Citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não voadores de três localidades na Amazônia Central

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA INPA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS Citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não voadores de três localidades na Amazônia Central Carlos Eduardo Faresin e Silva MANAUS-AM 2008

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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA INPA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS Citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não voadores de três localidades na Amazônia Central Carlos Eduardo Faresin e Silva Orientador: Eliana Feldberg, Dra. Co-orientador: Maria Nazareth Ferreira da Silva, PhD. Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. MANAUS-AM 2008 ii

FICHA CATALOGRÁFICA S586 Silva, Carlos Eduardo Faresin e Citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não voadores de três localidades / Carlos Eduardo Faresin e Silva.--- Manaus : [s.n.], 2008. xiii, 61f. : il. Dissertação (mestrado)-- INPA/UFAM, Manaus, 2008 Orientador: Eliana Feldberg Co-orientador : Maria Nazareth Ferreira da Silva Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva 1. Marmosa. 2. Micoureus. 3. Didelphis. 4. Proechimys. 5. Ag-RONs. 6. Rearranjos cromossômicos. 7. Cariótipo. I. Título. CDD 19. ed. 599.20415 Sinopse: Com o intuito de contribuir para a caracterização cromossômica dos os pequenos mamíferos da Amazônia central foram analisadas cinco espécies comuns a essa região em três pontos de coleta. A aplicação das técnicas de bandeamentos C, -G e Ag-RON mostraram-se úteis como marcadores espécie-específicos para os marsupiais Micoureus demerarae, Marmosa murina e Didelphis marsupialis e mostraram que os roedores Proechimys cuvieri apresentam variação no padrão de banda-c, enquanto que o cariótipo com 46 cromossomos encontrado para Proechimys guyannensis teve seu padrão de bandeamento aqui descrito pela primeira vez. iii

ORIENTADOR CO-ORIENTADOR iv

Nada é mais doloroso para a alma humana do que a lassidão, o trágico marasmo que sobrevêm à rápida seqüência de fatos e sentimentos tumultuosos, como a paisagem desoladora da floresta após a passagem da tormenta. Mary Shelley v

Dedico aos meus pais que, mesmo à distância, me apoiaram em todas as situações. vi

Apoio: Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Laboratório de Genética Animal/CPBA e Coleção de Mamíferos, INPA, onde este trabalho foi realizado. CNPq Concessão da bolsa de mestrado Projeto (PPI/INPA) Caracterização genética (cromossomos, proteínas e DNA) de peixes e pequenos mamíferos, coordenado pela Dra. Eliana Feldberg, no financiamento da excursão realizada à Usina hidroelétrica de Balbina e no fornecimento de material laboratorial. Petrobrás S/A Projeto Muruatá, no financiamento das coletas realizadas no município de Manaus. Instituto de Pesquisas Ecológicas (IPÊ) no financiamento da viagem ao rio Cuieiras, onde parte do material foi coletada. FAPEAM no fornecimento de material laboratorial. CPBA / INPA fornecimento de infra-estrutura e logística. IBAMA / REBio Concessão das licenças de coleta, infra-estrutura e logística. Secretaria Executiva Adjunta de Pesca e Aqüicultura do Estado do Amazonas ao dispor infra-estrutura da Estação de Piscicultura de Balbina, para instalação temporária de laboratório. vii

AGRADECIMENTOS Agradeço à minha orientadora, Dra. Eliana Feldberg pela oportunidade de explorar um campo inédito na minha vida acadêmica. Pelas discussões, incentivo, orientação, aconselhamento, paciência e principalmente por confiar nos meus esforços. À minha co-orientadora, Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, por fornecer base para continuar meu aprendizado com pequenos mamíferos, pelas excelentes sugestões feitas em todos os textos que lhe apresentei. Ao colega Rodrigo Andrade, pelo auxílio em laboratório, e à colega Maria Claudia Gross, por ensinar, opinar e pelo auxílio fundamental na minha rotina de laboratório e no desfecho desse trabalho. Aos colegas Marco Antônio Schetino, Rodrigo Andrade e Eduardo Eler, pela sincronia e parceria nos trabalhos de campo, foram as melhores saídas de campo que tive. Às secretárias, Hercília e Alessandra, pela prestatividade e por esclarecerem minhas dúvidas. Aos meus amigos, Renato Machado e Sílvia Mardegan, por me receberem em Manaus e me aceitarem na sua casa. Aos parceiros de república Rafael Narck Silva e Pedro Simões, pelos momentos de descontração em casa. Aos meus amigos, Marco Schetino, Rafael Maia, Rafael Angrizani e Gabriela Müller, pela amizade e companheirismo nos momentos mais difíceis do começo do mestrado. E também a todos os amigos que fiz em Manaus. viii

