Terapia fotodinâmica no tratamento da periimplantite

Revisão da Literatura Terapia fotodinâmica no tratamento da periimplantite Photodynamic therapy on peri-implantitis treatment Juliana Marotti* Mônica Nogueira Pigozzo ** Atlas Edson Moleros Nakamae*** Pedro Tortamano Neto*** Dalva Cruz Laganá**** Tomie Nakakuki de Campos**** RESUMO Diversas terapias têm sido estudadas para o tratamento da periimplantite. Contudo, nenhuma permite a completa eliminação das bactérias da bolsa periimplantar e, os antibióticos, por sua vez, geram resistência bacteriana a longo prazo e podem provocar efeitos colaterais. Uma terapia que tem se mostrado bastante eficiente no tratamento da periimplantite é a utilização do laser. A terapia fotodinâmica (PDT) consiste da associação de um agente fotossensibilizador mais uma fonte de luz específica, como o laser de baixa potência, gerando espécies de vida curta e altamente reativas que, em altas concentrações, são tóxicas, promovendo a morte de bactérias, fungos e vírus. A terapia fotodinâmica tem sido empregada nas diversas especialidades da Odontologia como a Periodontia, Endodontia e, mais recentemente, na Implantodontia com o objetivo de redução bacteriana. O laser de baixa potência promove, através da PDT, uma redução bacteriana muito similar ao laser de alta potência, com a vantagem de não promover aumento da temperatura e a um custo reduzido. Vários autores mostram os benefícios da PDT no tratamento da periimplantite. Não há, entretanto, um consenso na literatura sobre quais parâmetros para a irradiação a laser seria mais eficaz para a descontaminação. O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão da literatura sobre os protocolos utilizados na terapia fotodinâmica no combate às bactérias causadoras da periimplantite. Unitermos - Implante dentário; Inflamação; Terapia fotodinâmica; Descontaminação; Lasers. ABSTRACT Many therapies have been studied for peri-implantitis treatment. However, any of them could achieve completely elimination of bacteria from peri-implant pockets, and antibiotics could induce bacteria resistance in long period and cause side effects. A therapy that has been show very efficient in peri-implantitis treatment is the use of laser. Photodynamic therapy (PDT) consist of a association of a fotosensitizer plus a specific light source, like low power laser, generating very short and reactive chemical species that, in high concentrations, are toxic, promoting killing of bacteria, fungi and viruses. Photodynamic therapy has been used in many Dentistry specialties like Periodontology, Endodontics and, recently, Implantology aiming reducing bacteria. The low power laser promotes, through PDT, a bacterial reduction very similar to high power laser, with the advantage of not promoting elevation of temperature and with a lower cost. Many authors show the benefits of PDT in treatment of peri-implantitis. However, there is no consensus in literature what parameters for laser irradiation would be more efficient for decontamination. The aim of this work is to make a literature review of protocols used in photodynamic therapy for reduction of peri-implantitis bacteria. Key Words - Dental implantation; Inflammation; Photodynamic therapy; Decontamination; Lasers. * Mestranda do Departamento de Prótese Dentária da Faculdade de Odontologia da USP; Colaboradora do Lelo-Fousp. ** Doutoranda do Departamento de Prótese Dentária da Faculdade de Odontologia da USP. *** Professores doutores do Departamento de Prótese Dentária da Faculdade de Odontologia da USP. **** Professoras titulares do Departamento de Prótese Dentária da Faculdade de Odontologia da USP. Recebido em: nov/2007 Aprovado em: jun/2008 401

