Página 1 de 8 Scientific Electronic Library Online vol.56 no.1 SHOOT AND ROOT EVALUATIONS ON SEEDLINGS FROM C Bragantia ISSN 0006-8705 versão impressa Curriculum Lattes Bragantia v. 56 n. 1 Campinas 1997 Como citar este artigo ASPECTOS BIOLÓGICOS DO REDUZIDO NÚMERO DE SEMENTES DA TANGERINA 'SUNKI' ( 1 ) MARLI REZENDE TESSARINI DE CARVALHO( 2 ), RITA BORDIGNON( 2,4 ), ROSA MARIA LIZANA BALLVÉ( 2 ), CECÍLIA ALZIRA FERREIRA PINTO-MAGLIO( 3 ) e HERCULANO PENNA MEDINA FILHO( 2,5 ) RESUMO Estudaram-se as causas biológicas do reduzido número de sementes da tangerina 'Sunki' (Citrus sunki Hort. ex. Tan.), promissor porta-enxerto para a citricultura brasileira. As seguintes hipóteses foram investigadas: (1) existência de uma limitação na anatomia do fruto, decorrente do pequeno número de óvulos por ovário; (2) ocorrência de esterilidade gamética em função do desenvolvimento anormal do saco embrionário e/ou dos grãos de pólen; (3) presença de autoincompatibilidade. Realizaram-se cortes histológicos de ovários e de sacos embrionários, observações detalhadas de frutos e suas sementes, bem como polinizações com outras espécies e cultivares. Concluiu-se que apesar de a tangerina 'Sunki' produzir normalmente apenas duas a três sementes viáveis, possui potencial biológico para originar até dezessete sementes por fruto. A formação de gametas tanto masculinos como femininos é normal. Quanto ao reduzido número de sementes por fruto, pode-se explicá-lo em razão do acentuado grau de auto-incompatibilidade. Quando polinizada com espécies compatíveis, há um aumento significativo no número de sementes por fruto, cuja magnitude depende do polinizador específico utilizado. Em termos biológicos, é possível e praticamente exeqüível aumentar o número de sementes da tangerina `Sunki' por meio de polinizadores adequados, no entanto, esse aumento é acompanhado pelo maior número de plantas zigóticas e não de nucelares como seria de interesse comercial. Termos de indexação: Citrus sunki, auto-incompatibilidade, biologia da reprodução, número de sementes.
Página 2 de 8 ABSTRACT BIOLOGICAL ASPECTS OF THE REDUCED SEED NUMBER IN `SUNKI' MANDARIN The biological causes for the reduced number of seeds per fruit in the 'Sunki' mandarin (Citrus sunki Hort. ex Tan.), a promising citrus rootstock in Brazil, were studied. Three hypotheses were investigated: (1) existence of an anatomical limitation related to a reduced number of ovules in the ovary; (2) occurrence of sterility due to abnormal formation of the embryo sac and/or pollen grains; (3) self-incompatibility. Histological studies of the ovary, observations of fruits, seeds, and pollen grains as well as pollinations with other citrus species led to the conclusion that although 'Sunki' fruits usually bear only two or three viable seeds, they have however, a biological potential to produce up to 17 seeds. The formation and viability of male and female gametes are normal. The main reason for the reduced number of seeds is the self-incompatibility of this clone. When pollinated with other species, there is a significant increase in the number of seeds/fruit of a magnitude dependent on the pollen source. Therefore, it is possible to increase the number of seeds/fruit with adequate pollinators although this will result in substantial increase only in the number of zygotic plants and not in the nucellar ones as would be commercially desirable. Index terms: Citrus sunki, self-incompatibility, seed number, biology of reproduction. 