AVALIAÇÃO DO EFEITO MUTAGÊNICO DA SOLUÇÃO AQUOSA DE Hymenea coubaril L. COM USO DOS BIOTESTES Allium cepa E Lactuca sativa

AVALIAÇÃO DO EFEITO MUTAGÊNICO DA SOLUÇÃO AQUOSA DE Hymenea coubaril L. COM USO DOS BIOTESTES Allium cepa E Lactuca sativa Joice Diniz Solano¹, Jaqueline Aparecida Gonçalves Soares 2, Nayara Magagnin Borges 2,, Deizimary Stella de Araújo 2 ; Isane Vera Karsburg 3 1. Engenheira florestal formada pela UNEMAT Campus Alta Floresta MT. 2.Mestrandas do Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas da Universidade do Estado de Mato Grosso (jacque_s.goncalves@hotmail.com) 3. Doutora em Genética e Melhoramento Vegetal. Professora do Laboratório de Citogenética e Cultura de Tecidos Vegetais. Departamento de Ciências Biológicas. Universidade do Estado de Mato Grosso. 78.580-000. Alta Floresta, MT Brasil. Recebido em: 31/03/2015 Aprovado em: 15/05/2015 Publicado em: 01/06/2015 RESUMO O potencial fitocitotóxico de Lactuca sativa e Allium cepa (alface e cebola) utilizadas como biotestes foi avaliado por meio dos efeitos dos extratos aquosos de Hymenea courbaril L (Jatobá). O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial mutagênico das diferentes soluções de H. Coubaril por meio dos bioindicadores Allium cepa e Lactuca sativa. Os extrato aquosos foram obtidos pelo método de infusão da casca de jatobá, nas concentrações de 35 gl 1, 65 gl 1, 130gL 1 e água fervente para obtenção do extrato por 15 minutos. Para a determinação da citotoxicidade, pelo índice mitótico (IM), foram contadas, pela técnica de varredura, 2000 células/concentração/bioteste. Os tratamentos foram dispostos no Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC) com três tratamentos e 10 repetições para cada tratamento. Alterações no ciclo celular e na estrutura cromossômica foram observadas após tratamento. As alterações citogenéticas encontradas foram pontes, cromossomos isolados, e morte celular. As sementes das duas espécies são ótimos organismos para biotestes, pois as mesmas são sensíveis as alterações externas. PALAVRAS- CHAVE: Bioindicador vegetal, cromossomos, planta medicinal. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 314 2015