Introdução A importância dos implantes dentais aumentou consideravelmente nas últimas décadas na reabilitação oral protética e, apesar do alto número de casos com sucesso, muitos implantes são perdidos 1. Vários fatores etiológicos estão associados com a perda do implante dental, como erro de planejamento, carga prematura ou excessiva, falta de estabilidade primária e, principalmente, infecção periimplantar 2. A periimplantite é definida como um processo inflamatório que afeta os tecidos ao redor do implante osseointegrado em função, resultando em perda do osso de suporte 3. Esta doença é causada por bactérias específicas que colonizam a superfície dos implantes dentais, gerando inflamação gengival, migração apical do epitélio juncional e exposição da superfície da rosca do implante ao meio oral, resultando em bolsas periimplantares e, posteriormente, à perda do implante 2. A prevalência da periimplantite foi reportada na escala de 1% a 19%, sendo que essa alta variação pode ser devida a diferenças entre os autores em diagnosticar a doença. O interesse em métodos de tratamento da periimplantite surgiu somente na década de 90. A freqüência da doença aumenta conforme o passar dos anos do implante no meio oral. Considerando que a Implantodontia foi introduzida recentemente, os números de casos de periimplantite tendem a aumentar 4. Diversas terapias têm sido estudadas para o tratamento da periimplantite. Contudo, nem a remoção mecânica do biofilme sobre o implante nem o uso de soluções desinfetantes permite a completa eliminação das bactérias da bolsa periimplantar. Os antibióticos, por sua vez, geram resistência bacteriana a longo prazo, perdendo paulatinamente sua efetividade e podem provocar efeitos colaterais 5. Uma terapia que tem se mostrado bastante eficiente no tratamento da periimplantite é a utilização do laser 1. A luz laser possui características específicas, diferenciando-a da luz comum, como monocromaticidade, coerência, colimação e possibilidade de polarização, sendo que seu comprimento de onda é um dos fatores que influenciam o efeito nos tecidos e irá determinar a indicação para as diversas terapias em Odontologia como nas demais áreas biomédicas. De uma forma geral, os lasers podem ser divididos em lasers de alta e baixa potência. Sabe-se que somente os lasers de alta potência têm a capacidade de coagulação, remoção de tecido e descontaminação, pelo aumento da temperatura (efeito fototérmico). Os lasers de baixa potência, por sua vez, promovem efeitos fotoquímicos e são empregados para bioestimulação, modulação da inflamação e analgesia, não sendo capazes de remover tecido ou promover a descontaminação, uma vez que não geram aumento da temperatura durante a irradiação 6-7. A associação de um agente fotossensibilizador mais uma fonte de luz específica, na presença de um substrato, como por exemplo, o oxigênio, gera espécies de vida curta e altamente reativas, como o oxigênio singleto que, em altas concentrações, são tóxicas, promovendo a morte de bactérias, fungos e vírus. Esse processo é conhecido como terapia fotodinâmica ou PDT (Photodynamic Therapy) 8-9. A terapia fotodinâmica tem sido empregada nas diversas especialidades da Odontologia como a Periodontia, Endodontia e, mais recentemente, na Implantodontia com o objetivo de redução bacteriana. Os resultados clínicos são bastante satisfatórios, sendo que o laser de baixa potência promove, através da PDT, uma redução bacteriana muito similar ao laser de alta potência, com a vantagem de não promover aumento da temperatura e a um custo reduzido 10. A PDT é uma técnica que pode potencialmente atingir células prejudiciais sem afetar os tecidos normais do hospedeiro. Essa terapia foi inicialmente idealizada para o tratamento do câncer, baseada na observação de que algumas moléculas não tóxicas os fotossensibilizadores, como os derivados das porfirinas, se acumulam principalmente nas células malignas e, quando uma luz (geralmente um laser) é aplicada nos tecidos contendo a droga, ela é ativada e os tecidos são rapidamente destruídos, precisamente onde a irradiação foi direcionada. A efetividade da terapia combina dois princípios: o acúmulo preferencial de fotossensibilizador nas células-alvo e a irradiação precisa da luz, o que possibilita a ação seletiva e localizada da terapia fotodinâmica 11. A PDT pode