RESUMO Na Amazônia, roedores e marsupiais representam uma parcela importante da riqueza de espécies de mamíferos. Apesar da crescente quantidade de estudos mostrarem a grande diversidade dessa fauna, aspectos sistemáticos e taxonômicos ainda permanecem incompreendidos. Nesse contexto a citogenética constitui uma ferramenta adequada para o reconhecimento das espécies e compreensão de eventos evolutivos. Este trabalho teve objetivo de caracterizar cromossomicamente marsupiais dos gêneros Didelphis, Micoureus e Marmosa e roedores do gênero Proechimys, de três localidades da Amazônia Central em busca de marcadores que auxiliassem na taxonomia e evolução desses táxons. Indivíduos foram coletados na UHE de Balbina, na Refinaria de Manaus (REMAN-Petrobrás) e na PAREST rio Negro setor Sul, rio Cuieiras totalizando 38 espécimes de marsupiais e 11 do gênero Proechimys. Os cariótipos de Didelphis marsupialis e Micoureus demerarae não apresentaram diferenças dos encontrados na literatura, porém os indivíduos de Marmosa murina apresentaram uma inversão pericêntrica em um dos cromossomos do par seis, que foi detectada com o auxílio das técnicas de banda C e Ag-RON. Para M. murina, foi possível ainda, por comparação com dados bibliográficos, detectar quatro citótipos com diferenças na morfologia dos cromossomos sexuais. O alto grau de conservação dos cariótipos dos marsupiais tem sido repetidamente comentado na literatura, porém o heteromorfismo observado em M. murina mostra a existência de rearranjos cromossômicos, mas o real significado destes na evolução do grupo ainda é incompreendido. No gênero Proechimys foram encontrados dois cariótipos: 2n=28, NFa=46 nos indivíduos do rio Cuieiras e REMAN- Manaus e 2n=46, NFa=50 nos indivíduos da UHE de Balbina (presente trabalho). O cariótipo com 2n=28 cromossomos pertence à espécie Proechimys cuvieri e compartilhou semelhanças com indivíduos de mesmo número diplóide de outras duas regiões: UHE de Balbina (dados da literatura) e vale do Jarí, diferenciando desse último apenas na morfologia do cromossomo X. Na Amazônia Central, espécimes de Proechimys cuvieri mostraram um polimorfismo no padrão de banda C e no número fundamental, sendo que três citótipos podem ser identificados. Aparentemente não existe um padrão de distribuição geográfica para estes citótipos que pudesse definir um cline. O cariótipo com 2n=46 cromossomos mostrou-se similar aos dos indivíduos do rio Jatapu, Roraima, porém os dados de bandeamento não estiveram disponíveis na literatura para comparação. Proechimys com 2n=46 e NFa=50, foram incluídos em P. guyannensis tendo por base resultados adicionais de análises moleculares, reforçado pela comparação do padrão de banda G, que mostrou homeologias com o cariótipo de 2n=38 do grupo guyannensis. ix

ABSTRACT In the Amazon rainforest, rodents and marsupials account for an important part of mammal s species richness. Although the number of researches showing the great diversity of animal species is increasing, systematic and taxonomic aspects are still not fully understood. In this context, cytogenetics is a very adequate tool for recognizing species and comprehending evolutionary processes. This work aimed to characterize karyotypically individuals from genus Didelphis, Micoureus, Marmosa, and Proechimys, of three locations of central Amazon, searching for markers to help comprehending taxonomy and evolution of these groups. Specimens were collected in the Balbina Hydroelectric Power Plant Dam, Manaus Oil Refinery (Petrobrás) and the National State Park (PAREST) rio Negro Setor Sul, Cuieiras river, amounting 38 marsupial specimens and 11 specimens of genus Proechimys. Karyotypes of Didelphis marsupialis and Micoureus demerarae did not show any differences from those found on scientific literature, but individuals of Marmosa murina showed a pericentric inversion on one of the chromosomes of pair 6, detected with use of C-banding and Ag-NOR techniques. Still, in M. murina, through comparison with bibliographic data, it was possible to distinguish four different cytotypes with differences in the sexual chromosomes. The high conservation of marsupials karyotype is heavily defended in past works, but the heteromorphism in M. murina reveal the presence of chromosomal rearrangements, although the true significance of these rearrangements on the evolution of this group is still unknown. In genus Proechimys, two karyotypes were found: 2n=28, FNa=46 in specimens from both Cuieiras river and Manaus Oil Refinery, and 2n=46, FNa=50 in specimens from the Balbina dam. The karyotype 2n=28 was assigned Proechimys cuvieri and shares traits with individuals with the same diploid number from other two localities: Balbina dam and the Jari river valley, differing from the latter only in the X chromosome morphology. In central Amazon, Proechimys cuvieri showed a C-banding pattern polymorphism and FNa, and three cytotypes can be identified. Apparently, there are no geographic distribution pattern relations, which could define a cline for these species. The 2n=46 karyotype showed morphologic characteristics similar to individuals from Jatapu river, Roraima state, but banding techniques data could not be found on the literature for comparison. Proechimys specimens with 2n=46 and NFa=50 were included in P. guyannensis based on additional results of molecular tests, reinforced by comparing the pattern of G-bands, which showed homeologies with the karyotype 2n=38 of the group guyannensis. x

Sumário 1. Introdução... 1 1.1 Características ecológicas de pequenos mamíferos não voadores... 2 1.2 Ordens Didelphimorphia e Rodentia... 3 1.3 Citogenética... 6 1.4.1. Objetivo geral... 10 1.4.2. Objetivos específicos... 10 2. Material e Métodos... 11 2.1 Material... 11 2.2 Locais de Coleta... 13 2.3. Métodos... 15 2.3.1. Técnica de coleta... 15 2.3.2. Obtenção de cromossomos mitóticos... 16 2.3.3. Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C)... 17 2.3.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs)... 18 2.3.5. Bandeamento G (GTG)... 18 2.3.6. Análise cariotípica... 19 3. Resultados... 20 3.1. Ordem Didelphimorphia - Família Didelphidae... 20 3.1.1 Micoureus demerarae 2n=14; NFa=20... 20 3.1.2 Marmosa murina 2n=14; NFa=22... 23 3.2. Ordem Rodentia - Família Echimyidae... 29 3.2.1 Proechimys cuvieri - 2n=28; NFa=46... 30 3.2.2 Proechimys guyannensis - 2n=46; NFa=50... 32 4. Discussão... 34 4.1. Micoureus demerarae e Marmosa murina 2n=14... 34 4.2 Didelphis marsupialis 2n = 22... 40 4.3 Gênero Proechimys... 43 4.3.1 Proechimys cuvieri 2n=28... 43 4.3.2 Proechimys guyannensis 2n=46... 46 5. Conclusão... 50 6. Referências Bibliográficas... 51 xi

