Nota técnica. Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas em soluções nutritivas parenterais

Nota técnica Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas em soluções nutritivas parenterais Physical stability of lipidic emulsions by electronic microscope in parenteral nutrition Márcia de Souza Antunes * RESUMO O estudo consiste na determinação da estabilidade dos lipossomas das ELs utilizadas como fonte calórica em 28 composições de NPTs, denominadas misturas 3 em 1, através da avaliação à microscopia eletrônica de transmissão. Foram verificadas as ocorrências ou não de instabilidade como floculação/agregação ou coalescência/aglutinação das partículas e medidos os respectivos maiores diâmetros encontrados, sendo estudadas as ELs originais e as formulações mais comuns em nossa prática clínica, nos tempos 0, 24, 48, 72h. Foram avaliados e calculados alguns dos fatores predisponentes e de favorecimento de instabilidade como: dosagem de ph, valores de CAN (número de agregação crítica) e avaliação farmacêutica dos insumos adicionados. Os resultados encontrados foram 5 formulações com ELs estáveis, 16 com floculação e 7 com Coalescência. Para as amostras com floculação, o fator de maior contribuição foi a diminuição do ph, interferindo nas forças eletrostáticas. Para a coalescência, a instabilidade ocorreu supostamente pela alteração do ph, pela adição de heparina e cátions divalentes em concentrações elevadas. Como conclusão os lipossomas não alteram-se morfologicamente quando: a seqüência de manipulação das formulações encontra-se em condições controladas, são analisadas farmacêuticamente, apresentam os componentes em concentrações e ordem de adição adequadas e quando o tempo e a temperatura após preparação forem os recomendados. O uso clínico da mistura 3 em 1 deve ser limitado aos parâmetros sugeridos. PALAVRAS-CHAVE Lipídeos, emulsão lipídica, lipossoma, nutrição parenteral, mistura 3 em 1. SUMMARY The study consists of determination of liposomes stability of ELs utilized with caloric font in 28 TPNs compositions, denominated 3 in 1 mixtures, through evaluation transmission eletronic microscopy. These were in occurrence or not with the stability of floculation/agregation or coalescence/aglutination particles and the larger diameter found was measured. Were studied the original ELs and the most usual formulations in our clinical pratice at these hours 0, 24, 48, 72. Appraised and estimated some of the predisposed factors in favour of instability with ph, values of CAN (critical aggregation number) and the pharmaceutical valuation of added components. The results found were 5 formulations with ELs stability, 16 with floculation and 7 with coalescence. For the samples with floculation, the largest contribution factor was the ph decrease, interfering in the electrostatic potential barrier against coalescence. For the coalescence the instability occured at supposed ph alteration and the addition of heparine and divalents cátions in high concentrations. In conclusion: the liposomes did not a altered morphologicaly when in controlled condition the mixing sequence of formulation, was analysed pharmaceuticaly, which adequate concentrations of the mixture components in order of addition and the age and temperature of the mixture as well. The clinical use these 3 in 1 mixtures be within these limited guidelines. KEYWORDS Lipid, lipid emulsion, parenteral nutrition, 3 in 1 mixture. INTRODUÇÃO Atécnica mais comumente usada nas manipulações de soluções nutritivas administradas por via venosa no início dos anos 70 era a adição de hidrato de carbono (HC), sais minerais normais, vitaminas e oligoelementos nos frascos de vidro ou bolsas plásticas de cloreto de polivinila (PVC) e, em separado, a administração de emulsões lipídicas (ELs) endovenosas, que são preparações farmacêuticas, constituídas por duas fases sendo uma delas, uma substância gordurosa. Nos dias atuais, aponta-se para o ideal que de 20 a 40% dos requerimentos calóricos diários sejam fornecidos por gordura venosa (Waitzberg, 2000). No ano de 1972 foi descrito, por Solassol e Joyeux pela primeira vez a técnica de manipulação e o uso clínico de soluções contendo todos os nutrientes necessários como: aminoácidos, glicose, lipídeos, sais minerais, vitaminas e oligoelementos, adequados para administração por via endovenosa em um único envase. Essa mistura denominada mistura 3 em 1 tornou-se popular na Europa e Canadá. Em 1982, nos EUA, o FDA - Food and Drug Administration - Orgão regulamentador de medicamentos e alimentos aprovou o uso clínico da mistura 3 em 1, preparado