EVALUATING THE MUTAGENIC EFFECT OF SOLUTION OF WATER Hymenea coubaril L. WITH USE OF BIOASSAYS STRAIN Allium cepa And Lactuca sativa. ABSTRACT The fitocitotoxic potential Lactuca sativa and Allium cepa (lettuce and onions), used in bioassays was assessed by the effects of aqueous extracts of Hymenea courbaril L (Jatoba). The objective of this study was to evaluate the mutagenic potential of different H. Coubaril solutions through biomarkers Allium cepa and Lactuca sativa. The aqueous extracts were obtained by the infusion method jatobá shell at concentrations of 35 g L -1, 65 g L -1, 130 g L -1 boiling water and for obtaining the extract for 15 min. For the determination of cytotoxicity, the mitotic index (MI) were counted by scanning technique, 2,000 cells / concentration / bioassay. The treatments were arranged in completely randomized design (CRD) with three treatments and 10 repetitions for each treatment. Changes in cell cycle and chromosome structure were observed after treatment. Cytogenetic abnormalities were bridges, isolated chromosomes, and cell death. The seeds of both species are great bodies for bioassays, because these external changes are sensitive. KEYWORDS: Vegetable bioindicator, chromosomes, herbalism. INTRODUÇÃO Os organismos vivos estão frequentemente expostos a agentes ambientais podendo causar lesões no material genético e potencialmente gerando tumores em seres humanos, esses agentes são normalmente conhecidos como genotóxicos (COSTA & WENK 2000). A citotoxicidade e a genotoxicidade é o estudo de substâncias com alterações que acontecem no processo de divisão celular causandoincidência de mutações cromossômicas produzindo efeito tóxico (SOUZA et al., 2005; DIAS, 2014; FREITAS, 2014). São usadas várias plantas em preparação fitoterápicas sendo necessários aumentar o controle de qualidade para emprego destas plantas, pois na bibliografia científica indica que muitas destas plantas utilizadas em nosso dia a dia podem apresentar substâncias maléficas que possuem composição química alterável que podem ser nocivos a saúde (FRESCURA, 2012). Hymenaea courbaril L.é conhecida no Brasil como jatobá (LOUREIRO et al., 1979; LORENZI, 2008). Pertencente à família Caesalpiniaceae (Caesalpinioideae, Leguminosae) ocorre em quase todas as regiões do Brasil (ESCOBAR, 2014). A maioria das espécies desse gênero possui algum valor econômico; além de possuir variados usos na medicina popular (FERREIRA & SAMPAIO, 1999; VERAS et al., 2010). Sendo a casca usada para fazer chá contra gripe, bronquite, cistite, catarro no peito, diarréia, vermes, fraqueza, cólicas, infecções na bexiga, auxilia na digestão e no tratamento de câncer de próstata (MARINHO et al 2010). A cebola (Allium cepa L.), detém o terceiro lugar entre as hortaliças de maior expressão econômica no Brasilpertencenteàfamília das Alliaceae. Acredita-se que o consumo de cebola auxilia na prevenção de algumas doenças (EMBRAPA, 2004) (RODRIGUES et al., 2010). A espécie Lactuca sativa (alface) pertence à família Asteraceae, apresentam sensibilidade às condições do ambiente, podendo ocorrer problemas na germinação e emergência. Estas possuem também diversas propriedades medicinais, tais como: antiácida, anti-reumática, calmante do estômago e do sistema nervoso (SILVEIRA, 2014; TEIXEIRA,2014). ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 315 2015

Segundo GADANO et al., 2002 as muitas plantas são úteis de forma medicinal, porem é necessário a realizar mais trabalhos que incluam a toxicidade com o índice mitótico para indicar a desenvolvimento apropriado de células, usando o Allium cepa como para medir este índice ( TEIXEIRA, 2014). O procedimento da anormalidade cromossômica em raízes de Allium cepa é regularizado pelo Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, WHO) e o Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP) que possui um processo eficiente avaliação para diagnóstico e monitoramento in situ da genotoxicidade de substâncias ambientais (CABRERA, 1999; PATUSSI, 2013). Para possibilitar a avaliação dos efeitos que agentes mutagênicos podem causar, faz-se necessário que a amostra esteja em constante divisão mitótica, o que possibilita identificar os efeitos tóxicos e alterações ocorridas ao longo de um ciclo celular, e o AlliumTest tem sido amplamente empregado com esse propósito STURBELLE,2010). O índice mitótico e índice de replicação são usados como indicadores de proliferação adequada das células (GADANO et al., 2002; TEDESCO, 2012). São necessários mais estudos relacionados à utilização de plantas para a tratamento de doenças levando em conta seus efeitos fisiológicos, genotóxicos e mutagênicos no organismo humano (VIEIRA, 2009; FIGUEIREDO, 2014). Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilidade de biotestes pelas sementes de alface (Lactuca sativa L.) e de cebola (Allium cepa L.), no monitoramento do efeito fitocitotóxico da espécie medicinal Hymenaea courbaril pelo índice mitótico (IM). MATERIAL E METODOS O material necessário para a execução deste trabalho foi disponibilizado pelo Laboratório de Citogenética e Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade do Estado de Mato Grosso UNEMAT. Para a realização do trabalho foram utilizadas três espécies de plantas: Hymenaea courbaril L. (Jatobá), Allium cepa (Cebola) e Lactuca sativa (Alface). Para a obtenção do extrato bruto aquoso (EBA), utilizou-se a casca de Jatobá. Foram realizadas três concentrações diferentes com a casca do jatobá que foram os seguintes: 35 g L 1, 65 g L 1 e 130 g L 1, estes foram preparado por meio de infusão por um período de 15 minutos. Apos o processo de infusão as soluções foram esfriadas e distribuídas nos diferentes tratamentos utilizando os bioindicadores Allium cepa e Lactuca sativa. Os organismos testes utilizados foram sementes de cebola e alface. Os bioensaios foram realizados sob temperatura controlada de 20 C, para ambas as espécies, seguindo as Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992). As sementes de alface e cebola foram acondicionadas em caixas gerbox (11 x 11 cm) forradas com papel germitest umedecido com 10mL dos extratos e água destilada utilizada como controle negativo. Foram utilizadas quatro repetições de 100 sementes, para cada concentração dos extratos e do controle, em delineamento estatístico inteiramente casualizado. As sementes permaneceram em contato com as soluções durante sete dias. Para a análise dos Biotestes foram usadas as quatro variáveis: índice de velocidade de germinação (IVG), com contagens diárias até o sétimo dia, para a alface, e décimo segundo dia, para a cebola, teste de primeira contagem aos quatro ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 316 2015

