Vacinas de DNA contra dengue combinadas a outras estratégias Ada M. B. Alves (ada@ioc.fiocruz.br)
DENGUE Hospedeiro invertebrado - mosquito Aedes Hospedeiro vertebrado - humanos Vírus: Arbovírus Família Flaviviridae Quatro Sorotipos: DENV1, DENV2, DENV3, DENV4
Países/áreas de risco de transmissão de dengue
DF DHF San Martin et al. Am J Trop Med Hyg. 2010 82(1):128-35
Susceptibilidade e Imunidade - Imunidade permanente para o mesmo sorotipo - Imunidade temporária para outro sorotipo
O VÍRUS DA DENGUE Modelo esquemático M E C RNA Modificado de Lindenbach & Rice 2001 RNA
INFECÇÃO VIRAL Célula infectada Lindenbach & Rice 2001
VÍRUS DA DENGUE
Vacinas de subunidades: E Vacinas contra dengue Maior dificuldade: Vacina contra os 4 sorotipos - Proteína E dos 4 sorotipos (produzida em células de Drosófila) - Hawaii Biotechnology/Merck (ensaios clínicos) - Baixa imunogenicidade (necessidade de várias doses), adjuvantes Vacinas inativadas: - Vírus produzido em cultura de células e inativados (GSK) - Baixa imunogenicidade (adjuvantes) Vacinas atenuadas: Obtidas por passagens em cultura de células (de macaco e cachorro) Problemas: - Conseguir uma dose ideal com diferentes concentrações dos diversos sorotipos - Walter Reed Army Institute / GSK ensaios clínicos Fase II
Vacinas com Vírus Quiméricos: - Vírus vacinal da Febre Amarela com alguns genes dos vírus da dengue (BioManguinhos testes em primatas; Sanofi-Pasteur ensaios clínicos Fase III) - Vírus DENV4 atenuado (DEN4 30) contendo genes dos outros sorotipos (NIH ensaios clínicos) - Vírus DENV2 atenuado contendo genes dos outros sorotipos (Inviragen ensaios clínicos Fase I) Vacinas de DNA: - Proteínas prm/e (Navel Medical Research Center, USA ensaios clínicos Fase I) - Proteína C - Proteína NS1 - Proteína NS3
Vacinas de DNA contra dengue
Proteína E e prm/m Anticorpos Neutralizantes
Proteína do Envelope Modis et al., 2003 Protein E: três domínios (I, II and III); Domínio III - Interação com receptores presentes na superfície das células hospedeiras (internalização do vírus); - Anticorpos neutralizantes.
Construções plasmidiais 80% Envelope Protein (pe1d2) amino acids 1 52 132 191 278 296 398 stem-anchor region 493 Domain I Domain II Domain III (pe2d2) pe1d2 t-pa E80% pe2d2 t-pa E Dom III
Expressão in vitro das proteínas recombinantes (células BHK) Imunofluorescência pe1d2 pe2d2 pctpa Marcação metabólica e imunoprecipitação (sobrenadante das culturas) KDa pe1d2 pe2d2 pctpa Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
TESTES DE DESAFIO Inoculação por via intracerebral (i.c.) de DENV-2 neuroadaptado a camundongos
% of Survival Imunicação (i.m.) de camundongos Balb/c e desafio (i.c.) com DENV-2 Sobrevivência 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 pe1d2 pe2d2 pctpa DENV-2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Days after challenge Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
% of Morbidity Degree of Morbidity Morbidade (Paralisia dos membros posteriores e comprometimento da coluna vertebral) ** *** * 100 pe1d2 + DENV-2 3 80 60 pe2d2 + DENV-2 pctpa + DENV-2 DENV-2 2 40 1 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021 Days after Challenge 0 pe1d2 pe2d2 pctpa DENV-2 Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
(PRNT 50 titer) Anticorpos neutralizantes contra DENV-2 700 ** 600 500 400 300 200 100 0 pe1d2 * pe2d2 pe1d2 after challenge pe2d2 after challenge Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
Imunizações Combinadas Vacina de DNA + Vírus Quimérico YF17D-D2 17DD2 C prm E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5
Vacina Tetravalente (CYD) Sanofi Pateur Cerca de 4.000 crianças na Tailândia (4-11 anos) Três doses (0, 6 e 12 meses) Acompanhamento 25 meses
Casos de dengue Anticorpos Neutralizantes Sabchareon et al. 2012 Lancet 380:1559-67
Imunizações Combinadas Vacina de DNA + Vírus Quimérico YF17D-D2 17DD2 C prm E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5