e veiculado em bolsas plásticas de etil vinil acetato (EVA). O uso de bolsas de polietileno (PVC), não é recomendado, por conter o dietilhexil ftalato (DEHP), plastificante ftalato (Day, 1988), cujos resíduos plásticos são dissolvidos ao contato com a emulsão lipídica e podem causar toxicidade em animais e neonatos (Bullock, 1992). O uso da mistura 3 em 1 tem diversas vantagens, Recebido em 10/10/2004 * Mestre em Patologia Clínica pela Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense, Especialista em Terapia Nutricional, Farmacêutica do Centro de Terapia Nutricional Enteral e Parenteral do Hospital Universitário Antônio Pedro da Universidade Federal Fluminense. Rev. Bras. Farm., 85(3): 121-127, 2004 121

entre elas: menor número de manipulações internas na preparação e na administração ao paciente, com conseqüente diminuição da possibilidade de contaminação; facilidade de administração (uso de fluxo venoso único), com proteção do acesso venoso, diminuindo o tempo de enfermagem envolvida na infusão; diminuição do número de equipos e bombas utilizadas na infusão,ampliando a mobilidade do paciente, simplificando o uso da terapia em ambiente domiciliar e diminuição do custo do processo. Dentre as desvantagens do uso da mistura 3 em 1, podemos citar: a instabilidade e o tempo exíguo de estocagem, que não deve ser superior a 30 horas, de acordo com sua composição. Há muitas causas de instabilidade nas preparações para uso em NPT em que a própria EL é a fase dispersa, por isso as concentrações de cada componente nessas formulações devem ser criteriosamente avaliadas. No caso das ELs para uso em NPT, o agente emulsificante é a lecitina, obtida dos fosfolipídeos da gema de ovo ou de semente de soja. Esses fosfolipídeos são ésteres glicefosfóricos da colina e de ácidos graxos diversos, como o oleico, palmítico, esteárico e outros. São emulgentes do tipo O/A, e como tal, produzem barreira mecânica e eletrostática contra a coalescência dos glóbulos (lipossomas) (Prista, 1992). Na avaliação das amostras estudadas, parâmetros da ultra-estrutura dos lipossomas foram observados ao microscópio eletrônico como as suas camadas superficiais externas, o diâmetro e a presença ou não de corpúsculo com núcleo luminoso, alterações de floculação/agregação e coalescência/aglutinação, descrevendo-se a seguir os processos de alteração. Floculação Consiste na reunião dos lipossomas da fase dispersa em agregados ou flóculos. Após essa fase inicial, observa-se a formação de creme. Do ponto de vista farmacêutico a formação desta camada concentrada de glóbulos da fase dispersa é reprovável, ocorrendo inadequada concentração das substâncias, ou seja, dos princípios ativos, em frações da camada ou na fase dispersante. Esta alteração das ELs não representa uma modificação irremediável, é possível recompor-se o sistema disperso inicial por simples agitação. Coalescência/aglutinação Alteração muito mais profunda, irreversível, e quando ocorre não permite a recomposição. A EL apresenta-se com as suas fases separadas completamente, formando duas camadas distintas. A agitação é incapaz de tornar dispersas as fases uma na outra. O ritmo de coalescência depende de diversos fatores como o tempo e temperatura de estocagem, as interações entre os cátions adicionados entre outros, mas, principalmente, das características físicas da película formada pelo agente emulsificante ao redor dos glóbulos dispersos. A coalescência da fase dispersa será tanto mais lenta, quanto mais eficaz for a película interfacial do agente emulsificante. Os lipossomas têm em média 0,6µ de diâmetro nas ELs originais, possuindo centros homogêneos que mantém em seu interior triglicerídeos, colesterol e alguns fosfolipídeos. O diâmetro crítico de um lipossoma está compreendido entre 6 a 8µ. Um lipossoma com diâmetro acima de 5µ entrando na corrente circulatória pode causar embolia gordurosa (Waitzberg, 2000). O uso de filtro de linha, tema controverso, especialmente quanto a habilidade de reduzir infecção, é preconizado pela Sociedade Americana de Nutrição Enteral e Parenteral (ASPEN) e pelo Food and Drugs Administration (FDA) em soluções de NPT, com diâmetro de 1,5 a 5µ, pois limita a infusão de partículas tais como precipitados de cálcio e fósforo ou de componentes lipídicos da mistura 3 em 1, sem alterar sua velocidade de infusão (ASHSP - Principles of Sterile Product Preparation. USA, 1995). O fosfatídeo da lecitina da gema de ovo, em sua atividade de agente emulsificante, incorpora-se às ELs com a finalidade de minimizar esta tendência de agrupamento atuando por dois mecanismos: Através