco está associada ao desenvolvimento do câncer de colo uterino e lesões precursoras. Apesar do impacto da citologia oncótica cérvico-vaginal na redução da incidência desse câncer no mundo, esse método possui muitas limitações. Recentemente, o desenvolvimento de testes biomoleculares para a detecção de infecção por HPV do colo uterino tem sido uma alternativa ou um método adjunto à citologia para a detecção de NIC (neoplasia intra-epitelial cervical). Muitos estudos mostram a utilidade clínica dos testes biomoleculares para HPV: no rastreamento primário, como adjunto da citologia de ASCUS (células escamosas atípicas de significado indeterminado) ou LIBG (lesão intra-epitelial de baixo grau) e no seguimento pós-tratamento. Cervical cancer is the third malignant neoplasm more common in Brazilian women. Usually, women have been screened with cervical cytology, and women with abnormal cytology are referred for colposcopy. Infection of the cervix with high-risk HPV (human papillomavirus) is associated with the development of cervical cancer and its precursors. Despite the impact of cervical smear on reducing the incidence of cervical cancer in the world, cervical cytology has many limitations. Nowadays, the development of tests for the detection of HPV infection of the cervix has been an alternative or adjunctive test to cytology for the detection of CIN (cervical intraepithelial neoplasia). There are many studies supporting the clinical utility of DNA-HPV testing for the prevention of cervical cancer: in the primary screening, in the triage of human with cervical cytology ASCUS (atypical squamous cells of undetermined significance) or LSIL (low-grade squamous intraepithelial lesion), and in the post-treatment follow-up. Rosekeila Simões Nomelini 1 Ana Cristina Macêdo Barcelos 1 Márcia Antoniazi Michelin 2 Sheila Jorge Adad 3 Eddie Fernando Candido Murta 1 Palavras-chave Teste biomolecular para HPV Câncer de colo uterino Neoplasia intra-epitelial cervical Keywords DNA-HPV testing Cervical cancer Cervical intraepithelial neoplasia 1 Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia 2 Disciplina de Imunologia 3 Disciplina de Patologia Especial, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba (MG), Brasil FEMINA Maio 2007 vol 35 nº 5 295
O papilomavírus humano, o câncer de colo uterino e suas lesões precursoras Há mais de quatro décadas, a associação entre o câncer de colo uterino e lesões precursoras a agentes infecciosos sexualmente transmissíveis tem sido estudada. Em novembro de 1991, a IARC (International Agency for Research on Cancer) e a OMS (Organização Mundial da Saúde) concluíram oficialmente, baseados em dados laboratoriais e epidemiológicos, que há associação entre o HPV (papilomavírus humano) e o câncer cervical, e que a infecção por esse vírus deveria ser considerada fator causal para o desenvolvimento desse câncer (Bosch et al., 1992). O câncer de colo uterino é a terceira neoplasia maligna mais comum entre as mulheres no Brasil, sendo superado apenas pelo câncer de pele (não melanoma) e pelo câncer de mama, sendo a quarta causa de morte por câncer entre as mulheres. De acordo com o INCA, ao final de 2005, terão sido diagnosticados 20.690 casos novos de câncer de colo uterino no Brasil. Esta infecção ocorre com maior freqüência em mulheres jovens, com início precoce da atividade sexual, em tabagistas, em mulheres com múltiplos parceiros sexuais e imunossuprimidas (Bosch et al., 1992; Murta et al., 1998). A freqüência da infecção por HPV declina com o aumento da idade em mulheres com citologia oncótica normal. Pacientes que apresentam apenas alterações citológicas por HPV mostram um percentual de regressão de aproximadamente de 85% (Murta et al., 1997; Murta et al.,1999). A infecção persistente do trato genital feminino por tipos oncogênicos de HPV é a principal causa de lesão intra-epitelial escamosa e carcinoma invasivo. A infecção transitória por HPV é comum entre adultos jovens (Evander et al., 1995), enquanto após os 30 anos, os tipos de HPV de alto risco tendem a persistir por mais tempo (Hildesheim et al., 1994). O HPV é um vírus de transmissão sexual, existindo cerca de 100 