e seis dias, e teste de germinação, aos sete e doze dias para a alface e o índice mitótico (IM). A determinação do índice mitótico (IM) foi empregada a técnica de esmagamento (GUERRA e SOUZA, 2002). Foram coletadas as radículas dos organismos testes e fixadas em metanol:acido acético (3:1) (por um período de 24 h à temperatura de 4 C, após, foram acondicionadas em freezer. A preparação do material, para posterior análise do IM, foi realizada na seguinte ordem: água destilada por 5 minutos; HCl 0,5% por 5 minutos à temperatura 24 o C; água destilada por 5 minutos. Após, as radículas foram transferidas para lâmina onde foi retirada a coifa para a obtenção do meristema apical, adicionada orceína acética 2%, colocada uma lamínula sobre o material esmagado. As lâminas das células de alface e de cebola foram observadas em microscópio óptico. Foram contadas, através da técnica de varredura, 2000 células por concentração para cada bioteste. O índice mitótico foi obtido dividindo-se o número de células em mitose (prófase + metáfase + anáfase + telófase) pelo número total de células (interfase + mitose) multiplicando-se por 100 (OLIVEIRA et al., 1996; PIRES et al., 2001). As imagens (anomalias) de interesse foram fotografadas com o uso de objetiva de 100X de um microscópio fotômico binocular (Leica ICC 50) acoplado a um computador e no software LAZ EZ V1. 7.0. As médias de células normais e anormais foram submetidas à análise de variância e, para as causas de variações significativas, foi utilizado o teste de Skott Knott ao nível de 5% de probabilidade para comparação das médias conforme FERREIRA (2003). O delineamento experimental foi completamente casualizado, com quatro repetições, em esquema fatorial 2 x 3, sendo os fatores Bioteste (Alface e Cebola) e Concentração (35 g L 1, 65 g L 1, 130 g L 1 ). A unidade experimental se consistiu de uma caixa gerbox com 100 sementes, foram observadas 200 células por laminas sendo dez por tratamento, para a variável IM. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nas células provenientes da germinação de Allium cepa nos extratos aquosos de H. coubaril, foram encontradas irregularidades no processo de divisão celular nas diferentes fases nas diferentes concentrações. Nas fases de prófase (Figura 1-A) e metáfase (Figura 1 D) foram visualizadas aleatóriamente células com cromossomos isolados. Nos estágios de anáfase (Figura 1 F) e telófase (Figura 1-H) foram encontrados nos três tratamentos a formação de pontes e cromossomos isolados. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 317 2015

