Atualização das metodologias de detecção de resistência. Brasília Agosto/2011 carmen.oplustil@formatoclinico.com.br www.formatoclinico.com.br
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Como podemos fazer o testes de sensibilidade aos antibióticos?
Métodos disponíveis para realizar o Antibiograma Método da difusão Diluição em caldo micro e macrodiluição Diluição em ágar Etest, M.I.C.E - MIC Métodos automatizados Métodos Moleculares CPAZ/2010
MIC Concentração inibitória mínima CIM 1:32 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:8 37ºC 1:4 1:16 CBM 1:16 24h 1:2 1:32
Equipamentos disponíveis Equipamentos para inocular painéis de microdiluição Equipamentos para leitura do antibiograma - leitores Equipamentos para realizar o testes automação Equipamentos para detecção de resistência - molecular
Equipamentos Manuais disponíveis Métodos manuais e semi-automatizados para testes de sensibilidade aos antibióticos Tipo Características Fabricante Sistema Disco difusão Semiautomatizado Auxilia na leitura, registro e interpretação dos halos de difusão, software com sistema expert e relatórios epidemiológicos Giles Scientific i2a Oxoid Mast Bio-Rad BIOMIC V3 SIRSCAN Aura Image Mastacan Elite Osiris Microdiluição manual Aparelho para auxiliar a interpretação visual, registro e liberação Siemens Trek Diagnostics MicroScan Data management(labpro) Sensititre Vizion Microdiluição semiautomatizada Equipamento faz a leitura e libera o resultado após incubação em estufa do painel ou Strip Siemens Trek Diagnostics BioMerieux Microscan AutoSCAN-4 Sensitire AutoReader Mini API Susceptibility Testing Instrumentation for Data Analysis. In: Manual of Clinical. Microbiologia 10ed. 2010
Equipamentos automatizados disponíveis
Documentos padronizados para leitura do antibiograma CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute NCCLS National Committee for Clinical laboratory Standards M100-S11, 2011 Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados.
Grupos de Antibióticos www.formatoclinico.com.br
Mecanismos de Ação dos Antimicrobianos Interferência na síntese da parede celular Inibição da síntese de proteínas Interferência na síntese de DNA Inibição de via metabólica CPAZ/2010
Principais grupos de antibióticos ticos e seus mecanismos de açãoa Beta-lactâmicos: o principal mecanismo de ação é o de inibição da parede celular. Penicilinas (Ex: Penicilina, Ampicilina, Amoxicilina, Ticarcilina Carbenicilina, Mezlocilina, Piperacilina). Penicilinas/Inibidores de b- lactamase ( Ex: Amoxicilina/ ácido calvulânico, Ampicilina/sulbactam, Piperacilina/tazobactam, Ticarcilina/ácido clavulânico). Cefalosporinas Ex: 1 a geração: cefalotina, cefazolina 2 a geração: cefuroxima, Cefamicinas: cefoxitina cefaclor 3 a geração: ceftriaxona, cefotaxima, ceftazidima 4 a geração: cefepima CPAZ/CMZ/20053
Carbapenens (Ex: imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem). Monobactams (Ex:aztreonam). Glicopeptídeos: inibem a síntese da parede celular em um sítio diferente dos b-lactâmicos. Ex: Vancomicina, Teicoplanina. Aminoglicosídeos: inibem a síntese de proteínas - ribossomo. Ex: amicacina, gentamicina, tobramicina, netilmicina, kanamicina, estreptomicina. Macrolídeos: inibem a síntese de proteínas - ribossomo. Ex: azitromicina, eritromicina, claritromicina. Cetolideo: síntese protéica ex: telitromicina. Tetraciclinas: inibem a síntese de proteínas - ribossomo. Ex: tetraciclina, doxiciclina, minociclina. CPAZ/CMZ/2005
Quinolonas e fluoroquinolonas: inibem a atividade da DNA-girase. Ex: ciprofloxacina, ofloxacina, pefloxacina, norfloxacina, levofloxacina, ácido nalidíxico, gatifloxacina. Sulfonamidas e trimetoprima: inibem o metabolismo do folato. Ex: sulfam+trimetop. Cloranfenicol, clindamicina, rifampicina: inibem a síntese protéica. Nitrofurantoina: inibem síntese de proteínas e a fusão do ribossomo. Oxazolidinonas: síntese protéica. Ex: linezolida. Estreptogramina: síntese protéica. Ex: quinupridalfopristin. CPAZ/CMZ/2005