1. INTRODUÇÃO Cerca de noventa por cento dos pomares de citros do Brasil são formados por mudas enxertadas sobre o limão-cravo 'Limeira' [Citrus limonia (L.) Osb.], condição que os torna, do ponto de vista genético, extremamente vulneráveis. De fato, a incidência do declínio nesses pomares é responsável pela perda de quase dez milhões de árvores por ano (Pompeu Júnior, 1990). Entre os porta-enxertos alternativos, tem-se destacado a tangerina 'Sunki' (C. sunki Hort. ex Tan.) em virtude de sua maior tolerância ou resistência ao declínio. Porém, sua maior utilização em escala comercial é limitada pela alta suscetibilidade à gomose de Phytophthora e pelo reduzido número de sementes por fruto: em geral, apenas três são produzidas. Sendo assim, o rendimento em termos de extração de sementes torna-se menor. Assim como outros porta-enxertos de citros, a tangerina 'Sunki' se reproduz por apomixia facultativa do tipo nucelar, possuindo sementes mono e poliembriônicas. Sua descendência constitui-se de uma mistura de plantas de origem zigótica e plantas nucelares, de origem apomítica. As nucelares são uniformes, sendo comercialmente utilizadas como portaenxertos, enquanto as zigóticas são, quando detectadas, descartadas. O presente trabalho objetivou avaliar as razões do baixo número de sementes por fruto da tangerina 'Sunki'; para tanto, investigaram-se as seguintes hipóteses: (a) existência de uma limitação na anatomia do fruto, decorrente do reduzido número de óvulos por ovário; (b) ocorrência de esterilidade gamética em função de anormalidades na formação dos gametas
Página 3 de 8 masculinos e/ou femininos; (c) presença de auto-incompatibilidade. 2. MATERIAL E MÉTODOS Determinou-se o número de segmentos por fruto e o de óvulos por segmento, dissecando-se os frutos, contando-se os segmentos, as sementes normais, abortadas e óvulos não desenvolvidos da tangerina 'Sunki'. Como controle, avaliaram-se os mesmos parâmetros em outros porta-enxertos de citros mantidos no Centro de Citricultura Sylvio Moreira do Instituto Agronômico, a saber: tangerina 'Sunki' (Citrus sunki Hort. ex Tan.) acessos # 200 e Tietê; limão-cravo 'Limeira' [C. limonia (L.) Osb.]; tangerina 'Cleópatra' (C. reshni Hort. ex Tan.); tangerina 'Sheekawasha' (C. depressa Hay.); citrange 'Troyer' [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x C. sinensis (L.) Osb.]; trifoliata 'Limeira' [P. trifoliata (L.) Raf.] e 'Rich 16-6'(P. trifoliata); laranja 'Caipira Comum' [C. sinensis (L.) Osb.]; tangelo 'Orlando' (C. reticulata var. austera Swing. x C. paradisi Macf.); limão 'Volkamerino'(C. Limon). Analisaram-se cinqüenta frutos de polinização aberta de cada variedade, além de igual número da 'Sunki Tietê' obtido por polinização controlada com 'Seekhawasha'. A viabilidade do pólen de flores recém-abertas da tangerina 'Sunki'foi primeiramente avaliada por meio de coloração em carmim acético. Examinaram-se cinco lâminas, observando-se três a cinco campos de cada uma, totalizando 3.000 grãos de pólen. Em um segundo momento, estimou-se tal viabilidade mediante germinação em solução aquosa de sacarose 5%, ph 7,0, em lâminas de vidro. A formação e o desenvolvimento do saco embrionário foram estudados por meio de cortes histológicos de ovários desidratados, previamente incluídos em parafina e seccionados transversal e longitudinalmente na espessura de 8 a 12 mm de acordo com Medina & Conagin (1964). Para investigar a hipótese de auto-incompatibilidade, a tangerina `Sunki # 200' foi autopolinizada e também polinizada com diferentes variedades (Quadro 1). Buscando-se conhecer a influência da polinização por abelhas no número de sementes, protegeram-se ramos com telas de náilon de malha retangular de 1 x 2 mm. Como controle, marcaram-se ramos de polinização aberta. Nas plântulas resultantes desses diversos tratamentos, determinou-se a porcentagem de plantas de origem nucelar e zigótica pelo uso de isoenzimas (Ballvé et al., 1991) e do marcador morfológico "asa do pecíolo da folha" (Ballvé et al., 1996). 56n1a2eq1.GIF (26809 bytes) 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O número de sementes viáveis adicionado ao de abortadas (inviáveis) e de óvulos não desenvolvidos observados nos frutos maduros (Figura 1) representa o número total de óvulos