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figuras Figura 1. Espécimes analisados no presente trabalho... 13 Figura 2. Mapa indicando os locais de coleta dos espécimes analisados: UHEBalbina 01 55 S, 59 28 ; REMAN 03 08 S, 59 57 W; PAREST 02 47 S, 60 27 W.... 15 Figura 3. Cariótipos de Micoureus demerarae... 22 Figura 4. Cariótipos de Marmosa murina... 25 Figura 5. Cariótipos de Didelphis marsupialis (2n=22)... 28 Figura 6. Características cariotípicas de Proechimys cuvieri (2n=28)... 31 Figura 7. Cariótipos de Proechimys guyannensis (2n=46)... 33 Figura 8. Posição do centrômero e padrão de heterocromatina dos pares 5, 6 e sexuais, de Micoureus demerarae e Marmosa murina.... 35 Figura 9. Par seis de Marmosa murina em coloração convencional, impregnação por Ag- NO 3 e banda C.... 36 Figura 10. Esquema mostrando a inversão pericêntrica em um dos homólogos do par seis... 36 Figura 11. Distribuição dos citótipos de Proechimys cuvieri... 45 Figura 12. Distribuição de três cariótipos de P. guyannensis... 47 xii

Tabelas e quadros Tabela 1. Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas e locais de coleta para machos e fêmeas de Micoureus demerarae (identificados pela sua numeração de campo).... 21 Tabela 2: Número diplóide, freqüências relativas (%), total de células analisadas e local de coleta para machos e fêmeas de Marmosa murina (identificados pela sua numeração de campo).... 24 Tabela 3: Número diplóide, freqüências relativas (%), total de células analisadas e locais de coleta para machos e fêmeas de Didelphis marsupialis (identificados pela sua numeração de campo).... 27 Tabela 4: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas por locais de coleta para machos e fêmeas do gênero Proechimys (identificados pela sua numeração de campo).... 29 Quadro 1: Formas de cromossomos sexuais descritos para M. murina.... 39 xiii

1. Introdução A floresta amazônica é uma das maiores florestas tropicais do mundo, e no Brasil ela ocupa nove Estados. Nela são encontrados diversos tipos de ecossistemas, como por exemplo: matas de terra firme, matas de várzea, igapós, campos, campinarana, campina e cerrados (Ab Saber, 1977; INPE, 1999; IBAMA, 2006). Essa riqueza de ecossistemas abriga uma fauna igualmente diversificada. Na Amazônia brasileira foram registradas 311 espécies de mamíferos, das quais 22 são marsupiais e 72 roedores, porém esses números tendem a aumentar, seja por avanços na área da taxonomia, seja pela realização de inventários de longo prazo que combinem diversos métodos de coleta (Voss & Emmons, 1996; da Silva et al., 2001). Uma revisão realizada por Voss & Emmons (1996) aponta dez sítios de amostragem que podem ser considerados exemplares na Amazônia; destes, apenas dois estão localizados no Brasil, nas áreas do Projeto Dinâmica Biológica de Fragmentos Florestais (PDBFF) próximas a Manaus (AM) e na região do rio Xingú no Pará. Desde então, outros esforços significativos foram realizados com mamíferos amazônicos, incluindo descrições de espécies novas de roedores e marsupiais. Patton et al. (2000), por exemplo, registraram 81 espécies de mamíferos não voadores em 16 sítios amostrais distribuídos ao longo do rio Juruá, no oeste da região amazônica e em decorrência desses estudos de campo, descreveram nove espécies novas de roedores (Patton & da Silva, 1995; da Silva, 1998; Patton et al., 2000). Outro estudo foi o de Voss et al. (2001), que realizaram um amplo inventário de mamíferos em Paracou, na Guiana Francesa e encontraram 64 espécies de mamíferos não voadores, sendo 12 espécies de marsupiais e 22 de roedores, incluindo a descoberta de novas espécies, extensão da distribuição geográfica de espécies já conhecidas e resolução de problemas taxonômicos há anos existentes. Esses poucos exemplos demonstram a falta de conhecimento e a necessidade de amostragens adequadas nesta região, seguidas de estudos detalhados dos materiais obtidos. Portanto, não é difícil concluir que a diversidade real dos pequenos mamíferos continua desconhecida e provavelmente subestimada. Esses autores ainda comentam a existência de uma diminuição na diversidade de mamíferos no sentido oeste-leste (veja também Emmons 1984), sendo que no oeste está uma das regiões mais ricas das Américas ou mesmo do 1

mundo, com aproximadamente 200 espécies de mamíferos vivendo em simpatria. Patton et al. (2000) obtiveram um padrão semelhante quando compararam a comunidade de pequenos mamíferos do rio Juruá com outros 14 sítios, e estabeleceram dois grupos geográficos delimitados por um eixo norte-sul que está representado pelos rios Madeira ao sul do eixo Solimões-Amazonas e o rio Negro ao norte, conforme sugerido por Wallace (1852) ao observar as comunidades de primatas na Amazônia. 1.1 Características ecológicas de pequenos mamíferos não voadores Roedores e marsupiais apresentam enorme variação de nichos, hábitats e também de hábitos, o que pode refletir de forma marcante nas características morfológicas das espécies. Em geral, apresentam modo de vida noturno e solitário, porém algumas espécies podem ser avistadas durante o dia e possivelmente em grupo, como esquilos e capivaras (Voss & Emmons, 1996). Algumas espécies apresentam modo de vida colonial, como Trinomys yonenagae e as do gênero Clyomys. Nos gêneros de marsupiais Caluromys, Micoureus, Gracilinanus (família Didelphidae) e de roedores Kannabateomys, Isothrix, Mesomys (família Echymyidae), os indivíduos exibem adaptações nas patas e caudas para o modo de vida arborícola. Já nos gêneros Chironectes (família Didelphidae) e Ichtyomys, Neusticomys e Nectomys (família Cricetidae), os indivíduos possuem membranas interdigitais incompletas, próprias para o hábito semi-aquático. Existem ainda roedores com outras adaptações para salto, escavação e planeio (Nowak, 1991; Eisenberg & Redford, 1999). A dieta desses animais também apresenta uma grande amplitude, possibilitando classificá-los em seis categorias tróficas: herbívoro, insetívoro, onívoro, seminívorofrugívoro, herbívoro/seminívoro-frugívoro, herbívoro/insectívoro (Silva, 2005). Devido ao hábito frugívoro, eles podem atuar como dispersores ou predadores de sementes, selecionando as plantas participantes das sucessões ecológicas (Malcolm, 1991). Além da dispersão e seleção de sementes, roedores e marsupiais também fazem parte da dieta de outros animais como aves, mamíferos e répteis. Em cachorros-do-mato (Cerdocyon thous), por exemplo, os vestígios de roedores nas fezes podem chegar a 36% (Rocha et al., 2004), enquanto em lobos-guará (Chrysocyon brachiurus), roedores e marsupiais representaram juntos cerca de 22,8% da dieta (Bueno et al., 2002; Silva & 2