da formação de uma película ao redor de cada partícula oleosa, de modo que a fração lipofílica está orientada para a fase oleosa e a fração hidrofílica está orientada para a fase aquosa, ou seja, os resíduos de ácidos graxos presentes no fosfatídeo do ovo, como os ácidos palmíticos e linoléico, formam uma porção hidrofóbica do filme de fosfolipídeos, orientando-os para a fase oleosa. O éster fosfato, por sua vez, compreende a porção hidrofílica que se direciona para a fase aquosa. Esta película constitui-se uma barreia mecânica, prevenindo a coalescência; A ionização do grupo fosfato na fase aquosa fornecendo uma barreira eletrostática (potencial zeta) na superfície de cada lipossoma, devido à carga negativa que este grupamento apresenta, estabelecendo uma repulsão mútua entre eles. Caso as forças eletrostáticas sejam neutralizadas rompe-se a camada interfacial e conseqüentemente os lipossomas passam a colidir livremente, pois, a película criada pelo agente emulsificante ao redor de cada um também sofrerá ruptura. Dentre as possibilidades de neutralização das forças eletrostáticas podemos incluir as interações químicas entre os componentes e as alterações no ph final dessas misturas. As ELs endovenosas, normalmente possuem ph entre 5,5-8, faixa essa em que o agente emulsificante atua muito bem. Alterações no ph das soluções podem afetar a ionização desses. Com queda do ph, o potencial eletrostático é reduzido e o sistema pode tornar-se instável, pois as forças de repulsão decrescem também. Com o ph na faixa aproximadamente de 2,5, pode ocorrer a perda total das forças de repulsão. A solução de glicose e os eletrólitos (sais minerais normais) adicionados em concentrações ou condições inadequadas, alteram o mecanismo de equilíbrio entre as forças eletrostáticas, deflagrando-se o mecanismo de instabilidade. A glicose exerce efeito prejudicial quando reduz excessivamente o ph da solução. Os sais de cálcio, magnésio e fósforo são componentes da NPT que, pela suas cargas divalentes possibilitam a formação de precipitados, que são potencialmente causadores de interferência nas forças eletrostáticas, neutralizando as cargas negativas dos lipossomas, causando um decréscimo das forças repulsivas. Os sais de cálcio são condicionalmente compatíveis com o fosfato de potássio, porém em NPT envolvem cuidados especiais, principalmente na escolha do tipo de fonte de cálcio, pois esse interfere diretamente na disponibilidade de cálcio livre na solução, fator de grande possibilidade de interferência na emulsão. Aparentemente cátions monovalentes tem pequeno efeito na estabilidade das ELs exceto em grandes concentrações, 122

acima de 200mEq/l de Na+ por exemplo podem ter efeitos adversos nas emulsões. Através da fórmula de Schultz-Hardy, que calcula o valor do número de agregação crítico de cátions, Critical Agregation Number CAN, podemos prever a quantidade de mudança catiônica possível de causar interferência na estabilidade das ELs utilizadas nas formulações de NPTs (Driscoll,1998). Quando acontece a floculação/agregação dos lipossomas, seja por qual for a interferência, ocorre aumento nos tamanhos dos mesmos e, conseqüentemente há a possibilidade de ocorrer a coalescência. Esse efeito é atenuado quando a glicose e os eletrólitos estão diluídos no volume total da solução em água para injeção e com a solução de aminoácidos, que exerce efeito tampão devido ao ph que possuem. As soluções de aminoácidos, aumentam a barreira mecânica em torno dos lipossomas, diminuindo sua agregação. MATERIAL E MÉTODOS Foram estudadas em amostras triplicatas, vinte e oito formulações de nutrições parenterais (NPTs), mais comumente usadas na prática clínica, nos tempos de 0, 24, 48 e 72 horas após sua manipulação, dosados os valores respectivos de ph, calculados os valores de CAN nas soluções básicas para adultos, pediatria e neonatos, na seqüência: Emulsão lipídica pura com triglicerídeos de cadeia longa (TCL); Emulsão lipídica pura com mistura de 50% de triglicerídeos de cadeia longa e 50% de cadeia curta (MCT/ LCT); variando a glicose hirpertônica nas concentrações de 10, 20 e 25%, sais normais, vitaminas, oligoelementos e 15% de EL; aditivadade L-alanil-L-glutamina, glicose hipertônica nas concentrações de 10, 20, 25%, sais normais, vitaminas, oligoelementos e 15% de EL; variando a glicose hipertônica nas concentrações de 10, 20 e 25%, sais normais, vitaminas, aditivadas com composição de oligoelementos contendo zinco, cobre, manganês, cromo, selênio, ferro, iodo, fluor e L-alanil- L- glutamina e 15% de EL; Nutrição parenteral para pacientes adultos, fixando