Página 4 de 8 originalmente presentes no ovário e inseridos nos carpelos das flores. Esses carpelos estão representados nos frutos maduros pelos segmentos, lóculos ou gomos (Figura 2). 56n1a2ef1.GIF (47474 bytes) Figura 1. A: Número máximo de sementes normais por fruto da tangerina 'Sunki'; B (tangerina 'Sunki'), C (tangerina 'Cleópatra'), D (limão-cravo 'Limeira'), E (limão 'Volkameriano') e F (triofoliata 'Rich 16-6'): Sementes normais, abortadas e óvulos não desenvolvidos comumente originados em frutos de polinização aberta. 56n1a2ef2.GIF (23238 bytes) Figura 2. Tangerina 'Sunki'. A: Saco embrionário mostrando quatro dos oito núcleos, com desenvolvimento normal; B: corte transversal de ovário com oito carpelos, podendo-se observar, em vários deles, os dois óvulos de aspecto e desenvolvi-mento normais; C: grãos de pólen coloridos com carmim acético, mostrando alta viabilidade; D: grãos de pólen mostrando elevada taxa de germinação in vitro. Verificou-se que entre os porta-enxertos estudados, existe pouca diferença no número de segmentos por frutos (Quadro 2), o qual variou de 7, nos trifoliatas, a 12, na tangerina 'Cleópatra'. A tangerina 'Sunki' situou-se entre esses extremos, com 9 segmentos por fruto. 56n1a2eq2.GIF (29946 bytes) Com relação ao número médio de óvulos por segmento, verifica-se que variou de 1,9 (`Cleópatra' e 'Sheekawasha') a 7,9 (limão 'Volkameriano'). Em conseqüência, variou também o potencial biológico para produção de sementes calculado pela multiplicação do número médio de óvulos por segmento pelo número médio de segmentos por fruto. De acordo com esse parâmetro, a tangerina 'Sunki' apresenta potencial para produzir dezessete sementes por fruto. Esse potencial, comparado ao dos diversos porta-enxertos estudados, é baixo, no entanto não se pode considerá-lo como a causa principal do reduzido número de sementes normais. A tangerina 'Cleópatra', por exemplo, apresenta cerca de dezenove sementes normais por fruto, e seu potencial é de 23, não muito superior ao da 'Sunki'. Entretanto, na 'Cleópatra', 83% dos óvulos transformam-se em sementes viáveis nos frutos maduros, ao passo que na 'Sunki' apenas 16%. Da mesma forma, a tangerina `Sheekawasha' tem praticamente o mesmo número de segmentos por fruto e de óvulos por segmento e, por conseqüência, o mesmo potencial que a 'Sunki'. Produz, porém, doze sementes normais por fruto porque, à semelhança da 'Cleópatra', apresenta maior porcentagem de sementes normais por óvulo (Figura 1). Portanto, o reduzido número de sementes por fruto da tangerina `Sunki' não poderia ser explicado pelo seu potencial biológico.
Página 5 de 8 O limão 'Volkameriano' e os trifoliatas 'Rich 16-6' e 'Limeira', que produzem entre 24 a 28 sementes normais por fruto, possuem apenas sete a nove segmentos por fruto. Entretanto, em cada um desses segmentos existem seis a oito óvulos, dos quais 37 a 64% se desenvolvem em sementes normais no fruto maduro. O limão-cravo 'Limeira', porta-enxerto mais utilizado no Brasil, apresenta número intermediário tanto de segmentos, como de óvulos por segmento, e é também intermediário quanto ao potencial para produção de sementes e quanto à porcentagem de óvulos que se transformam em sementes normais (Figura 1, Quadro 2). Considerando-se as discussões acerca do potencial biológico e de sua realização em sementes normais, verifica-se que o reduzido número de sementes na tangerina 'Sunki' resulta, sobretudo, do pequeno número de óvulos que se transformam em sementes normais, por razões discutidas a seguir. A 'Sunki', polinizada pela tangerina 'Sheekawasha', produziu em média oito sementes normais por fruto, aumentando, de forma significativa, a porcentagem de sementes normais por óvulo. Tal fato pode ser explicado pela alta compatibilidade do pólen da 'Sheekawasha', quando nos estigmas da 'Sunki'. Por outro lado, a causa do reduzido número de sementes nos frutos oriundos ou de polinização aberta, ou de autopolinização encontra-se nos mecanismos de auto-incompatibilidade. Comparando-se os dois acessos de 'Sunki', Tietê e # 200 (Quadro 2), nota-se que ambos possuem essencialmente o mesmo número de segmentos por fruto, o mesmo número de óvulos por segmento e, por conseqüência, o mesmo potencial anatômico para produção de sementes, embora o acesso