FIGURA 1 - Diferentes fases mitóticas de Allium cepa obtidas da ação das diferentes concentrações do extrato de Hymenaea coubaril. A) Prófase normal; B) Prófase com cromossomo isolado; C) Metáfase normal; D) Metáfase com cromossomos isolados; E) Anáfase normal; F) Anáfase com pontes; G) Telófase normal; H) Telófase com ponte e cromossomo fora da placa. Barra = 10 µm. Em todos os estágios celulares e diferentes tratamentos ocorreram diferenças significativas a 5% de probabilidade. Sendo que o maior número de células em prófase foi com o tratamento de 35 g L 1 (1710 células), havendo um aumento no número de células neste estágio. Porém para as fases de metáfase e anáfase foi observado maior quantidade de células no tratamento controle, este efeito pode estar relacionado aos componentes de H. coubaril que inicialmente tem um efeito de estimulação e posteriormente de inibidor dependendo da concentração de seu extrato aquoso (Tabela 1). Assim na fase de telófase foi visualizado o maior número de células entre os tratamentos na concentração de 65 g L 1, que teve efeito de estimulante no processo de divisão (Tabela 2). ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 318 2015

Observou-se em células de Lactuca sativa a presença de alterações cromossômicas, como cromossomos isolados (Figuras 2 B e 2-D) quebras cromatídicas, pontes telofásicas (Figura 2 F e H) e morte celular (Figura 2 I). Os critérios utilizados para aceitar a presença das alterações cromossômicas observadas, estão de acordo com PICKER e FOX (1986) que descreve que; as quebras cromatídicas equivalentes a perda de cromátides do cromossomo ou por fragmentação que ocorrem nas cromátides durante a divisão celular; e a não disjunção dos cromossomos no final da metáfase, formando estruturas denominadas de pontes telofásicas, alterações essas observadas no início ou final de telófase, ainda, o fuso acromático desestabilizado podendo provocar perda de cromossomos inteiros durante o processo de divisão celular e morte celular. Da mesma forma que em A. cepa, as células de L. sativa apresentaram maior número de irregularidades nos estágios de anáfase e telófase (Figura 2), ocorrendo ainda a morte celular, atividade que compromete o desenvolvimento dos meristemas radiculares e a planta em um geral. Segundo CUCHIARA (2012) à medida que são elevados os níveis de concentração de extratos de plantas que sejam ricos em substancias tóxicas bem como alcalóides, taninos a tendência é de reduzir o número de células em divisão, aumentando as chances de morte celular A B C D E F G H I FIGURA 2 - Diferentes fases mitóticas de Lactuva sativa obtidas da ação das diferentes concentrações do extrato de Hymenaea coubaril. A) Prófase normal; B) Prófase com cromossomo isolado; C) Metáfase normal; D) Metáfase com cromossomos isolados; E) Anáfase normal; F) Telófase com ponte na porção mediana; G) Telófase normal; H) Telófase com ponte distal; I) Célula com morte celular. Barra = 10 µm. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 319 2015

A exposição das sementes de A. cepa durante 5 dias as concentrações de 35 g L 1, 65 g L 1, 130 g L 1 e controle positivo (Tabela 1), foi verificado que a menor concentração teve o maior número de sementes germinadas, isto pode estar associado ao efeito alelopático sendo qualquer efeito direto ou indireto danoso ou benéfico que uma planta exerce sobre outra pela produção de compostos químicos liberados no ambiente. TABELA 1- Índice Mitótico de Allium cepa obtido por diferentes concentrações de extrato de Hymenaea coubaril. Tratamento Células N. Células A. Índice Mitótico (%) C. Positivo 2000 0 32,00 a* 35 g L 1 1960 40 33,51 a 65 g L 1 1960 40 29,00 a 130 g L 1 1840 160 29,44 a CV (%)** 1,35 T. de Células Normais; T. de Células Anormais; C. Positivo; Controle Positivo. *Letras diferentes na coluna ocorreram diferenças significativas a 0,05% pelo Skott Knott. ** Coeficiente de variação Estudos dos extratos e frações de Gleichenella pectinata indicaram a ação alelopática desse vegetal sobre diferentes espécies, como Lactuca sativa e Clidemia hirta (BORELA, 2010). Em estudos semelhantes BRADOW & CONNIC (1987) observaram estímulo na germinação de A. cepa pelos extratos da parte aérea e raiz de Amaranthus palmeri; entretanto, o extrato da parte aérea causouinibição na germinação da própria espécie e não afetou a germinação de Daucus carota, mostrando que os aleloquímicos atuam por diferentes mecanismos. Nas sementes de L. sativa o maior índice de germinação no segundo dia após a exposição nos diferentes extratos de H. coubaril, sendo na concentração de 65 g (Tabela 2). Segundo GOETZE (2012), frequentemente, o efeito alelopático não se dá sobre o percentual final de germinação, mas sobre a velocidade de germinação ou sobre outro parâmetro do processo. TABELA 2- Índice Mitótico de Lactuva sativa obtido por diferentes concentrações de extrato de Hymenaea coubaril. Tratamento T. Células N. T. Células A. Índice Mitótico (%) C. Positivo 2000 0 27,80ab* 35 g L 1 2000 0 28,60ab 65 g L 1 1910 90 31,89a 130 g L 1 1950 50 33,34a CV (%)** 1,59 T. de Células Normais; T. de Células Anormais; C. Positivo; Controle Positivo. *Letras diferentes na coluna ocorreram diferenças significativas a 0,05% pelo Skott Knott. ** Coeficiente de variação Segundo GOETZE (2012), verificaram efeito semelhante de extratos extraídos do óleo essencial de Pilocarpus microphyllus Stapf. ex. Ward. (jaborandi), onde as concentrações analisadas estimularam o desenvolvimento de sementes de alface, ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 320 2015