ser influenciada, entre outros fatores, pelo ph do meio, conteúdo de água, presença de exsudato, sangue, concentração e tempo de permanência do agente fotossensibilizador, comprimento de onda do laser, energia utilizada e tempo de exposição à luz laser 12. Apesar do mecanismo da terapia fotodinâmica ser conhecido há muitos anos, somente recentemente houve um maior interesse da comunidade científica sobre as aplicações na clínica diária 5. Vários autores mostram os benefícios da PDT no tratamento da periimplantite 1,7,9,13-16. Não há, entretanto, um consenso na literatura sobre quais parâmetros para a irradiação a laser seria mais eficaz para a descontaminação. O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão da literatura sobre os protocolos utilizados na terapia fotodinâmica no combate às bactérias causadoras da periimplantite. Revisão da Literatura Após exposto à cavidade oral é formada sobre a superfície do implante, muito parecido como ao elemento dental, uma película adquirida pelo contato com os biopolímeros presentes na saliva. Essa película adquirida forma a interface entre a superfície do implante e os primeiros 402

microorganismos, como o Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis e Streptococcus oralis. Essas bactérias criam condições para a adesão de patógenos periodontais como o Hamophilus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Treponema denticola ou Tannerella forsythensis, que podem induzir à periimplantite 17. Para que as bactérias causadoras da periimplantite sofram os efeitos da terapia fotodinâmica, é necessário que o agente fotossensibilizador seja absorvido. Estudos 18-19 mostram que as bactérias Gram-positivas (G+) são mais susceptíveis à ação da PDT. É possível, entretanto, atingir bactérias Gramnegativas (G-) também, porém muitas são resistentes 5,20. Essa resistência pode ser explicada pela mudança na parede da célula ou por seleção de corantes específicos 21-22. Mais de 400 substâncias são conhecidas como fotossensibizantes, incluindo corantes, drogas, cosméticos e compostos naturais. Os fotossensibilizadores mais utilizados na redução microbiana em Odontologia são: azul de metileno, verde de malaquita, azul de toluidina O, cristal violeta, fitalocianinas, hematoporfirinas e protoporfirina 5,10. Contudo, bactérias como Porphyromonas gingivalis e Actinomyces odontyculus não necessitam do uso adicional de corantes externos, pois são capazes de sintetizar a proporfirina IX, um dos corantes mais utilizados na PDT. Assim, a simples irradiação com o laser com comprimento de onda na faixa do vermelho do espectro eletromagnético, produz a morte desses microorganismos e melhora a inflamação do tecido gengival 9. Com o intuito de avaliar a eficácia do azul de metileno e do azul de toluidina O sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli e Psedomonas aeruginos, os corantes foram utilizados em diversas concentrações: 10 µm, 20 µm, 30 µm, 40 µm, 50 µm, 100 µm, 150 µm e 200 µm. Os autores utilizaram o laser de argônio 630 nm e o laser de diodo Diversas terapias têm sido estudadas para o tratamento da periimplantite. Contudo, nem a remoção mecânica do biofilme sobre o implante nem o uso de soluções desinfetantes permite a completa eliminação das bactérias da bolsa periimplantar. Os antibióticos, por sua vez, geram resistência bacteriana a longo prazo, perdendo paulatinamente sua efetividade e podem provocar efeitos colaterais 5. 