Talamoni, 2003). Acunã et al. (2004) estudaram a variação sazonal sobre o consumo de roedores por suindaras (Tito alba) numa área suburbana chilena e verificaram que cerca de 85% da sua dieta era composta de roedores. Os primeiros estudos ecológicos de pequenos mamíferos na Amazônia brasileira tiveram como enfoque a ecologia de comunidade e foram conduzidos na região central, avaliando os parâmetros ecológicos de riqueza, abundância e biomassa. Essas pesquisas foram conduzidas por Emmons (1984) e Malcolm (1991) em áreas do Projeto Dinâmica Biológica de Fragmentos Florestais, cujos fragmentos variaram em área e período de isolamento, mas todos situados próximos à cidade de Manaus. Estudos subseqüentes demonstraram que algumas espécies de roedores tornaram-se mais abundantes mediante os efeitos da fragmentação florestal e extração seletiva de madeira, sendo a única exceção as espécies do gênero Proechimys, que se tornaram mais raras nessas circunstâncias (Malcolm, 1991; Tavares, 1998). Segundo estes estudos, as espécies de roedores exploram os ambientes alterados, devido a maior oferta de alimento e condições mais adequadas para sua proliferação. Dessa forma, espécies de pequenos mamíferos representam importantes componentes nas comunidades, como indicadores biológicos do estado de degradação dos fragmentos (Lima, 1998; Rittl, 1998). Com essa grande diversidade e representatividade dentro dos ecossistemas, a taxonomia de roedores e marsupiais ainda apresenta-se como um desafio, consideradas a existência de espécies crípticas, a variabilidade e polimorfismos em diversas características. Dessa forma muito de sua diversidade pode estar sendo subestimada. 1.2 Ordens Didelphimorphia e Rodentia A ênfase de nosso estudo será nos marsupiais dos gêneros Micoureus, Marmosa e Didelphis (Didelphidae) e em roedores do gênero Proechimys (Echimyidae). Além de nosso interesse científico na sistemática de mamíferos de modo geral, existe também a disponibilidade de suspensões celulares para os táxons acima indicados nos acervos biológicos do INPA, e trabalhos em colaboração já estabelecidos para a amostragem desses animais. Segundo Stoddart (1979), os pequenos mamíferos compreendem marsupiais, quirópteros e roedores com massa inferior a seis quilogramas. Roedores e marsupiais são 3

considerados pequenos mamíferos não voadores, pertencentes à classe Mammalia, subclasse Theria. Os marsupiais estão classificados dentro da Infraclasse Metatheria e representam cerca de 7% das espécies de mamíferos mais recentemente descritas (Patterson, 2000). Esta infraclasse contém sete ordens: Didelphimorphia, Microbiotheria e Paucituberculata, encontradas nas Américas do Sul e do Norte, e as ordens de marsupiais australianos Dasyuromorphia, Diprotodontia, Peramelemorphia e Notoryctemorphia, que juntas possuem cerca de 270 espécies conhecidas (Gardner, 1993; Groves, 1993, Carvalho et al., 2002). No continente americano, os marsupiais estão distribuídos desde as florestas austrais da Patagônia passando pelas florestas andinas de grandes altitudes, florestas tropicais e subtropicais de terras baixas, cerrados, caatingas até as regiões temperadas da América do Norte, onde estão representados por uma única espécie de gambá, Didelphis virginiana (Costa, 2005). Na América do Sul, a ordem Paucituberculata é representada por uma única família, que contém três gêneros viventes e seis espécies encontradas em florestas e planaltos da região andina; a ordem Microbiotheria é representada por uma única espécie, Dromiciops gliroides, encontrada em florestas do Chile e Argentina; e a ordem Didelphimorphia, a mais diversificada, com uma família, 15 gêneros e 87 espécies. No Brasil todos os marsupiais pertencem exclusivamente a esta última ordem e à família Didelphidae, sendo que na Amazônia, 12 gêneros podem ser encontrados (Gardner, 1993; Albuja & Patterson, 1996; da Silva et al., 2001; Wilson & Reeder, 2005). Os marsupiais contemporâneos são considerados remanescentes de uma fauna que foi dominante no continente sul-americano durante o período Cenozóico. A família Didelphidae é considerada entre as mais antigas com provável origem na América do Norte, mas com radiação praticamente isolada na América do Sul. Atualmente, os marsupiais dessa família são considerados como um grupo especializado, porém mais proximamente relacionado aos primeiros didelfimorfos do Cretáceo (Costa, 2005). O gênero Marmosa é considerado de taxonomia problemática e muitas espécies, inclusive Micoureus demerarae, foram anteriormente alocadas neste táxon, que segundo o conceito de Tate (1933) chegou a englobar o que é hoje reconhecido como pertencente a cinco gêneros distintos de marsupiais didelfídeos de pequeno porte, porém atualmente são reconhecidas nove espécies para o gênero Marmosa (M. andersoni, M. robinsoni, M. 4