Resistência bacteriana (como a bactéria se defende) Mecanismos genéticos Mutação de genes celulares alteração do sitio alvo Aquisição de genes de resistência plasmideos, transposons, integrons Mutação de genes adquiridos Mecanismos bioquímicos Modificação do antibiótico por produção de enzimas como, beta-lactamases, acetiltransferases Modificação do sitio alvo modificação das PBP s afetam beta-lactâmicos Restringir acesso ao alvo diminuição do número de porinas (impermeabilidade) Efluxo bombas que removem o antibiótico da célula bacteriana
Resistência bacteriana Bacilos Gram negativos Beta-lactamicos - ESBL Carbapenens MBL, KPC Cefamicinas - AmpC Resistência a quinolonas Resistência a aminoglicosideos Cocos Gram positivos beta-lactâmicos (MRSA) glicopeptideos (GISA/VISA, VRSA, VRE) HLR-A em Enterococos Resistência a macrolideos e clindamicina em estafilococos Quinolonas Penicilina - pneumococo
Definição de beta-lactamase É uma enzima produzida por alguns gram-positivos e alguns gram-negativos que hidrolizam (quebram) antibióticos betalactâmicos 18
MODO DE AÇÃO DOS BETA-LACTÂMICOS EM GRAM NEGATIVOS SENSÍVEL RESISTENTE β-lactam Antibiotic Diffusion through Porin Blocks Entry Outer Membrane Efflux Pump Diffusion through Beta-Lactamase Peptidoglycan Hydolyzes Beta-Lactam Penicillin Binding Proteins Changes in PBP results in Failure to Bind to β-lactam Cell Death Paul C. Schreckenberger, Ph.D., D(ABMM)
Parede do Gram-negativo Efflux system Porin channels B-lactamases PBPs Adapted from Livermore and Woodford, Trends in Microbiol, 2006. Paul C. Schreckenberger, Ph.D., D(ABMM) 20
ESBL Penicillins Cephalosporins Cephamycins Carbapenems Monobactams Benzylpenicillin Methicillin Ampicillin Carbenicillin Mezlocillin Ticarcillin Cephalothin 1 st Cefamandole 2 nd Cefuroxime 2 nd Cefotaxime 3 rd Ceftazidime 3 rd Ceftriaxone 3 rd Cefepime 4 th Cefoxitin Cefotetan Cefmetazole Imipenem Meropenem Ertapenem Doripenem ESBLs hydrolyze all Penicillins Cephalosporins Monobactams Aztreonam Paul C. Schreckenberger, Ph.D., D(ABMM)
ESBLs Extended-spectrum β-lactamases Primariamente encontrado em: Klebsiella, E. coli Também em: Proteus, Serratia Enterobacter, Salmonella Morganella, etc. A maioria são inibidos por ácido calvulânico e tazobactam (menos por sulbactam)
ESBL Tipos de ESBL TEM-3,4 CTX-M-1,2 SHV-2,3 OXA-2,10 CTX-M Mais frequente Tem MIC alto para CTX Tem MIC baixo para CAZ (não é bom para detectar ESBL) Comum no Brasil Em geral Cefepime tem MIC 64
O que fazemos com ESBL agora? CLSI Ao utilizar os novos pontos de corte não é necessário fazer mais o teste confirmatório de ESBL e não há necessidade de modificar o resultados das cefalosporinas, aztreonam de sensível para resistente. O teste confirmatório de ESBL pode ser utilizado para fins epidemiológicos EUCAST o teste para confirmar ESBL deve ser feito para fins epidemiológicos. Liberar o resultado conforme lido sem alterar os resulatdos. ANVISA não tem nenhuma norma
Testes de triagem e confirmatórios para ESBL Triagem : Critérios interpretativos Confirmatórios: Disco combinado (CTX+ clavulânico) Disco aproximação Etest um lado CTX outro lado CTX+ácido clavulânico Sistemas automatizados
Critérios interpretativos Agent CLSI M100-S19 (2009) CLSI M100-S21 (2011) Susc (mm) Int Res Susc Int Res Cefazolin 8 ( 18) 16 32 ( 14) 2 ( 23) 4 8 ( 19) Cefotaxime 8 ( 23) 16-32 64( 14) 1( 26) 2 4( 22) Ceftizoxime 8 ( 20) 16-32 64( 14) 1( 25) 2 4 ( 21) Ceftriaxone 8 ( 21) 16-32 64( 13) 1( 23) 2 4( 19) Ceftazidime 8 ( 18) 16 32( 14) 4( 21) 8 16 ( 17) Aztreonam 8 ( 22) 16 32( 15) 4( 21) 8 16 ( 17)
Testes confirmatórios para ESBL Confirmatórios: Disco combinado (CTX+ clavulânico) Disco aproximação Etest um lado CTX outro lado CTX+ácido clavulânico Sistemas automatizados
E-test fita combinada Relação CIM CAZ/CAZ-CLAV CLAV 8 CPAZ/2005
O que fazemos com ESBL agora?
Falhas no tratamento de infecções causadas por cepas de K.pneumoniae produtora de ESBL D. Paterson et al. JCM 2011, 39:22-6-2212 Isolados ESBL + reportados como sensíveis à cefalosporina utilizada para tratamento. Houve falha em 54% dos pacientes (15 de 28 pacientes) MIC FAILURE DEATH 8 100% (6/6) 33% (2/6) 4 67% (2/3) 0% (0/3) 2 33% (1/3) 0% (0/3) 1 27% (3/11) 18% (2/11)