Desafio com DENV2 pe1d2 + 17DD2 Dose / Reforço (prime/boost) Azevedo et al. 2013 Plos One 8: e58357
Desafio com DENV2 pe1d2 + 17DD2 Imunização Simultânea (mix) Azevedo et al. 2013 Plos One 8: e58357
Anticorpos neutralizantes Dose / Reforço Imunziação Simultânea
Elispot IFN-g Azevedo et al. 2013 Plos One 8: e58357
Proteína NS1
Altamente imunogênica: pacientes convalescentes apresentam altos níveis de anticorpos contra NS1 Anticorpos com fixação de complemento, lise de células infectadas Sem o risco de ADE Proteção Resposta imune de células citotóxicas T CD8+ Patogênese Ativação do complemento aumento da permeabilidade vascular (DHF/DSS) Anticorpos que reagem com proteínas do organismo (fibrinogênio, trombócitos, células endoteliais)
Vacinas de DNA com o gene que codifica a NS1 de DENV-2 pctpans1anc t-pa NS1 ANC pctpans1 t-pa NS1 C prm E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5 5 3 pcens1 E NS1 pcens1anc E NS1 ANC
Western Blot Extrato celulares Sobrenadantes das culturas kda kda 49.1 134 82 34.8 40.6 Costa et al., Virology 358: 413-23, 2007
Titers Especificidade dos anticorpos anti-ns1 40000 30000 20000 10000 pctpans1 / intact NS1 pctpans1 / denatured NS1 pcens1 / intact NS1 pcens1 / denatured NS1 0 0 2 4 6 8 10 Weeks Costa et al., Virology 358: 413-23, 2007
Produção de IFN-g (Elispot)
Desafio I com DENV-2 Inoculação por via intracerebral (i.c.) de DENV-2 neuroadaptado a camundongos
% of Morbidity % of Survival % of Morbidity % of Survival pctpans1 (a) 100 80 pctpans1 + DENV-2 pctpa + DENV-2 DENV-2 (b) 100 80 60 60 40 20 40 20 pctpans1 + DENV-2 pctpa + DENV-2 DENV-2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Days 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Days pcens1 (c) 100 80 pcens1 + DENV-2 pcdna3 + DENV-2 DENV-2 (d) 100 80 60 60 40 40 pcens1 + DENV-2 pcdna3 + DENV-2 DENV-2 20 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Days Days Costa et al., Virology 358: 413-23, 2007
Desafio II com DENV-2 Inoculação por via i.p. ou i.v. de DENV-2 isolado de um paciente no Rio de Janeiro e não adaptado a camundongos
Histopatologia (fígado) Paes et al., Laboratory Investigation 89:1140-51, 2009
Níveis séricos de enzimas hepáticas (ALT e AST) Paes et al., Laboratory Investigation 89:1140-51, 2009
% hemorragia Imunização com pctpans1 ou pcens1 e quantificação das alterações hepáticas Hemoragia 1.2 * 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 GL 200x Costa et al., to be submited
Tumefação Esteatose 5 * 4 *** ** 5 * 4 ** 3 3 2 2 1 1 0 pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 0 pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 HE 200x HE 400x Costa et al., to be submited
U/L U/L 800 600 ALT 1000 800 AST 400 200 600 400 200 0 Non-infected pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 0 Non-infected pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 1000 Plaquetas 800 10 3 / mm 3 600 400 200 0 Non-infected pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 Costa et al., to be submited
Lab. Biotecnologia e Fisiologia de Infecções Virais Ada M. B. Alves Simone M. Costa, PhD Antônio J.S. Gonçalves, PhD Marciano V. Paes, PhD Adriana S. Azevedo, PhD Ana Cristina Nogueira, PhD Edson R.A. de Oliveira, PhD student Márcio M. Barradas, M.Sc Kíssela Rabelo, M.Sc student Juliana F.A. da Silva, M.Sc student Paolla Beatriz A. Pinto, graduate student Eduardo R.P. Veltri, graduate student Rafael L.C. Silva, graduate student
COLABORATIONS BioManguinhos/ FIOCRUZ, Brazil Dr. Ricardo Galler Dr. Marcos S. Freire IOC/FIOCRUZ, Brazil Dra. Cecília J. Almeida UFRJ Dr. Ronaldo Mohana Borges Hospital Gafrée Guinle/UNIRIO Brazil Dr. Carlos Alberto Basílio de Oliveira USP, Brazil Dr. Luis Carlos S. Ferreira Dra. Silvia Boscardin Ohio State University Medical Center, USA Dr. Gerard J. Nuovo
Financial Support FIOCRUZ PDTIS PRONEX - DENGUE