em 15% de proteína, glicose hipertônica, sais normais, vitaminas, oligoelementos em concentrações fixas e elevadas de EL para administração em veias periféricas, aditivada de heparina e L-alanil-L-glutamina; variando a glicose hipertônica nas concentrações de 10, 20 e 25%, sais normais, vitaminas, aditivadas de L-alanil L-glutamina, insulina nas concentrações de 1/5,1/10, 1/15 e 15% de EL; Nutrição parenteral básica para neonatos, glicose hipertônica nas concentrações comumentes usadas, vitaminas, oligoelementos, sais normais, gluconato de cálcio acima do limite normal de reposição (600mg/Kg/dia) e EL; Nutrição parenteral básica para neonatos, glicosehipertônica, vitaminas, oligoelementos, concentração de eletrólitos normais (cálcio e fósforo), aditivada de 0,1UI de heparina por ml e EL; Nutrição parenteral básica para neonatos, glicose hipertônica, vitaminas, oligoelementos, concentração de eletrólitos normais (cálcio e fósforo), aditivada de 0,2UI de heparina por ml de solução e EL; Nutrição parenteral básica para pediatria, glicose hipertônica, sais normais, vitaminas, oligoelementos, aditivadas de L-alanil L-glutamina. Procedimento experimental As NPTs foram preparadas conforme as recomendações das Boas Práticas de Preparação de Nutrição Parenteral, do Regulamento Técnico para Terapia de Nutrição Parenteral, Portaria nº 272, de 15 de abril de 1999, do MS e das Boas Práticas de Manipulação de Produtos Estéreis, da Resolução RDC nº 33, de 19 de abril de 2000, do MS. Como preconizado por ambas, o procedimento utilizado foi o de preparação asséptica, realizado em sala classificada (área com ar ambiente controlado e filtrado) e sob capela de fluxo laminar classe 100, que contribuíram para manutenção da esterilidade dos insumos utilizados. Para todas as amostras estudadas foram calculados os valores de CAN segundo a fórmula de Schultz-Hardy que estabelece: CAN = a + 64b + 729c < x mmol/l sendo: a = concentração de cátions monovalentes em mmol/l; b = concentração de cátions divalentes em mmol/l; c = concentração de cátions trivalentes em mmol/l; Onde o valor de x entre 400-700 mmol/l, encontra-se na faixa de segurança, para a não interferência nas ELs pós manipulação. Os valores encontrados acima dessa faixa, representam risco de instabilidade. A cada 0,1ml de amostras em triplicatas das NPTs preparadas, foram adicionados 0,2ml de tetróxido de ósmio à temperatura de 8ºC e centrifugadas a 10.000rpm, durante 1 hora. Colocadas em repouso sob refrigeração por 24 horas. Seguindo-se de desidratação, para remoção gradual de toda água, realizada com etanol nas concentrações de 70%, 95% e 100%, em 2 banhos por 10 minutos cada. Subseqüentemente, as amostras foram banhadas em óxido de propileno puro, por 2 vezes, durante 10 minutos, para a retirada de água ainda contida. Seguidamente, a inclusão final em resina pura, mantida em repouso durante 1h na estufa a 37ºC. A polimerização da resina com o material foi completada após 24h na estufa a 60ºC. Todas as amostras estudadas das NPTs, tiveram uma alícota enviada ao Laboratório Silo, de Controle de Qualidade em Alimentos e Produtos, em frascos de vidro do tipo vacuotainer ou em frascos contendo meio de cultura apropriado para o sistema de detecção microbiana Bact- Alert (metodologia empregada pelo Laboratório), onde não evidenciou-se crescimento microbiano em nenhuma das amostras após 5 dias de sua preparação. Para a preparação das formulações estudadas foram utilizados os insumos descritos no Quadro 1. Para o estudo foram preparadas composições básicas de NPTs e acrescidas variações para pacientes adultos, neonatos e pediátricos. (Tabelas I, II, III e IV). As composições das ELs originais e das misturas 3 em 1 de nutrição parenteral que formaram as amostras desse estudo estão descritas abaixo: Amostra 1 - Emulsão com TCL pura a 20%; 123

QUADRO 1 INSUMOS LABORATÓRIO LOTE VALIDADE Solução de Aminoácidos a 10% B. Braun 0035001-2 jan-01 Solução de Aminoácidos para prematuros B. Braun 0035001-2 jan-01 e lactentes a 10% Solução de Glicose a 50% B. Braun 9094041-3 fev-01 Solução de L-alanil-L-Glutamina a 20% Fresenius Kabi 4654 jun-01 Água destilada e esterelizada para injeção B. Braun 9474216-5 nov-01 Emulsão de Lipídeos MCT/LCT a 20% B. Braun 9283 A 83 jun-01 Emulsão para injeção intravenosa com Fresenius Kabi F 7912 A out-01 glicerol, lecitina do ovo, óleo de soja a 20% Solução de Gluconato de Cálcio a 10,8% B. Braun 9463001 nov-01 Solução de Acetato de Sódio 2mEq/ml B. Braun 9331582-8 ago-01 Solução de Acetato de Potássio 2mEq/ml B. Braun 9331002-2 ago-01 Solução de Fosfato de Potássio 2mEq/ml