lepida, M. mexicana, M. quichua, M. tyleriana, M. xerophila e M. murina) e seis para o gênero Micoureus (M. demerarae, M. regina, M. paraguayanus, M. constantiae, M. alstoni e M. phaeus) (Wilson & Reeder, 2005; Gardner, 2007). A semelhança entre espécies dos gêneros Marmosa e Micoureus é observada na morfologia externa, assim como na morfologia craniana dessas espécies (Creighton & Gardner 2007; Gardner & Creighton 2007), porém estudos morfológicos detalhados auxiliam no reconhecimento dessas espécies (Patton et al., 2000; Voss et al. 2001). Segundo Patton et al. (2000), Marmosa murina e espécies de mesmo tamanho pertencentes ao gênero Marmosops, quando em simpatria, também podem ser confundidos e caracteres externos e cranianos também se mostram úteis na distinção entre ambas. De fato, em análises filogenéticas recentes da família Didelphidae, os gêneros Micoureus e Marmosa apresentaram uma relação filogenética próxima, porém a relação entre eles ainda é incerta, com Marmosa apresentando-se como um gênero parafilético (Voss & Jansa, 2003; Voss et al., 2004). Dentro do gênero Didelphis são conhecidas seis espécies: D. virginiana, D. albiventris, D. imperfecta, D. aurita, D. pernigra e D. marsupialis (Wilson & Reeder, 2005). Dentre essas espécies, pode-se dizer que Didelphis marsupialis é a única encontrada na bacia amazônica, embora indivíduos de Didelphis de orelha branca também tenham sido registrados na região (MNF da Silva, comunicação pessoal). Contudo D. marsupialis e D. albiventris já foram registradas em simpatria na região das Guianas (Julien-Laferrière, 1991). Apesar de exemplares de Didelphis marsupialis dificilmente serem confundidos com didelfídeos pertencentes a outros gêneros, a identificação específica pode ser dificultada em locais onde ocorram D. marsupialis e D. aurita ou em locais onde ocorram D. marsupialis e D. albiventris (Cerqueira, 1985; Catzeflis et al., 1997; Lavergne et al., 1997). Essa dificuldade, contudo, pode ser devidamente superada por pesquisadores experientes pelo fácil reconhecimento das características diagnósticas (Voss et al., 2001). A ordem Rodentia está inserida na infraclasse Eutheria. De acordo com a mais recente classificação, esta ordem possui cinco subordens: Sciuromorpha (quatro famílias), Castorimorpha (duas famílias), Myomorpha (sete famílias), Anomaluromorpha (duas famílias) e Hystricomorpha (18 famílias) (Wilson & Reeder, 2005). Destas, três ocorrem na 5

Amazônia e estão representadas por oito famílias: Sciuridae, Cricetidae, Erethizontidae, Dinomyidae, Hydrochaeridae, Dasyproctidae, Agoutidae e Echimyidae com cerca de 25 gêneros e 70 espécies (da Silva et al., 2001; Wilson & Reeder, 2005). Dentre todos os mamíferos, pode-se dizer que a ordem Rodentia representa um dos táxons de maior diversificação. Esta ordem possui cerca de 40% das espécies existentes de mamíferos, apresentando cerca de 2.000 espécies distribuídas em todos os continentes, exceto na Antártica (Myers, 2000). Na região Neotropical, 60% das novas espécies descritas de mamíferos pertencem a esta ordem (Patterson, 2000). Especificamente entre os roedores histricognatos, a família Echimyidae representa a família mais numerosa com 20 gêneros e 78 espécies, sendo que 20 destas podem ser encontradas na Amazônia (Voss & Emmons, 1996; Patton et al., 2000). No caso do gênero Proechimys, atualmente são reconhecidas 25 espécies e as relações filogenéticas entre as mesmas ainda permanecem incertas, principalmente nos seus níveis mais basais (Patton & Reig, 1989; da Silva, 1998; Patton et al., 2000; Wilson & Reeder, 2005). Um dos principais trabalhos abordando a taxonomia do gênero Proechimys foi realizado por Patton (1987) que, por meio de estudos morfológicos, pôde agrupar 59 nomes dos nomes existentes na literatura em nove grupos de espécie: guyannensis, goeldii, longicaudatus, simonsi, cuvieri, trinitatus, semispinosus, canicollis e decumanus. Ainda assim o reconhecimento das espécies pela morfologia carece de amostragens geográficas abrangentes, mas mostra-se útil para diferenciar espécies simpátricas (Patton & Gardner, 1972; Gardner & Emmons, 1982). 1.3 Citogenética Os dados citogenéticos têm sido úteis para o delineamento taxonômico de espécies de pequenos mamíferos e amplamente utilizados em estudos mais recentes, como pode ser observado nos trabalhos de da Silva (1998), Musser et al. (1998), Bonvicino & Weksler (1998), Patton et al. (2000), Weksler et al. (2001), Oliveira & Bonvicino (2002), Bonvicino et al. (2003a; b), entre outros. A citogenética como ferramenta torna-se particularmente útil no estudo dos roedores, devido ao fato deste grupo apresentar convergências e homoplasias morfológicas, que geram inúmeras controvérsias taxonômicas (Bonvicino et al., 2005). 6

Apesar das similaridades em sua morfologia, algumas populações de roedores possuem cariótipos que podem variar intra-especificamente em nível regional, simpátrica ou alopatricamente, ou entre populações morfologicamente semelhantes, constituindo as denominadas espécies crípticas (Mayr, 1977; Futuyma,1992). Em estudos comparativos utilizando bandeamento cromossômico (banda G), dados moleculares e morfológicos, Silva et al. (2006) puderam inferir que uma população de roedores akodontinos com 2n=10 cromossomos era filogeneticamente próxima à outra com 2n=16 cromossomos. Ambas teriam derivado de um ancestral comum que possuía 2n=16 cromossomos, onde vários rearranjos cromossômicos estiveram envolvidos. Freitas (2006) demonstrou que algumas espécies do gênero Ctenomys têm ampla variação cromossômica intra-específica regional. Este autor apontou 11 formas cariotípicas, que se sobrepunham geograficamente umas com as outras, formando zonas híbridas. Segundo o autor, esta situação concorda com os dados da história geográfica da costa do estado do Rio Grande do Sul, onde estas espécies habitam, sugerindo que tais zonas representam um contato secundário destas espécies após o desaparecimento das barreiras. Taylor (2000) aponta essas diferenciações cromossômicas como barreiras pré- ou pószigóticas devido a incompatibilidades ocasionadas por cruzamentos inter-populacionais, tornando-as reprodutivamente isoladas. A descoberta de diferentes cariótipos intra-específicos tem sugerido a existência de espécies crípticas e levado à realização de novos estudos em taxonomia e sistemática dos grupos em questão. Nesse âmbito, as técnicas de bandeamentos cromossômicos (C e G, por exemplo) possibilitam inferir os tipos de rearranjos que ocorreram nas populações, possibilitando relacioná-los com a história evolutiva do grupo. Essas técnicas têm sido utilizadas tanto em roedores como em marsupiais da Mata Atlântica (Aniskin & Volobouev, 1999; Andrade-Miranda et al., 2001; Silva et al., 2006; Freitas, 2006), e mais recentemente elas têm sido empregadas em espécies amazônicas (Weksler et al., 2001; Carvalho et al., 2002; Bonvicino et al., 2003a; Machado et al., 2005, Eler, 2008). Diversos estudos têm enfocado a citogenética de marsupiais e nesse âmbito é possível reconhecer três principais características comuns: (1) baixos números diplóides, com variação de 10 a 32 cromossomos, (2) grandes cromossomos (Hayman, 1990) e (3) alto grau de conservação (Svartman & Vianna-Morgante, 1999). Essas características 7