Tietê produza mais sementes. Quanto à porcentagem de sementes normais, abortadas e de óvulos não desenvolvidos por fruto dos diversos porta-enxertos estudados, verifica-se ampla variação (Quadro 2). A porcentagem de óvulos não desenvolvidos é aproximadamente igual ou maior que a de sementes abortadas, cujo índice, em geral, é relativamente alto. É interessante notar que as variedades com valores extremos quanto à porcentagem de sementes normais, ou seja, a 'Cleópatra' com 83% e o tangelo 'Orlando' com 8%, continuam a apresentar índices extremos, porém na ordem inversa, quanto à porcentagem de óvulos não desenvolvidos. Os dois acessos de 'Sunki' possuem porcentagens similares de sementes abortadas e óvulos não desenvolvidos. Polinizada pela 'Sheekawasha', observa-se que permanece praticamente inalterada a porcentagem de óvulos abortados. Entretanto, reduz-se sensivelmente a porcentagem de sementes abortadas, o que resulta no aumento da porcentagem de sementes normais. Aparentemente, esse aumento de sementes normais se dá a expensas de uma redução no número de sementes abortadas. Como essas sementes abortadas se transformam em sementes normais, híbridas, após a polinização com material compatível, é bastante plausível considerar que nas sementes oriundas de autopolinização a interrupção no desenvolvimento da semente após certo tempo se deva a uma incompatibilidade pós-zigótica com o colapso desses embriões. Os estudos de coloração de pólen revelaram que a tangerina 'Sunki' e os demais portaenxertos apresentam acima de 90% de grãos que se colorem com carmim acético. Além disso, observou-se que a germinação in vitro dos grãos de pólen da 'Sunki' é superior a 95% (Figura 2), indicando que os gametas masculinos dessa tangerina são normais e viáveis. A produção de híbridos nas polinizações controladas com os demais porta-enxertos sugere que seus grãos de pólen, à semelhança da 'Sunki', sejam também viáveis.
Página 6 de 8 O exame dos cortes histológicos, desde a formação da célula-mãe do megásporo até o desenvol- vimento completo (Figura 2), mostrou que a tangerina 'Sunki' apresenta um saco embrionário normal, com oito núcleos conforme descrito por Bacchi (1943). Ao compararem-se as lâminas do presente trabalho com as de Bacchi (1943) as quais são mantidas na Seção de Citologia do IAC, constatou-se equivalência perfeita. Tais cortes mostraram também a existência de oito lóculos por ovário e dois óvulos por lóculo (Figura 2), corroborando as observações em frutos maduros e o potencial de dezessete sementes por fruto. A auto-incompatibilidade foi estudada por meio de autopolinizações e polinizações da 'Sunki' por dez variedades. Os controles constituíram-se nos ramos de livre polinização. A influência das abelhas nas polinizações foi avaliada nos ramos protegidos com telas de náilon (Quadro 1). As variâncias do número médio de sementes por ramo de cada tratamento, mostrando-se homogêneas pelo teste de Bartllet (x 2 corrig = 13,4 N.S. para 10 GL), permitiram, após transformação dos dados em Ö x+0,5, a análise da variância e o teste bilateral de Dunnet para comparação entre os diversos tratamentos e o controle, caracterizado pela livre polinização. A tangerina 'Sunki' produziu, em média, 2,5 sementes normais por fruto em flores de livre polinização, autopolinizadas artificialmente ou mesmo protegidas das abelhas. Por outro lado, verificou-se aumento do número de sementes quando a 'Sunki' foi polinizada pela tangerina `Sheekawasha', passando de 2,5 para 8,4 sementes normais por fruto, em média. Entre os 190 frutos oriundos dessas polinizações, vários chegaram a exibir o potencial máximo de dezesseis a dezessete sementes por fruto. As polinizações menos efetivas para aumentar o número de sementes foram aquelas realizadas com as laranjas, sendo intermediários os tangores 'Murcote' e 'Cravo', apesar de este último ser normal- mente referido como uma tangerina. O grau de compatibilidade da tangerina 'Sunki' (maior com tangerina, menor com laranjas e intermediário