B. Braun 8085001-1 mai-01 Solução de Sulfato de Magnésio 1mEq/ml B. Braun 9455002-2 nov-01 Solução de Cloreto de Sódio a 20% Ariston 652 mai-02 Solução de Cloreto de Potássio a 10% Ariston 946 jul-02 Solução de Acetato de Zinco a 0,5mEq/ml B. Braun 9455001-5 nov-01 Solução de Oligoelementos para nutrição parenteral total em adultos, com Sulfato de Darrow 90747 set-01 Zinco, Sulfato Cúprico, Sulfato de Manganês e Cloreto Crômico Solução de Oligoelementos para nutrição parenteral de crianças e neonatos, com Darrow 80640 jun-01 Sulfato de Zinco, Sulfato Cúprico, Sulfato de Manganês e Cloreto Crômico Solução concentrada de oligoelementos para nutrição parenteral com Selênio, Ferro, Zinco, Fresenius Kabi 92561 out-02 Manganês, Cobre, Cromo, Fluor e Iodo Polivitaminas A, B, C, D e E Cristália 991027750 out-01 Polivitamínico A, D, E, B1, B2, B3, B5, B6, C, Inpharma A: E 95006 dez-01 Biotina, Ácido Fólico e B12. B: E 96004 fev-01 Vitaminas do complexo B Cristália 991357462 jan-02 Solução de Heparina Sódica 5.000 UI/ml Organon 99092584 set-01 Amostra 2 - Emulsão com TCM/TCL pura a 20%; Amostra 3 - Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC e 15% EL; Amostra 4 - Nutrição parenteral básica para adultos, 20% HC e 15% EL; Amostra 5 - Nutrição parenteral básica para adultos, 25% HC e 15% EL; Amostra 6 - Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de L-alanil-L-glutamina (6,0ml), 10% HC e 15% EL; Amostra 7 - Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de L-alanil-L-glutamina (6,0ml), 20% HC e 15% EL; Amostra 8 - Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de L-alanil-L-glutamina (6,0ml), 25% HC e 15% EL; Amostra 9 - Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de oligoelementos c/selênio e ferro, 25% HC e 15% EL; Amostra 10 - Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de ologoelementos com selênio e ferro, L-alanil- L-glutamina (6,0ml), 10% HC e 15% EL; Amostra 11 - Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de oligoelemntos com selênio e ferro, L-alanil-Lglutamina (6,0ml), 25% HC e 15% EL; Amostra 12 - Nutrição parenteral periférica para adultos, 15% de Aa, 30% HC, 55% EL, aditivada de L-alanilglutamina (6,0ml) e heparina (100UI); Amostra 13 - Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC, L-alanil-L glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/5 e 15% EL; TABELA I para pacientes adultos Solução de aminoácido a 10% 50 Fosfato de Potássio 2mEq/ml 1 Cloreto de Sódio 20% 1 Acetato de Potássio 2mEq/ml 1 Sulfato de Magnésio 10% 1 Polivitamínico 0,2 Oligoelementos 1 Gluconato de Cálcio 10% 1 Água para injeção qsp 100 TABELA III para pacientes pediátricos Solução de aminoácido a 10% 20 Solução de Glicose a 50% 40 Cloreto de Sódio 20% 1 Acetato de Potássio 2mEq/ml 1,3 Sulfato de Magnésio 1mEq/ml 0,5 Polivitamínico 2,5 Oligoelementos 1 Gluconato de Cálcio 10% 2 Água para injeção qsp 100 Peso para cálculo: 26Kg; Idade: 8 anos; VT=80ml/Kg/dia; 80Kcal/Kg/dia; Aa: 1,5g/Kg; HC: 20%; Lip: 30%; relação 1/250. Amostra 14 - Nutrição parenteral básica para adultos, 20% HC, L-alanil-L glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/5 e 15% EL; Amostra 15 - Nutrição parenteral básica para adultos, 25% HC, L-alanil-L glutamina (6,0ml), insulina relação 1/5 e 15%; Amostra 16 - Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC, L- alanil-l-glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/10 e 15% EL; TABELA II para neonatos ETAPA I Solução de Aa para neonatos 10 Solução de glicose a 50% 10 Água para injeção 15 Cloreto de Sódio 20% 0,44 Cloreto de Potássio 10% 1,12 Sulfato de Magnésio 1mEq/ml 0,5 Oligoelementos 0,3 Acetato de Zinco (rediluído) 0,4 Polivitamínico 1 EL 5 VT 50 ETAPA II Solução de Aa para neonatos 10 Solução de glicose a 50% 10 Água para injeção 23 Cloreto de Sódio 20% 0,44 Fosfato de Potássio 2mEq/ml 0,73 Polivitamínico B 0,5 EL 5 VT 50 Peso para cálculo: 1.0Kg; aminoácido: 2g/Kg; Hidrato carbono: 7mg/Kg/min; lipídeo: 2g/Kg; 3mEq/Kg de NaCl; 1.5mEq/Kg de KCL; 0,5mEq/Kg de sulfato de magnésio; 0,8mMol/Kg de fosfato de potássio; cota básica de vitaminas e oligoelementos; Volume: 100ml/Kg em 2 etapas, separando a administração de cálcio e fósforo. TABELA IV para pacientes pediátricos Solução de aminoácido a 10% 20 Fosfato de Potássio 2mEq/ml 1 Solução de Glicose a 50% 40 Cloreto de Sódio 20% 1 Acetato de Potássio 2mEq/ml 1,3 Polivitamínico 2,5 Oligoelementos 1 Água para injeção qsp 100 Peso para cálculo: 26Kg; Idade: 8 anos; VT=80ml/Kg/dia; 80Kcal/Kg/dia; Aa: 1,5g/Kg; HC: 20%; Lip: 30%; relação 1/250. Amostra 17 - Nutrição parenteral básica para adultos, 