subtipos descritos. O diâmetro do HPV é de aproximadamente 55 nm, sendo membro da família Papillomaviridae. Os tipos de alto risco (16, 18, 39, 45, 50, 53, 55, 58, 59, 64 e 68) são mais freqüentemente detectados em carcinomas e displasias (Clavel et al., 2001). O genoma do HPV está organizado em três regiões: uma não codificante (LCR), os genes precoces (E1 a E7) e os genes tardios (L1 e L2). Durante a integração do DNA (ácido desoxirribonucléico) do HPV, o genoma viral geralmente parte-se na região E1/E2, o que geralmente leva à perda dessas regiões. A perda de E2, que codifica uma proteína que inibe a transcrição das regiões E6 e E7, resulta em expressão descontrolada e aumentada de proteínas oncogênicas E6 e E7. A expressão aumentada dessas proteínas pode levar à transformação maligna das células do hospedeiro e à formação do tumor por desregulação do ciclo celular e ocorrência de mutações celulares (Bosch et al., 1992). A citologia cérvico-vaginal Apesar do impacto da citologia cérvico-vaginal em programas de rastreamento do câncer cervical, esse método possui muitas limitações: altas taxas de falso-negativos, a natureza subjetiva do teste, a necessidade de ser repetida em intervalos freqüentes, a larga variação de sensibilidade e especificidade entre os laboratórios (Denny & Wright, 2005). Algumas causas podem explicar erro no diagnóstico de neoplasia cervical e lesões precursoras à citologia, como a falta de critérios morfológicos seguros para microinvasão, ausência de amostragem da junção escamo-colunar e a escassez de células neoplásicas na amostra (Adad et al., 2000). A probabilidade de uma paciente com citologia anterior sem sinais de infecção por HPV apresentar lesão escamosa intra-epitelial de alto grau é de 0,4%; entretanto, Murta et al., 1997, demonstraram que 5,3% das pacientes com sinais citológicos desta infecção evoluíram para lesão de alto grau. Isto demonstra que pacientes com sinais citológicos de infecção por HPV constituem um grupo de risco para desenvolvimento de NIC III (neoplasia intra-epitelial cervical grau III) e posterior carcinoma invasivo. Murta et al., 1997 também demonstraram que o tempo médio de evolução de lesão escamosa intraepitelial de baixo para alto grau foi em média de quatro anos, em nossa região. Essa evolução relativamente longa pode ser avaliada por exames citológicos seriados. Testes biomoleculares e infecção por papilomavírus humano Dois métodos biomoleculares muito usados na detecção do HPV são a captura híbrida e a PCR (reação em cadeia de polimerase). A captura híbrida é método largamente utilizado pela alta sensibilidade, reprodutibilidade, objetividade, facilidade e acessibilidade para a prática clínica de rotina. Essa técnica é baseada na hibridização de DNA viral de único filamento com dois coquetéis de sondas de RNA que reconhecem 13 tipos de HPV de alto risco e 5 tipos de HPV de baixo risco. RNA/DNA-híbridos são combinados com anticorpos antihíbridos marcados e um substrato quimioluminescente, que 296 FEMINA Maio 2007 vol 35 nº 5
emite luz medida por um luminômetro. Presença ou ausência de DNA de HPV é definida de acordo com a força em unidades relativas de luz (RLU) comparada com 1 pg/ml de controle positivo de DNA de HPV (Lörincz, 1996). A técnica de PCR permite a amplificação de seqüências de ácido nucléico específico. Para amplificar a fita de DNA viral, a seqüência de nucleotídeos deve ser conhecida. Com primers apropriados e condições de temperatura, a síntese de uma fita complementar procede automaticamente por ligação de nucleotídeos livres usando a enzima DNA-polimerase. Após suficiente tempo de elongação para gerar a fita complementar, a mistura pode ser quebrada a altas temperaturas (> 93ºC) para separar a fita sintetizada do molde, então completando o primeiro ciclo. Cada ciclo sucessivo dobrará a quantidade de DNA, produzindo 2 30 vezes DNA após 30 ciclos. Após poucas horas, pequenas quantidades de DNA (nanogramas) podem ser transformadas em grandes quantidades (miligramas), que podem ser facilmente manipuladas (Hubbard, 2003). A maioria dos autores demonstrou alta concordância entre a captura híbrida e a PCR, variando de 76,5 a 