664 nm, variando a dose de 10 J/cm ² a 60 J/cm ², e a intensidade de 50 mw/cm² a 100 mw/cm². Os resultados mostraram que todos os microorganismos foram eliminados em diferentes porcentagens. Entretanto, a fotossensibilização dependeu do corante utilizado, da sua concentração, dose e densidade de potência do laser, bem como da bactéria envolvida 23. Em um estudo recente 24, foi observada a eficácia do verde de malaquita na PDT sobre a bactéria Actinobacillus actinomycetemcomitans, presente no biofilme oral. Culturas desse microorganismo foram irradiadas com laser de diodo de baixa potência de 660 nm com 30 mw de potência e os grupos foram expostos por três ou cinco minutos (5,4 J/cm² e 9 J/cm²), na presença ou ausência do corante. Os resultados mostraram que o laser ou o corante sozinho, não são capazes de eliminar a bactéria e que ambas as doses foram eficientes na PDT. Em um estudo 15 com 15 pacientes, foi demonstrado redução bacteriana (P. gingivalis, P. intermedia e A. actinomycetemcomitans) em diferentes superfícies de implantes com redução de 92% em média, sendo 97% para P. gingivalis, após um minuto de irradiação durante a PDT com azul de toluidina O e laser de diodo de 690 nm. Outro estudo clínico 25 comparou a eficácia da PDT em relação ao tratamento convencional periodontal por raspagem e alisamento radicular. Dez pacientes foram divididos em quatro grupos, sendo G1 terapia convencional + PDT (685 nm, 30 mw, 1,6 J/cm² e azul de metileno a 0,05%); G2 apenas laser; G3 tratamento convencional e G4 apenas técnicas de higiene oral. Os autores concluíram que a PDT foi mais eficiente no tratamento da doença periodontal, quando aliada à técnica convencional. Um trabalho 14 avaliou o efeito da PDT na periimplantite induzida em cães sobre diferentes superfícies de implantes dentais. O grupo controle recebeu apenas o tratamento convencional, enquanto ao grupo teste foi acrescida a PDT com laser de diodo AsGaAl 830 nm, 50 mw, 80 s, 4 J/cm² e azul de toluidina O 100 µg/ml. Concluiu-se que a PDT aliada à terapia convencional apresentou uma melhor reosseointegração dos implantes nas áreas adjacentes ao defeito induzido da periimplantite, independente do tipo de superfície do implante, com a vantagem de não promover seleção de microorganismos resistentes e ser de fácil aplicação. O azul de metileno a 0,01% foi utilizado em um estudo 26 para avaliar a eficiência da terapia fotodinâmica sobre as bactérias P. gingivalis, F. nucleatum, P. intermedia, A. actinomicetemcomitans e S. sanguis. Foram utilizados dois lasers; He-Ne (632 nm, 30 mw) e diodo de AsGaAl (665 e 830 nm, 100 mw). O laser de He-Ne foi utilizado por 30 e 60 segundos, com doses de 3,2 J/cm² e 6,4 J/cm², enquanto o laser de diodo, no mesmo tempo, gerou doses de 10,6 J/cm² e 21,2 J/cm². Os resultados mostraram que a terapia foi tempo-dependente para ambos os sistemas de lasers. O 403

laser de diodo de 830 nm, entretanto, foi o mais efetivo com exposição por 60 s e dose de 21,2 J/cm², promovendo a redução de 99% a 100% das bactérias P.gingivalis, P.intermedia e S. sanguis. Já para as espécies de A. actinomicetemcomitans e F. nucleatum, o tratamento pela PDT promoveu redução de 95% e 96%, respectivamente. O azul de metileno também foi utilizado em outro estudo 27 na PDT com laser de 665 nm, 40 J/cm², em colônias de Staphylococcus epidermoides e S. aureus com alterações na cápsula e na produção de exotoxinas. Os resultados obtidos indicaram alterações na morte celular em virtude da produção de exotoxinas, que pode ser um obstáculo para a PDT e que corantes catiônicos podem superar o efeito negativo da presença de exotoxinas quando associados ao laser. Um estudo 28 foi realizado para observar a influência de fatores como fluido gengival, sangue, saliva, entre outros, na terapia fotodinâmica. Foram analisadas culturas bacterianas de P. gingivalis, Bacterioides forsythus, F. nucleatum, P. intermedia e A. actinomicetemcomitans associadas ao sangue ou soro fisiológico, simulando o fluido gengival. Como fonte de luz foi utilizado o laser de He-Ne de 635 nm e lâmpada de xenônio com filtro vermelho. O fotossensibilizador usado foi o azul de toluidina O nas concentrações de 12,5 µg/ml e 50 µg/ml. Melhores resultados foram alcançados na concentração 12,5 µg/ml, com dose de 10 J/cm² e intensidade de 100 mw/cm². Os autores concluíram que a presença de fluido gengival e sangue podem interferir tanto na ação da luz quanto no corante durante a PDT. Discussão Há um consenso na literatura de que higiene oral adequada é fundamental para evitar a periimplantite. São várias as terapias