também são observadas nos marsupiais sul-americanos e na família Didelphidae são encontrados apenas três números diplóides: 2n=14, 18 e 22 (Reig et al., 1977). Reig et al. (1977) propuseram três direções para a evolução desses cariótipos. O primeiro considera o 2n=14 cromossomos como o ancestral e a partir deste teria ocorrido um aumento para 2n=18 e posteriormente para 2n=22. O segundo seria o surgimento bidirecional dos cariótipos com 14 e 22 cromossomos a partir do 2n=18. A última alternativa seria a redução do número diplóide do 2n=22 para 18 e posteriormente para 14. Hayman (1990), observando os padrões de banda G de diversas espécies de marsupiais, propôs que o número diplóide 2n=14 seria o ancestral. Recentemente, com a aplicação de técnicas de hibridização in situ foram observadas seqüências teloméricas próximas ao centrômero de cromossomos com dois braços, o que corrobora a hipótese de que eventos de diferenciação cromossômica nos marsupiais teria seguido a direção da redução do número diplóide por meio de fusões (Svartman & Vianna-Morgante, 1998; Carvalho & Mattevi, 2002). Já nas espécies do gênero Proechimys são observadas 57 formas cromossômicas para cerca de 25 espécies (Eler, 2007). Os números diplóide e fundamental autossômico (NFa conforme Gardner & Patton, 1976) variam de 2n=14 e NFa=18, como em Proechimys sp. (Barros, 1978) até 2n=62 e NFa=80 em P. trinitatis (Aguilera & Corti, 1994). Dentro dessa variação um mesmo número diplóide pode apresentar mais de um NFa e uma espécie pode mostrar mais de um número diplóide, o que gera essa grande quantidade de citótipos. Nesse contexto a análise cromossômica, combinada a análises morfológicas e moleculares, tem se mostrado útil para distinção de espécies simpátricas (Patton & Gardner, 1972; da Silva 1998), porém existem variações geográficas nos cariótipos das espécies de Proechimys (Reig et al., 1980; Gardner & Emmons, 1984). Mesmo com diversos cariótipos já registrados, nenhuma hipótese para a evolução cromossômica pôde ser elaborada para este grupo em grande parte devido à carência de informações citogenéticas para a grande maioria dos táxons de Proechimys e em função da inexistência de uma filogenia robusta estabelecendo as relações interespecíficas neste gênero. Apesar de sua grande diversidade, espécies amazônicas ainda foram pouco exploradas no campo da citogenética, mais especificamente em relação aos bandeamentos cromossômicos. Desse modo, dada a importância das técnicas citogenéticas em auxiliar na 8

caracterização e identificação das espécies de pequenos mamíferos da Amazônia, e sua importância para o entendimento dos eventuais fatores que podem levar a eventos de especiação, o presente trabalho teve como proposta fornecer dados cromossômicos de três espécies de marsupiais dos gêneros Micoureus, Marmosa e Didelphis e duas de roedores do gênero Proechimys de três localidades da Amazônia Central, visando contribuir para a eventual compreensão do processo evolutivo destes táxons na Amazônia. 9

1.4. Objetivos 1.4.1. Objetivo geral Descrever os cariótipos de pequenos mamíferos representantes de três localidades da Amazônia Central, com ênfase nos gêneros Micoureus, Marmosa e Didelphis (Didelphimorphia, Didelphidae) e do gênero Proechimys (Rodentia, Echimyidae), em busca de dados que auxiliem na taxonomia e na compreensão da evolução desses táxons. 1.4.2. Objetivos específicos Apresentar o cariótipo de espécies dos gêneros Micoureus, Marmosa e Didelphis (Didelphimorphia, Didelphidae) e do gênero Proechimys (Rodentia, Echimyidae) da Amazônia Central. Estabelecer os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva (banda C), das regiões organizadoras do nucléolo (RONs) e da banda G nos cromossomos mitóticos dos indivíduos coletados, para a detecção de polimorfismos e/ou variabilidade cromossômica. Comparar os resultados encontrados com dados citogenéticos existentes na literatura para esses táxons provenientes de outras áreas da Amazônia para identificar as peculiaridades dos cariótipos das populações estudadas. 10