90% (Bozzetti et al., 2000; Venturoli et al., 2002; Nonogaki et al., 2004). Por outro lado, Lonky et al., 2003, demonstraram que a captura híbrida foi negativa em 25% dos casos com PCR positivo para HPV de alto risco em pacientes com ASCUS, limitando seu uso. Com as limitações da citologia, tem-se tentado usar os testes biomoleculares alternativas como rastreio primário, no manejo do ASCUS (células escamosas atípicas de significado indeterminado) e LSIL (lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau) à citologia e no seguimento pós-tratamento. Testes para HPV no rastreio primário Grande parte das infecções por HPV é transitória, sendo eliminada pelo sistema imune dentro de poucos meses, sem lesão residual detectável. Em geral, a infecção por HPV em mulheres jovens tende a regredir espontaneamente, enquanto em mulheres mais velhas, o vírus possui maior propensão a persistir (Hildesheim et al., 1994). Assim, a freqüência da infecção diminui com o aumento da idade e, nas pacientes mais jovens, a taxa de eliminação do HPV é alta. Por isso, no rastreio primário, tem sido proscrito o uso de teste para HPV em mulheres com menos de 30 anos. Um estudo multicêntrico, o HART (HPV Testing in Addition to Routine Testing Study), relatou os resultados do reflexo dos testes para HPV em mulheres com idade de 30 a 60 anos (Cuzick et al., 2003). Esse estudo indicou uma alta sensibilidade do teste comparado com a repetição da citologia, para diagnóstico de NIC subjacente. Em uma revisão de 14 estudos publicados comparando a citologia com testes biomoleculares para HPV (captura híbrida e PCR), Franco, 2003, demonstrou que a média de sensibilidade e especificidade da citologia foi de 60 e 95%, respectivamente, e a média de sensibilidade e especificidade dos testes biomoleculares para HPV foi de 85 e 84%, respectivamente. Muitos estudos mostram valor preditivo negativo para a detecção de lesões de alto grau que varia de 97 a 100% (Clavel et al., 2001; Franco, 2003). Rozendal et al., 1996, demonstraram aumento do risco de desenvolvimento de lesões de alto-grau em mulheres com citologia normal e teste para HPV positivo. Portanto, essas mulheres possuem risco maior de desenvolverem lesões precursoras de câncer cervical, devendo ser seguidas cuidadosamente. Teste para HPV em mulheres com citologia de ASCUS ou LSIL A conduta em pacientes com diagnóstico citológico de ASCUS ainda é um desafio na prática clínica. Protocolos indicam que estas pacientes podem ser conduzidas por três caminhos: colposcopia, repetir a citologia dentro de 4 a 6 meses, ou a realização de testes biomoleculares para HPV. Em pacientes com citologia de ASCUS, o manejo é discutido pela ocorrência de NIC no seguimento. Dez a 15% das lesões de alto grau são encontradas nas pacientes com ASCUS, enquanto que HPV de alto risco é encontrado em 40 a 60% dessas pacientes (Solomon et al., 2001). Manos et al., 1999, realizaram a coorte de 46.000 mulheres, 995 com ASCUS à citologia. Todas as pacientes foram submetidas à colposcopia e captura híbrida. Em 7% dos casos foi encontrado NIC II à histologia e 39,5% das pacientes tinham HPV de alto risco. A sensibilidade do teste biomolecular para displasia de alto grau foi de 89%, especificidade de 64%, valor preditivo positivo de 15% e valor preditivo negativo de 98,8%. A porcentagem de pacientes encaminhadas à colposcopia foi de 39%. O estudo ALTS (ASCUS/LSIL Triage Study) é um grande ensaio clínico randomizado designado a avaliar diferentes métodos de manejo de pacientes com citologias de ASCUS ou LSIL, em relação a três estratégias: colposcopia imediata, repetir a citologia ou realização de teste biomolecular para HPV. No ALTS encontrou-se que em 83% das pacientes com LSIL, o DNA de HPV foi detectado e, por causa dessa positividade ser tão comum, sugeriram que o teste seria limitado para o manejo deste grupo, pois a maior parte das pacientes seria encaminhada para a colposcopia. FEMINA Maio 2007 vol 35 nº 5 297