20% HC, L-alanil-L-glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/10 e 15% EL; Amostra 18 - Nutrição parenteral básica para adultos, 25% HC, L-alanil-L-glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/10 e 15% EL; Amostra 19 - Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC, L-alanil-L-glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/15 e 15% EL; Amostra 20 - Nutrição parenteral básica para adultos, 20 % HC, L-alanil-L-glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/15 e 15% EL; Amostra 21 - Nutrição parenteral básica para adultos, 25 % HC, L-alanil-L-glutamina (6,0ml), insulina na relação 1/15 e 15% EL; Amostra 22 - Nutrição parenteral básica para neonatos, adição de cálcio (600mg/Kg/dia) e EL; Amostra 23 - Nutrição parenteral básica para neona- 124

tos, concentração normal de cálcio (300mg/Kg/dia) aditivada de heparina 0,1UI/ml; Amostra 24 - Nutrição parenteral básica para neonatos, concentração normal de fósforo (0,8mMol/Kg/ dia)aditivada de heparina 0,1UI/ml; Amostra 25 - Nutrição parenteral básica para neonatos, concentração normal de cálcio (300mg/Kg/dia) aditivada de heparina 0,2UI/ml; Amostra 26 - Nutrição parenteral básica para neonatos, concentração normal de fósforo (0,8mMol/Kg/dia) aditivada de heparina 0,2UI/ml ; Amostra 27 - Nutrição parenteral básica para pediatria com concentração normal de cálcio (200mEq/ml), aditivadas de L-alanil-L-glutamina (0,2g/Kg); Amostra 28 - Nutrição parenteral básica para pediatria com concentração normal de fósforo (45mEq/ml), aditivadas de L-alanil-L-glutamina (0,2g/Kg). Análise ultra-estrutural As análises dos lipossomas basearam-se nos seguintes aspectos ultraestruturais à microscopia eletrônica: suas camadas de superfície podendo apresentar-se com Am ph Diâm (µ) Can Hc El Ins Glu Hep Estab Hora 1 6,5 0,33 0 0 20% 0 0 0 EST 0h 2 6,5 0,54 0 0 20% 0 0 0 EST 0h 3 5,6 0,5 346 10% 15% 0 0 0 EST 0h 4 5,7 0,53 346 20% 15% 0 0 0 FLOC 24h 5 5,5 0,68 346 25% 15% 0 0 0 FLOC 24h 6 6,0 0,43 346 10% 15% 0 0 0 EST 0h 7 6,0 0,56 346 20% 15% 0 0 0 FLOC 0h 8 5,9 0,5 346 25% 15% 0 0 0 FLOC 0h 9 5,7 0,53 346 10% 15% 0 0 0 FLOC 0h 10 6,0 0,45 346 20% 15% 0 0 0 FLOC 0h 11 6,0 0,46 346 25% 15% 0 0 0 FLOC 24h 12 4,0 2,13 346 30% 55% 0 0 100 COAL 48h 13 6,0 0,44 346 10% 15% 1/5 0 0 FLOC 0h 14 6,0 0,47 346 20% 15% 1/5 6ml 0 FLOC 0h TABELA V aspecto liso, irregular ou rugoso; fina, moderadamente espessada ou espessada e quanto a corpúsculos no núcleo dos lipossomas, sendo ausentes ou presente e normal ou pigmentado. Foram analisados o estado de integridade física da EL, podendo apresentar o primeiro estágio do processo de alteração, a floculação ou o último estágio de alteração, antes da separação de fases, a coalescência/ aglutinação, utilizando como referência o diâmetro dos lipossomas nas ELs a 20% antes de misturadas, que apresentaram -se em média com tamanho de 0,6µ. RESULTADOS As amostras estudadas foram comparadas com as amostras controle com Lipossomas na EL original de padrão normal (Figura 1) e com Lipossomas em coalescência (Figura 2). Os achados referentes a presença ou não de instabilidade, como floculação/agregação e ou coalescência/aglutinação, avaliados ultra-estruturalmente, encontram-se resumidos na Tabela V. Am ph Diâm (µ) Can Hc El Ins Glu Hep Estab Hora 15 6,0 0,47 346 25% 15% 1/5 6ml 0 FLOC 0h 16 5,7 0,57 346 10% 15% 1/10 6ml 0 FLOC 0h 17 5,7 0,47 346 20% 15% 1/10 6ml 0 FLOC 0h 18 5,7 0,44 346 25% 15% 1/10 6ml 0 FLOC 0h 19 6,0 0,44 346 10% 15% 1/15 6ml 0 FLOC 0h 20 5,7 0,44 346 20% 15% 1/15 0 0 FLOC 0h 21 4,5 2,14 346 25% 15% 1/15 0 0 COAL 48h 22 5,7 2,1 980,36 TIG NOR 0 0 0 COAL 24h 23 6,0 2,05 500,36 TIG NOR 0 0 0,1 COAL 72h 24 5,7 0,52 48,22 TIG NOR 0 0 0,1 EST 0h 25 5,9 2,08 500,36 TIG NOR 0 0 0,2 COAL 24h 26 5,9 2,07 48,22 TIG NOR 0 0 0,2 COAL 48h 27 7,0 2,04 411,80 20% 30% 0 0,2ml 0 COAL 24h 28 7,0 0,61 91,80 20% 30% 0 0,2ml 0 FLOC 0h TIG= 7mg/Kg/dia; INS= UI/gHC; GLU= g/kg; HEP= UI/ml DISCUSSÃO Das 28 amostras representativas de NPTs, 5 apresentaram ELs estáveis, 16 ELs com lipossomas em fase de floculação/agregação e 7 ELs com lipossomas em fase de coalescência/aglutinação. Dentre as amostras que apresentaram floculação/agregação podemos discutir os sequintes aspectos observados: Para as Amostras 4 e 5: A presença de 20 e 25% de glicose nas soluções, é responsável pelo declínio do ph final, com valores encontrados 5,7 e 5,5 respectivamente, que propiciam modificações relativas nas forças eletrostáticas, facilitando a aproximação dos lipossomas, mas sem que ocorra sua aglutinação. O diâmetro desses apresentaram-se referencialmente maiores que