2. Material e Métodos 2.1 Material Os animais analisados neste estudo foram obtidos a partir da colaboração estabelecida com os seguintes projetos: (1) Projeto Muruatá da Petrobrás em convênio com a Universidade Federal do Amazonas; (2) Levantamento faunístico de mamíferos de pequeno porte na região do Parque Estadual do Rio Negro Setor Sul Instituto de Pesquisas Ecológicas (Ipê); (3) Caracterização genética (cromossomos, proteínas e DNA) de peixes e pequenos mamíferos da Amazônia INPA/PPI. Dentre os táxons coletados no âmbito desses projetos e para os quais existiam suspensões celulares, foram escolhidos os mais comuns a cada local de coleta: Proechimys e Didelphis estavam presentes em todas as localidades, Micoureus em duas e Marmosa em apenas uma localidade. A seguir, é apresentada uma breve descrição da morfologia externa de cada um dos táxons analisados no presente estudo. Roedores sauiá do gênero Proechimys Os representantes do gênero Proechimys podem ser facilmente reconhecidos, pela sua forma generalizada e típica de roedores terrestres. Sua pelagem dorsal consiste de uma mistura de pêlos setiformes, um pouco mais suaves, com pêlos aristiformes mais alongados e enrijecidos, característicos dos equimídeos. A coloração da pelagem dorsal e lateral geralmente é castanho avermelhado e o ventre é branco e raramente com tons de cinza ou avermelhado na região da garganta, peitoral e inguinal. O comprimento da cauda é sempre menor que o comprimento da cabeça e corpo (comprimento da cabeça e corpo varia de 80 a 500 milímetros e o comprimento da cauda 124 a 180 milímetros). A cabeça e o rostro são alongados, as orelhas são grandes e eretas quando comparadas aos demais equimídeos de porte similar. As patas posteriores são longas (com variação de 38 a 56 milímetros) e estreitas e possuem cinco dedos compridos e delgados, enquanto as patas anteriores são curtas e possuem quatro dedos (Patton et al., 2000) (Figura 1a). 11

Mucuras-chichica do gênero Micoureus São marsupiais didelfídeos arbóreos de porte médio cujo comprimento da cabeça e corpo varia de 158 a 210 milímetros e o comprimento da cauda varia de 225 a 270 milímetros e podem pesar 80 a 152 gramas. A cauda geralmente exibe uma única cor ou pode ser malhada. A pelagem dorsal é espessa e lanosa e a coloração varia do castanho ao castanho acinzentado. A pelagem ventral é curta de textura lisa ou menos lanosa enquanto a coloração varia do cinza pálido ao amarelo creme ou bege alaranjado (Gardner, 2007) (Figura 1b). Mucuras do gênero Marmosa Esse gênero inclui didelfídeos com uma variação ampla no comprimento corporal (95-176 mm) e, como observado em Micoureus, o comprimento da cauda (130-211 mm) sempre supera o comprimento da cabeça e corpo e o peso pode variar de 10 a 132 gramas entre as espécies. A coloração da cauda pode ser uniforme, parcialmente corada ou fracamente bicolor. A cor, comprimento e densidade da pelagem variam interespecificamente, porém nunca é tão grossa ou lanosa como em Micoureus. Dorsalmente, a pelagem exibe coloração que varia do cinza, castanho arenoso e canela vivo ao castanho avermelhado. Na porção ventral a variação da pelagem pode ser de branco creme ao bege pálido e em algumas espécies, os pêlos ventrais possuem a base acinzentada, principalmente nas porções laterais do corpo (Gardner, 2007) (Figura 1c). Mucura-preta do gênero Didelphis Esse gênero inclui as espécies de maior porte dentre os didelfídeos, seus comprimentos corporais variam de 305 até 437 milímetros na cabeça e corpo enquanto que o comprimento da cauda varia 290 a 430 milímetros, o peso varia de 500 gramas até 2 quilogramas. São facilmente distinguíveis dos demais gêneros da família, porém a identificação das espécies pode ser problemática em zonas de simpatria, como por exemplo, Didelphis marsupialis e D. aurita do sudeste brasileiro (Cerqueira, 1985). A pelagem consiste de longos pêlos-guarda que se sobrepõem por uma camada inferior mais lanosa. Existem duas formas notáveis de coloração da pelagem, uma preta e outra branca ou grisalha, sendo que ambas podem ser encontradas em simpatria. A mancha preta sobre os 12

olhos, típica de outros didelfídeos está ausente neste gênero. Outra característica particular deste grupo é o forte odor que marca a presença do animal, quando não é possível observálo diretamente (Patton et al., 2000) (Figura 1d). Figura 1. Exemplares dos gêneros analisados no presente trabalho: a) Proechimys cuvieri (Foto: Marco Antônio Schetino); b) Micoureus demerarae jovem (Foto: Rafael Benhard); c) Marmosa sp. (fonte: http://www.knowyoursto.com/images); d) Didelphis marsupialis (Foto: Rafael Benhard). 2.2 Locais de Coleta Reservatório da Usina Hidroelétrica de Balbina (dados retirados do site do IBAMA, 2006) A Usina Hidrelétrica de Balbina (UHE Balbina) localiza-se no rio Uatumã, afluente da margem norte do rio Amazonas, município de Presidente Figueiredo, Estado do Amazonas está situada nas coordenadas geográficas 01 o 55' S, 59 o 28' W. O reservatório de Balbina foi formado com o represamento do rio Uatumã, teve um longo período de enchimento (15 meses) e o tempo médio de residência da água é elevado (11,7 meses) em 13

função das características morfológicas da bacia de drenagem (relevo extremamente plano, com entalhamentos pouco pronunciados), que favoreceram a formação de um grande lago (área inundada de aproximadamente 2.360 km²), raso (profundidade média de 7 metros), com inúmeras ilhas (cerca de 3.300), margens dendríticas e uma grande quantidade de árvores mortas afogadas ("paliteiros"). A vegetação da reserva de Balbina é composta basicamente por florestas naturais, com poucas áreas desmatadas, sendo que nas margens do grande lago e igarapés ocorre uma vegetação de igapó. De modo geral, antes da formação do reservatório, foram identificadas as seguintes tipologias florestais: mata de terra-firme, mata de igapó, mata de baixio, campina e campinarana (Figura 2). Mata da Refinaria de Manaus (REMAN-Município de Manaus) São dois os fragmentos que pertencem à refinaria de petróleo Isaac Sabbá (UN- REMAN) da empresa estatal Petrobrás, localizada no Distrito Industrial, zona leste de Manaus (03 08 S, 59 57 W). Esses dois pequenos fragmentos são constituídos de mata secundária e estão isolados dentro do perímetro urbano. Ambos estão claramente sob forte influência antrópica, vestígios de atividade humana, como o lixo encontrado. O sub-bosque é fechado, apresentando uma grande quantidade de cipós e palmeiras (Figura 2). Parque Estadual do Rio Negro Setor Sul O Parque Estadual do Rio Negro Setor Sul (PAREST rio Cuieiras) foi formado a partir do Decreto Estadual 16.497/1995, gerido pelo IPAAM (Ipê, 2006). Ocupa uma área de 257.422 hectares na margem esquerda do baixo rio Negro, nos municípios de Manaus e Novo Airão nas coordenadas geográficas 02 47 S, 60 27 W. A vegetação é constituída por floresta primária, com tipologias florestais semelhantes às descritas para o reservatório de Balbina (Figura 2). 14