relatadas; entretanto, quando da instalação da doença, os tratamentos convencionais incluem raspagem supra e submucosa, irrigação com solução de clorexidina, peróxido de hidrogênio, solução de tetraciclina, administração de antibióticos via sistêmica e, nos casos mais graves, intervenção cirúrgica 14. Paralelamente, com o advento do laser na Odontologia, estudos mostram a eficácia dos lasers de alta potência e da terapia fotodinâmica no combate às bactérias periimplantares quando associados ao tratamento convencional 2,9,14,29. A utilização dos lasers de alta potência, por sua vez, emitido em altas intensidades, pode gerar aumento da temperatura indesejado no ligamento periodontal e intrapulpar, podendo provocar reabsorções ósseas ou necrose da polpa, caso os parâmetros do laser sejam utilizados de maneira inadequada. Outras desvantagens dos lasers de alta potência incluem o custo ainda relativamente alto dos equipamentos e de sua manutenção, além da possibilidade de causar danos à superfície do implante, dependendo do laser 9,16,30. Nesse contexto, pode-se citar algumas vantagens da terapia fotodinâmica em relação ao uso dos antimicrobianos tradicionais. A morte celular mediada pela liberação de radicais livres torna o desenvolvimento de resistência pelos microorganismos improvável. Como a morte bacteriana é rápida, não é necessária a manutenção do agente químico por longos períodos, caso dos anti-sépticos e antibióticos. Além disso, a terapia é altamente seletiva, sendo confinada à área da lesão pela aplicação tópica cuidadosa do corante e restrição da irradiação por meio do uso de fibra óptica específica 11. Diversos fatores estão envolvidos na terapia fotodinâmica: microorganismos, agente fotossensibilizador (tipo e concentração), fonte de luz (comprimento de onda, potência, dose) e tempo (de irradiação e de contato do microorganismo com o fotossensibilizador) 10. É importante controlar todos esses fatores e adequar os parâmetros de irradiação na PDT para o sucesso da terapia. Conclusão Diante dessa revisão da literatura pode-se concluir que a terapia fotodinâmica, aliada ao tratamento convencional da doença periimplantar pode ser uma ferramenta útil na eliminação e/ou prevenção das principais bactérias da periimplantite, com a vantagem de ser seletiva, de fácil aplicação, não promove resistência bacteriana e de baixo custo. Contudo, novos estudos são necessários a fim de determinar parâmetros específicos de irradiação a laser e escolha do fotossensibilizador para maior efetividade e abrangência da terapia fotodinâmica. Endereço para correspondência: Juliana Marotti Departamento de Prótese Dentária da Faculdade de Odontologia da USP Av. Prof. Lineu Prestes, 2227 - Cidade Universitária 05508-900 - São Paulo - SP Tel: (11) 2942-7099 marotti@usp.br 404

Referências 1. Deppe H, Horch HH, Schrödl V, Haczek C, Miethke T. Effect of 308-nm excimer laser light on peri-implantitis-associated bacteria-an in vitro investigation. Lasers Med Sci 2007 Dec;22(4):223-7. 2. Hayek RR, Araújo NS, Gioso MA, Ferreira J, Baptista-Sobrinho CA, Yamada AM, Ribeiro MS. Comparative study between the effects of photodynamic therapy and conventional therapy on microbial reduction in ligature-induced peri-implantitis in dogs. J Periodontol. 2005 Aug;76(8):1275-81. 3. Albrektsson T, Isidor F. Consensus report of session IV. In Proceedings of the first European workshop on periodontology. Lang NP & Karring T Quintessence;1994. p 365-9. 4. Roos-Jansåker AM, Renvert S, Egelberg J. Treatment of peri-implant infections: a literature review. J Clin Periodontol 2003 Jun;30(6):467-85. 5. Meisel P, Kocher T. Photodynamic therapy for periodontal diseases: state of the art. J Photochem Photobiol B 2005 May 13;79(2):159-70. 6. Parker S. Low-level laser use in dentistry. Br Dent J. 2007 Feb 10;202(3):131-8. 7. Theodoro LH, Garcia VG. Lasers em Implantodontia. J Bras Clin Odontol Int 2001;Nov-Dez:5(30):520-9. 8. Konopka K, Goslinski T. Photodynamic therapy in dentistry. J Dent Res 2007 Aug;86(8):694-707. Review. Erratum in: J Dent Res 2007 Nov;86(11):1126. 