das ELs originais. Os valores de CAN estavam dentro da faixa de segurança. Para as Amostras 7 a 11, 13 a 20 e 28 (Figura 3) (Figura 4): A floculação ocorreu supostamente devido a adição de glicose, mesmo em diferentes concentrações apresentadas nas diversas formulações estudadas, que como já descrito anteriormente levam a declínio do ph, modificando relativamente as forças eletrostáticas, aproximando os lipossomas, sem que sofram agregação. Os valores de CAN encontrados estavam dentro da faixa de segurança. Dentre as amostras que apresentaram coalescência/ aglutinação podemos discutir os sequintes aspectos observados: Para a Amostra 12 (Figura 5): A coalescência ocorreu supostamente devido a três situações: alta concentração de glicose (30%), responsável pelo declínio no valor do ph da solução final, pela elevada concentração de EL (55%) na formulação e pela adição de heparina diretamente à mistura 3 em1, aumentando o tempo de contato da heparina com os insumos componentes. A heparina é estável em NPTs, como misturas 3 em 1 em concentrações de até 25.000UI/L por pelo menos 30 horas (Trissel, 1999). O fenômeno de incompatibilidade entre a heparina e a EL em mistura 3 em 1, está condicionado à presença de cálcio, a concentração deste na formulação, a adição na manipulação, sua estocagem após preparação e a temperatura. Na amostra referida, mesmo com o valor de CAN na faixa de segurança, supomos que o cálcio foi complexado por polissacarídeos. O complexo cálcio/heparina, neutralizou as forças eletrostáticas, onde o cálcio funcionou com uma ponte catiônica entre os grupos aniônicos da heparina e dos lipídeos. Para a Amostra 21 (Figura 6): O processo de coalescência foi supostamente desencadeado pela concentração da glicose a 25% (que já é o limite máximo de concentração estável) após 48h da manipulação e também responsá- 125

vel pelo declínio no ph da solução final, que diminuiu a barreira eletrostática entre os lipossomas. Acreditamos que a insulina na presente concentração 1/15 (1UI para cada 15 gramas de glicose), assim como nas demais concentrações, conforme descrição na Tabela V, que são inclusive concentrações maiores (1/5 e 1/10), não contribuiu para a alteração da formulação. Para a Amostra 22 (Figura 7): A coalescência ocorreu, supostamente pela perda da barreira eletrostática e conseqüentemente da barreira mecânica, dependentes do estresse físico-químico causado pela concentração de cátion divalente (Cálcio) elevado. Com a neutralização das forças eletrostáticas pelos cátions divalentes, ocorreu rom- FIG. 1 - Lipossomas de padrão normal EL 20% original, 0,6µ, (30.000 X). FIG. 3 - Eletromicrografia de transmissão da NPT básica, adulto 20% HC; T = 72h, (50.000 X). FIG. 9 - Eletromicrografia de transmissão da NPT neonatos Ca normal, HEPARINA 0,2UI/ml; T = 24h, (50.000 X), (2,08µ). 126 pimento do filme interfacial e da barreira mecânica ao redor dos lipossomas, e esses passaram a colidir sucessivamente, favorecendo a coalescência. Ocorrendo perda das camadas de superfície dos lipossomas formaram-se partículas de diâmetros maiores, podendo variar de 2µ a 15µ Os lipossomas com esse diâmetro, mesmo estando ainda em dispersão, escapam da faixa de acuidade visual na inspeção e apresentam um grande potencial de risco clínico. Ao analisarmos o valor do CAN calculado com os cátions da formulação, da amostra em questão, podemos confirmar que o resultado encontra-se acima da faixa de segurança. O valor de ph encontrado, que não sofreu alteração, pareceu não interferir favorecendo mais efetivamente na instabilidade da solução. Para a Amostra 23 (Figura 8): A coalescência ocorreu, supostamente pela perda da barreira eletrostática e conseqüentemente da barreira mecânica, dependentes também de estresse físico-químico causado pelo complexo cálcio/heparina, mesmo em baixas concentrações de ambos, após 72h. Podemos avaliar que o ph não sofreu grande declínio e não foi um FIG. 2 - Lipossomas em coalescência após contato fator de interferência na instabilidaglicose 50%, (30.000 X), (2,76µ). FIG. 4 - Eletromicrografia de transmissão da NPT pediátrica, fósforo normal, glutamina; T=72h, (18.000 X). FIG. 5 - Eletromicrografia de transmissão da NPT periférica, adulto, glutamina, heparina; T= 48 h, (30.000 X), ( 2,13µ). FIG. 7 - Eletromicrografia de transmissão da NPT básica, neonatos, Ca elevado; T= 24h, (50.000 X), (2,10µ). FIG. 8 - Eletromic. de transmissão da NPT Neonatos, Ca Normal, Heparina 0,1 UI/ml; T = 72h, (30.000 X), (2,05µ). FIG. 11 - Eletromicrografia de transmissão da NP Pediátrica, Ca Normal, Glutamina; T = 24h, (30.000 X) (2,06µ).