com tangores) talvez esteja relacionado à proximidade filogenética. Concluindo, os resultados dessas polinizações mostram claramente que existe acentuada auto-incompatibilidade na tangerina 'Sunki', que passou de 2% de plantas zigóticas, quando autopolinizadas, para índices até de 77%, quando polinizadas com variedades compatíveis (Quadro 1). O número de sementes poderia ser bastante maior, caso a tangerina 'Sunki' fosse intercalada a variedades compatíveis e de florescimento coincidente. Entretanto, o número de plantas nucelares obtidas de tais sementes provavelmente não se modificaria, a julgar pelos resultados mostrados no quadro 1. Por exemplo, quando polinizada pela 'Sheekawasha', produz 8,4 sementes por fruto das quais, em média, apenas 2,6 plantas são nucelares, valor equivalente ao produzido pela polinização aberta. O mesmo ocorre em relação às demais variedades testadas. Investigações mais extensivas poderiam identificar clones específicos capazes de induzir um aumento no número de sementes e também no de plantas nucelares, as quais despertam interesse no que se refere à formação de mudas para os pomares comerciais. 4. CONCLUSÕES 1. O potencial máximo para a produção de sementes por fruto em citros corresponde ao número de óvulos por ovário da flor. Comparada a outros porta-enxertos comerciais, a
Página 7 de 8 tangerina `Sunki' apresenta baixo potencial. Se fosse, no entanto, inteiramente realizado, esse potencial poderia resultar em dezessete sementes por fruto. Dessas dezessete possíveis, em geral, apenas duas a três sementes são normais, uma vez que as restantes não se desenvolvem ou abortam. O reduzido número de sementes não é, portanto, devido a uma limitação anatômica do ovário dessa variedade. 2. A formação dos gametas masculinos é normal e a produção de pólen, abundante e de alta viabilidade. É também normal a formação do saco embrionário. Por conseguinte, tais fatores não são responsáveis pelo baixo número de sementes. 3. A principal causa do reduzido número de sementes por fruto na tangerina 'Sunki' deve-se a um acentuado grau de auto-incompatibilidade. Polinização com variedades compatíveis aumentam signi- ficativamente esse número, aproximando-o de seu potencial anatômico. Permanece, entretanto, inalterado o número de plantas nucelares por fruto. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Sr. Onivaldo Camargo, da Seção de Citologia do IAC, o apoio nas preparações histológicas e o fornecimento das lâminas originais de O. Bacchi, bem como ao Centro de Citricultura Sylvio Moreira o cultivo das plantas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BACCHI, O. Phytological observations in citrus. 3. Megasporogenesis, fertilization and, polyembriony. Botanical Gazette, Chicago, 105:221-225. 1943. BALLVÉ, R.M.L.; BORDIGNON, R.; MEDINA FILHO, H.P.; SIQUEIRA, W.J.; TEÓFILO SOBRINHO, J. & POMPEU Júnior, J. Isoenzimas na identificação precoce de híbridos e clones nucelares no melhoramento de citros. Bragantia, Campinas, 50(1):57-76, 1991. BALLVÉ, R.M.L.; MEDINA FILHO, H.P. & BORDIGNON, R. Identification of reciprocal hybrids in citrus by the broadness of leaf petiole wing. Brasilian Journal Genetic, Ribeirão Preto, 19(3):212, 1996. (Resumos) MEDINA, D.M. & CONAGIN, C.H.T.M. Técnicas citológicas. Campinas, Instituto Agronômico, 1964. 107p. (Publicação, 2610). POMPEU JÚNIOR. J. Situação do uso de porta-enxertos no Brasil. In: SEMINÁRIO INTERNACIONAL DE CITROS, 1., Bebedouro, 1990. Anais. Bebedouro, Estação Experimental de Citricultura. p.1-10. ( 1 ) Recebido para publicação em 17 de julho de 1996 e aceito em 14 de março de 1997. ( 2 ) Seção de Genética, Instituto Agronômico (IAC), Caixa Postal 28, 13001-970 Campinas (SP). ( 3 ) Seção de Citologia, IAC. ( 4 ) Com bolsa de pós-graduação da CAPES.
Página 8 de 8 ( 5 ) Com bolsa de produtividade científica do CNPq. 2004 Instituto Agronômico Avenida Barão de Itapura, 1481 13020-902 Campinas SP - Brazil Tel.: +55 19 3231-5422 - ramal 116 Fax: (55 19) 3231-5422 - ramal 215 editor@iac.br