9. Yamada AM, Hayek RRA, Ribeiro MS. O emprego da terapia fotodinâmica (PDT) na redução bacteriana em Periodontia e Implantodontia. RGO 2004 Jul-Set;52(3):207-10. 10. Almeida JM, Garcia VG, Theodoro LH, Bosco AF, Nagata MJH, Macarini VM. Terapia fotodinâmica: uma opção na terapia periodontal. Arquivos em Odontologia. 2006 Jul-Set;42(3):199-210. 11. Zanin ICJ, Brugnera Jr A. Terapia fotodinâmica no tratamento da doença periodontal. Revista PerioNews 2007;1(1):79-85. 12. Garcia VG, Theodoro LH, Almeida JM. Considerações atuais dos lasers no tratamento periodontal. Revista PerioNews 2007;1(1):52-8. 13. Haas R, Baron M, Dörtbudak O, Watzek G. Lethal photosensitization, autogenous bone, and e-ptfe membrane for the treatment of periimplantitis: preliminary results. Int J Oral Maxillofac Implants 2000 May-Jun;15(3):374-82. 14. Shibli JA, Martins MC, Ribeiro FS, Garcia VG, Nociti FH Jr, Marcantonio E Jr. Lethal photosensitization and guided bone regeneration in treatment of peri-implantitis: an experimental study in dogs. Clin Oral Implants Res 2006 Jun;17(3):273-81. 15. Dörtbudak O, Haas R, Bernhart T, Mailath-Pokorny G. Lethal photosensitization for decontamination of implant surfaces in the treatment of peri-implantitis. Clin Oral Implants Res. 2001 Apr;12(2):104-8. 16. Strauss RA, Fallon SD. Lasers in contemporary oral and maxillofacial surgery. Dent Clin North Am 2004 Oct;48(4):861-88. 17. Heuer W, Elter C, Demling A, Neumann A, Suerbaum S, Hannig M et al. Analysis of early biofilm formation on oral implants in man. J Oral Rehabil. 2007 May;34(5):377-82. 18. Bertolini G, Rossi F, Valduga G, Jori G, Ali H, van Lier J. Photosensitizing activity of water and lipid soluble phtalocyanines on prokaryotes and eukaryotic microbial cells. Microbios 1992;71:33-46. 19. Malik Z, Ladan H, Nitzan Y, Ehrenberg B. The bactericidal activity of a deuteroporphyrin-hemin mixture on gram-positive bacteria. A microbiological and spectroscopic study. J Photochem Photobiol B 1990 Aug;6(4):419-30. 20. Dobson J, Wilson M. Sensitization of oral bacteria in biofilms to killing by light from a low-power laser. Arch Oral Biol 1992 Nov;37(11):883-7. 21. Nitzan Y, Gutterman M, Malik Z, Ehrenberg B. Inactivation of gramnegative bacteria by photosensitized porphyrins. Photochem Photobiol 1992 Jan;55(1):89-96. 22. Merchat M, Bertolini G, Giacomini P, Villanueva A, Jori G. Mesosubstituted cationic porphyrins as efficient photosensitizers of grampositive and gram-negative bacteria. J Photochem Photobiol B 1996 Feb;32(3):153-7. 23. Usacheva MN, Teichert MC, Biel MA. Comparison of the methylene blue and toluidine blue photobactericidal efficacy against gram-positive and gram-negative microorganisms. Lasers Surg Med 2001;29(2):165-73. 24. Prates RA, Yamada AM Jr, Suzuki LC, Eiko Hashimoto MC, Cai S, Gouw- Soares S, Gomes L, Ribeiro MS. Bactericidal effect of malachite green and red laser on Actinobacillus actinomycetemcomitans. J Photochem Photobiol B 2007 Jan 3;86(1):70-6. 25. Yilmaz S, Kuru B, Kuru L, Noyan U, Argun D, Kadir T. Effect of gallium arsenide diode laser on human periodontal disease: a microbiological and clinical study. Lasers Surg Med 2002;30(1):60-6. 26. Chan Y, Lai CH. Bactericidal effects of different laser wavelengths on periodontopathic germs in photodynamic therapy. Lasers Med Sci 2003;18(1):51-5. 27. Gad F, Zahra T, Hasan T, Hamblin MR. Effects of growth phase and extracellular slime on photodynamic inactivation of gram-positive pathogenic bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2004 Jun;48(6):2173-8. 28. Matevski D, Weersink R, Tenenbaum HC, Wilson B, Ellen RP, Lépine G. Lethal photosensitization of periodontal pathogens by a red-filtered Xenon lamp in vitro. J Periodont Res 2003; 38(4):428 35. 29. Deppe H, Horch HH. Laser applications in oral surgery and implant dentistry. Lasers Med Sci 2007 Dec;22(4):217-21. 30. Martin E. Lasers in dental implantology. Dent Clin North Am 2004 Oct;48(4):999-1015. 405