sobre sementes da mesma espécie na avaliação do possível efeito citotóxico e genotóxico de Rosmarinus officinalis L. (alecrim) (AZEREDO (2011). O indíce mitótico, percentual de células que se encontravam em uma das quatro fases da mitose, variou entre 27,80% e 33.34 nos tratamentos analisados. Enquanto o controle positivo teve 100% das células analisadas estavam em plena divisão mitótica. O índice de divisão mitótica apresentou diferença entre os tratamentos, o que pode indicar uma distinta ação fisiológica de cada um dos extratos aplicados à cebola e da alface. CONCLUSÃO Ambas as espécies utilizadas como bioindicadores observou-se irregularidades nos estágios da mitose. O índice mitótico diferiu significativamente entre o controle positivo para bioincador Lactuca sativa. A espécie H. coubaril, pode ser considerada genotóxica, pois apresentou irregularidades no processo de divisão celular nas diferentes fases nas diferentes concentrações. REFERÊNCIAS AZERÊDO, G.A. Potencial de aplicação dos óleos essenciais de orégano (Origanum vulgare L.) e alecrim (Rosmarinus officinalis L.) como sanitizantes naturais em hortaliças minimamente processadas. (Tese de doutorado em nutrição pelo Programa de Pós- Graduação em Nutrição do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco. 132p. 2011. BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para análise de sementes. Brasília: SNDA/DNDV/CLAV, 1992. BRADOW, J.M.; CONNICK JR., W.J.Allelochemicals from palmer amaranth, Amaranthu palmeri S. Wats. Journal of Chemical Ecology 13:185-202.1987. BORELLA, J; TUR, C. M; PASTORINI, L.H. Alelopatia de extratos aquosos de Duranta repens sobre a germinação e o crescimento inicial de Lactuca sativa e Lycopersicum esculentum.biotemas, v. 23, n. 2, p. 13-22, 2010. CABRERA G.L, RODRIGUEZ D.M.G. Genotoxicity of soil from farmland irrigated with wastewater using three plant bioassays. Mutat Res-Fund Mol 426: 211-21.1999. COSTA R.M.A, MENK C.F.M. 2000. Biomonitoramento de mutagênese ambiental. Biotecnologia: ciência e desenvolvimento 3: 24-26. CUCHIARA, C C; BORGES, C S; BOBROWSKI, V L. Sistema teste de Allium cepa como bioindicador da citogenotoxicidade de cursos d'água. Tecnologia. Ciência Agropecuaria. João Pessoa, v.6, n.1, p.33-38, mar. 2012. DIAS, M. G. et al. Efeito genotóxico e antiproliferativo de Mikania cordifolia (LF) Willd.(Asteraceae) sobre o ciclo celular de Allium cepa L. Revista brasileira plantas medicinais, v. 16, n. 2, p. 202-208, 2014. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.11 n.21; p. 321 2015

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