de, assim como o valor obtido no cálculo do CAN para os cátions, cujo resultado encontra-se dentro da faixa de segurança. Para a Amostra 25 (Figura 9): A coalescência ocorreu, supostamente pela complexação de cálcio/heparina na amostra, mesmo estando o cálcio em valor normal de concentração e o CAN na faixa de segurança. A observação sugere que com essa concentração de heparina, (0,2UI/ ml) após um tempo de contato, que no caso, foi de 24h, houve desencadeamento da instabilidade da EL. O valor de ph encontrado não sugere uma interferência no processo de coalescência. Para a Amostra 26 (Figura 10): A coalescência ocorreu, após 48 horas do preparo da solução, supostamente pela presença de cátion divalente como o fosfato e a heparina, em neutralização ao potencial Zeta dos lipossomas. O ph mantendo-se em 5,9 (valor dosado), não favoreceu a coalescência, mas a presença de heparina em uma concentração de 0,2UI/ml, pode efetivamente ser um promotor da instabilidade. Para a Amostra 27 (Figura 11): A coalescência ocorreu, após 24 horas da preparação supostamente pela concentração de 20% da glicose em relação a concentração de EL da fórmula, alterando o potencial Zeta ao redor dos lipossomas. Mesmo com uma concentração de aminoácidos como a L-alanil-glutamina, adicionados, que elevam o ph, atuando com um efeito tampão, não ocorreu o aumento do mesmo. O declínio do ph, justifica-se pois a concentração do aminoácido glutamina foi computada na concentração final de aminoácidos proposta pela prescrição e não excedendo a relação entre os componentes da formulação. CONCLUSÕES Nas condições do presente estudo obtivemos as seguintes conclusões: A dosagem do ph deve ser sempre realizada, por ser um dos fatores predisponentes mais importantes de instabilidade. Para ph em declínio, na faixa de 4,0 de 5,0 as forças eletrostáticas são facilmente neutralizadas ao redor dos lipossomas facilitando sua instabilidade; Os cálculos dos valores de CAN, que considera a interferência dos cátions na estabilidade devem ser realizados em todas as formulações, excetuando as previamente estudadas e padronizadas, pois definem as possibilidades de interferência após a adição das ELs na estabilidade nas soluções; Dentre os insumos utilizados mais freqüentemente nas NPTs, a glicose representa o de maior risco, como observamos nos resultados obtidos nas análises em triplicatas das amostras 4, 5, 7, 8, 10 e 11 onde esse componente supostamente influenciou na floculação e causando coalescência somada a adição de heparina em concentrações como de 30% na amostra 12; A estabilidade Cálcio/fósforo é maior com concentrações maiores de soluções aminoácidos, pela formação complexos solúveis com ambos, diminuindo a quantidade desses íons livres, que interferiram em menor escala nas formulações, e conseqüentemente na solução final após a adição da EL; A adição de heparina em misturas 3 em 1 na concentração de 1UI/ml, contendo cálcio para manutenção/reposição e não em concentrações mais elevadas é estável até 24/30 horas; A adição de heparina na concentração de 0,2ml/ml em misturas 3 em com CANs elevados são proibitivas de preparação; A adição de eletrólitos deve ser sempre que possível a de manutenção e não de reposição; A adição de L-Alanil- L- glutamina em concentrações recomendadas na literatura são protetoras dos lipossomas das ELs, estudadas em igual observação para as misturas 3 em 1 contendo TCM/TCL ou TCL puro, contribuindo para sua estabilidade. AGRADECIMENTOS Aos prof. Maria Lucia Caldas e Miguel Farah, orientador e co-orientador na tese de mestrado e a Técnica Suely Menezes da Cunha pelo apoio técnico na microscopia eletrônica do laboratório da Patologia Experimental do HUAP-UFF. REFERÊNCIAS 1. Antunes, Marcia; Guedes, João. Controle de qualidade de misturas de ácidos aminados, hidrato de carbono e emulsão de lipídeos para uso parenteral (3 em 1). Arq. Bras. Med. 1994,Set/Out 68 (5) : 303-305; 2. Bullock L, Fitzgerald Jf; Walter Wv Emulsion stability in total nutrient admixtures containing a pediatric amino acid formulation JPEN 1992, Jan/Feb 16 (1) : 64-68; 3. Chansiri G, Lyons RT, Patel MV, Hem SL Effect of surface charge on the stability of oil/water emulsions during steam sterilization. J. Pharm.Sci. 1999, Apr 88 (4) : 454-8; 4. Deitel M et al.- Emulsion Stability in a total nutrient admixture for total parenteral nutrition. J.Am. Coll Nutr. 1992, Feb 11 (1) : 5-10; 5. 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