Células tronco adultas humanas para ensaios de citotoxicidade: uma alternativa aos ensaios animais Alessandra Melo de Aguiar
Objetivos Desenvolver ensaios alternativos ao uso de animais e que tenham correlação com os efeitos tóxicos em humanos com o uso de células tronco mesenquimais adultas humanas (hctm). Pretende se assim investigar o uso de células tronco em biotecnologia, ao testar sua aplicação em ensaios de citotoxicidade.
Introdução Insumos para saúde Segurança Produtos já estabelecidos Toxicidade Novos produtos Eficácia/potência Complexidade do sistema in vivo: alto custo e questões éticas Sistemas in vitro nem sempre há predição da toxicidade em humanos Células tronco poderiam ser mais sensíveis para predição da toxicidade que os sistemas in vitro atuais resultando na redução do uso de animais???
Introdução Substratos celulares para ensaios de citotoxicidade Tipo Celular Vantagens Desvantagens Linhagens recombinantes e/ou transformadas Linhagens primárias Células tronco adultas Células tronco pluripotentes Baixo custo, disponibilidade, população homogênea, escalonamento Relevância fisiológica, células diferenciadas, próximas das funções nativas disponibilidade, próximas das funções nativas, ensaios reprodutíveis disponibilidade, fonte de células diferenciadas, próximas das funções nativas, modelo de doenças pouca relevância fisiológica Necessita cultura primária, reprodutibilidade questionável, pouca disponibilidade Não são modelos de doenças Manutenção cara, demora para obter células diferenciadas, necessidade de purificação celular FONTE (Adaptado de Hook et al, 2012 e de Ebert et al, 2010).
Introdução O que são células tronco? Slide Bruno Dallagiovanna FONTE: RNTC
Introdução de onde vem as células tronco? Slide Bruno Dallagiovanna FONTE: RNTC
Introdução células tronco mesenquimais Adipogênese (Oil Red O) Osteogênese (Alizarina Red S) Condrogênese (Azul de toluidina) Fonte: Zych, J, 2012
Introdução células tronco induzidas Slide Bruno Dallagiovanna FONTE: RNTC
Introdução Células tronco e Citotoxicidade Efeito tóxico em células humanas multipotentes ou pluripotentes Efeito tóxico na diferenciação celular Efeito tóxico em células diferenciadas
Introdução Células tronco e Citotoxicidade Efeito tóxico em células humanas multipotentes ou pluripotentes Efeito tóxico na diferenciação celular Efeito tóxico em células diferenciadas
Métodos Ensaio de Captação do Vermelho Neutro É um ensaio quantitativo da viabilidade celular. O efeito tóxico da substância teste é correlacionado com o decaimento da captação do vermelho neutro pelas células. Este teste é recomendado pela Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE N o. 129, 2010 para estimativa de determinação das doses iniciais para teste de toxicidade oral aguda).
Métodos Ensaio de Captação do Vermelho Neutro 1º. dia Plaqueamento em placas de 96 poços 2º. dia Diluição das drogas e aplicação sobre a monocamada 4º. dia Captação do vermelho neutro, incubação, eluição e leitura 540nm http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/invitrocyto/invcyt_photo.htm em 07/08/2013
Métodos Linhagens celulares Balb/c 3T3 clone A31 Origem: BCRJ Código: 0047 hctm de tecido adiposo Origem: Lonza Código: PT 5006
Métodos Drogas Classe DL50 Mínimo DL50 Máximo (mg/kg) (mg/kg) Exemplos de drogas 1 Não determinado 5 Ciclohexamida, Cloreto de mercúrio II 2 5 50 Arsenito de sódio*, Dicromato de sódio dihidratado 3 50 300 Cloreto de cádmio II, Fluoreto de sódio 4 300 2000 Propranolol HCl, Atropina sulfato monohidrato, SDS* 5 2000 5000 Cloreto de potássio, Ácido tricloroacético 6 5000 Não determinado Glicerol*, Hipoclorito de sódio *Foram testados em 3 ensaios independentes. Scanu et al. 2012.
Resultados 3T3 Citotoxicidade do SDS hctm 3T3 hctm
Resultados A partir das curvas de inibição da viabilidade, foi calculado o IC50. Glicerol SDS Arsenito de Sódio 3T3 hctm
Resultados A partir dos dados de IC50 foi possível fazer a predição da DL50: regressão Linear: log DL50 (mg/kg) = 0.372 log IC50 (µg/ml) + 2.024 Droga Glicerol SDS Arsenito de Sódio Classe de toxicidade (DL50 mg/kg) 6 (acima de 5000) 4 (300 a 2000) 2 (5 a 50) 3T3 (Predição de DL50 mg/kg) Média ± desvio padrão de 3 ensaios independentes. Células Tronco Mesenquimais (Predição de DL50 mg/kg) 5571,6 ± 524,6 7632,1 ± 378,4 432,7 ± 9,2 484,4 ± 31,5 115,1 ± 19,3 196,5 ±5,3
Conclusão As células tronco mesenquimais apresentam capacidade de predição da toxicidade semelhante a 3T3 para as drogas avaliadas. É necessário realizar ensaio com um maior número de drogas de diferentes classes de toxicidade a fim de confirmar esses resultados.
Perspectivas Desenvolvimento de ensaios de citotoxicidade na diferenciação celular de células tronco humanas Células tronco mesenquimais adultas humanas Adipogênese e Osteogênese Células tronco pluripotentes induzidas Diferenciação nos mais diferentes tecidos: cardíaco, neuronal, etc Modelagem de doenças: Citotoxicidade em células diferenciadas Vantagens células humanas Possivelmente mais sensível para predição da toxicidade Possivelmente aplicável para testes de embriotoxicidade Redução do uso de animais
Perspectivas Desenvolvimento de ensaios de citotoxicidade na diferenciação celular de células tronco humanas: Adipogenese Adipogênese (Oil Red O) CT Meio 1 Meio 3 Induzida Controle FOLD CHANGE 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 hctm#4 21 dias Adipogênese Coloração 10 minutos Oil Red 0 CT MEIO 1 MEIO 3 Fonte: Zych, J, 2012, Aguiar AM 2013
Perspectivas Desenvolvimento de ensaios de citotoxicidade na diferenciação celular de células tronco humanas: Adipogenese Controle Induzido 100 µm 100 µm Fonte: Zych, J, 2012, Aguiar AM 2013
Laboratório de Biologia Básica de Células Tronco Instituto Carlos Chagas, Curitiba, Paraná Alessandra Melo de Aguiar* Jaiesa Zych Thamile Reus Crisciele Kuligovski Elizabeth de Moraes Ana Paula Abud Marco Aurélio Krieger Samuel Goldenberg Alejandro Correa Marco Augusto Stimamiglio Bruno Dallagiovanna *alessandra_aguiar@fiocruz.br http://www.icc.fiocruz.br/labcet/ Foto: Itamar Crispim
Pôster O 10