Em contraste, 50,6% de mulheres com ASCUS foram positivas para HPV de alto risco pela captura híbrida e, nestas pacientes, 5,1% das mulheres tinham NIC III subjacente. Testes para HPV tiveram 96,3% de sensibilidade, comparados com a colposcopia para a detecção de lesões histopatológicas de NIC III, e a sensibilidade do teste foi bem mais alta do que a de uma citologia repetida. Além disso, o valor preditivo negativo foi muito alto (99,5%), então, se o teste para HPV é negativo, é improvável a presença de doença cervical (The ALTS Group, 2000; Solomon et al., 2001). Assim, para o ASCUS, utilizando-se a captura híbrida para a detecção do HPV, haveria redução de aproximadamente 50% dos encaminhamentos para a colposcopia. Testes para HPV no pós-tratamento Técnicas ablativas ou excisionais para tratamento de lesões precursoras do câncer cervical apresentam taxas de cura de 90%. A persistência ou recorrência ocorre em 5 a 15%, sendo necessário um seguimento rigoroso (Mitchell et al.,1998). Lörincz, 2003, demonstraram sensibilidade de 96,5%, especificidade de 77,3% e valor preditivo negativo de 98,8% de testes biomoleculares no pós-tratamento. Paraskevaidis et al., 2004, analisaram 11 estudos sobre o uso de testes para HPV após tratamento conservador, 8 deles prospectivos, envolvendo 900 mulheres, das quais 75,3% tratadas com sucesso e 24,7% com insucessos. Testes biomoleculares para HPV na detecção de NICII ou NICIII pós-tratamento tiveram sensibilidade de 100% em 4 estudos e 47,67% em 2. A especificidade variou de 44 a 95%. No pós-tratamento, testes biomoleculares para HPV negativos 2 anos após o tratamento podem excluir lesão recorrente ou residual com alta probabilidade, o que pode ajudar a estabelecer um protocolo de quando retornar a paciente para os programas de rastreio populacional. O teste negativo para HPV no pós-tratamento parece ter um alto valor preditivo (Hernádi et al., 2005). Considerações finais Somando-se à citologia, o teste biomolecular aumentaria a taxa de detecção de NIC de alto grau e preveniria mais câncer do que a citologia isolada. Porém, a infecção por HPV flutua em grande extensão nas pacientes jovens, ocorrendo alta taxa de regressão, a qual é difícil de ser avaliada, pois há a possibilidade de reativação ou reinfecção. Então, seria seguro aumentar o intervalo de rastreamento quando se tem um teste biomolecular negativo para HPV se existe a possibilidade de reinfecção? Para os países em desenvolvimento, é necessária uma avaliação do papel de novas tecnologias para prevenção do câncer cervical que sejam úteis no contexto da saúde. É importante lembrar que um teste positivo para HPV não implica que a mulher tenha NIC ou câncer, mas possui o risco de desenvolver estas lesões. Qualquer combinação de quaisquer testes de rastreio aumenta a sensibilidade, mas diminui a especificidade e aumenta o custo. Apesar de promissores, não há estudos suficientes demonstrando qual a melhor combinação. Leituras suplementares 1. 2. 3. 4. Adad SJ, Sousa MAH, Etchebehere RM et al. Cyto-histological correlation of 219 patients submitted to surgical treatment due to diagnosis of cervical intra-epithelial neoplasia. São Paulo Med J 2000; 117: 81-4. Bosch FX, Munoz N, De Sanjose S et al. Risk factors for cervical cancer in Colombia and Spain. Int J Cancer 1992; 52: 750-8. Bozzetti M, Nonnenmacher B, Mielzinska II. Comparison between hybrid capture II and polymerase chain reaction results among women at low risk for cervical cancer. Ann Epidemiol 2000; 10: 466. Clavel C, Masure M, Bory JP et al. Human papillomavirus testing in primary screening for the detection of high-grade cervical lesions: a study of 7932 women. Br J Cancer 2001; 89: 1616-23. 5. 6. 7. 8. Cuzick J, Szarewski A, Cubie H et al. Management of women who test positive for high-risk types of human papillomavirus: the HART study. Lancet 2003; 362: 1871-6. Denny LA, Wright TC. Human papillomavirus testing and screening. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2005; 20: 1-15. Evander M, Edlund K, Gustafsson A et al. Human papillomavirus infection is transient in young women: a population-based cohort study. J Infect Dis 1995; 171: 1026-30. Franco EL. Primary screening of cervical cancer with human papillomavirus tests. J Natl Cancer Inst 2003; 92: 818-25. 298 FEMINA Maio 2007 vol 35 nº 5
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