Figura 2. Mapa indicando os locais de coleta dos espécimes analisados: UHEBalbina 01 55 S, 59 28 ; REMAN 03 08 S, 59 57 W; PAREST 02 47 S, 60 27 W. 2.3. Métodos 2.3.1. Técnica de coleta No presente trabalho foram utilizadas armadilhas live-traps dos tipos tomahawk (14x14x40cm) e sherman (8x8x23cm). Na REMAN foram estabelecidos dois transectos, um em cada fragmento. No rio Cueiras (PAREST) foi estabelecido um transecto em cada margem. Na UHE de Balbina foi estabelecido um transecto em cada uma das duas ilhas escolhidas. As armadilhas foram dispostas aos pares (uma tomahawk e uma sherman ) em 40 estações espaçadas por uma distância de cerca de 30 metros. A disposição das armadilhas, em cada estação, foi feita obedecendo ao seguinte critério: em estações ímpares, as shermans foram instaladas no sub-bosque em árvores ou cipós que faziam 15

alguma ligação com o dossel, enquanto as tomahawks foram instaladas no chão em frente a tocas ou troncos caídos. Em estações pares foi feito o inverso. Em cada localidade, as armadilhas permaneceram ativadas por um período de 10 noites e foram vistoriadas a cada dia, no período matutino. As iscas foram compostas por fatias de banana com pasta de amendoim torrado e moído, que foram substituídas a cada dois dias ou de acordo com a necessidade. Cada espécime coletado teve seus dados de idade, sexo, estágio reprodutivo, peso, medidas, localidade, ambiente e condições climáticas anotados em caderno de campo padronizado pela curadoria da Coleção de Mamíferos do INPA e foram depositados nesta coleção, onde foram identificados pela Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, curadora da Coleção de Mamíferos do INPA. Os espécimes tiveram a pele, crânio, esqueleto, suspensão celular preparados e seus tecidos coletados. Os indivíduos cujas peles não foram taxidermizadas foram fixados em formol 10% e depois preservados em álcool etílico 70%. As licenças de coleta e transporte foram emitidas pelo IBAMA (número: 10985-1). 2.3.2. Obtenção de cromossomos mitóticos Os cromossomos mitóticos foram obtidos pelo método in vivo segundo Ford & Harmerton (1956), utilizando-se colchicina diluída a 0,025% em uma proporção de 1 ml para cada 100 gramas de peso animal. Essa substância foi injetada intraperitonealmente no animal vivo que foi colocado em descanso por um período de trinta minutos logo após a injeção. Após esse tempo, o animal foi morto utilizando-se inalação de éter etílico. Em seguida, os fêmures foram retirados e suas epífises cortadas e com o auxílio de uma seringa de 10 ml, a medula óssea foi expelida do canal medular por meio de lavagens sucessivas com solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075M, e colocada em placa de Petri até a remoção total desse material. O material foi homogeneizado e colocado em banho-maria ou estufa a 37 ºC por 30 minutos para efetuar a hipotonização das células. A solução foi transferida para um tubo Falcon de 15mL onde foram adicionadas oito a 10 gotas de fixador Carnoy (metanol 3:1 ácido acético) e foi novamente homogeneizada. Essa solução foi centrifugada e o sobrenadante descartado, sendo que o pelet foi ressuspendido em fixador Carnoy. Esses passos foram repetidos duas vezes. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi novamente descartado e o fixador foi adicionado na proporção de 2:1 em 16

relação à quantidade de sedimento, homogeneizando a seguir. Por fim o material foi transferido para um tubo Eppendorf devidamente identificado com o número do espécime e guardado em freezer (-10 C). No laboratório, duas a três gotas das suspensões celulares foram pingadas em lâminas de vidro limpas e aquecidas em água destilada a 55 C, deixando secar à temperatura ambiente. Posteriormente foram coradas com solução de Giemsa, diluída a 5% em tampão fosfato ph 6,8, por 10 minutos e lavadas em água destilada, deixando-se secar ao ar. 2.3.3. Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica de banda C descrita por Sumner (1972), com modificações específicas para roedores e marsupiais descritas a seguir. Para Proechimys, as lâminas contendo duas ou três gotas da suspensão celular foram envelhecidas em estufa a 60 ºC por uma semana. Após esse período, as lâminas foram tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2N a 45 ºC, lavadas em água destilada e secas ao ar. Posteriormente, foram incubadas em solução salina 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trissódico 0,03M, ph 6,8) a 60 ºC, por 15 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida cada lâmina foi tratada separadamente em solução de hidróxido de bário 5%, filtrada e recém preparada a 47 ºC, por 20 a 30 segundos. A ação do hidróxido de bário foi interrompida imergindo rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (45 ºC), sendo posteriormente lavada em água destilada. Após secas, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC a 60 ºC, por um período de 40 minutos, sendo posteriormente lavadas, secas ao ar, coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M, ph 6,8 por 20 minutos, lavadas e novamente secas ao ar. Para os marsupiais não foi necessário envelhecer as lâminas. Estas foram incubadas em solução salina 2XSSC a 60 ºC por 15 minutos, lavadas em água destilada, secas ao ar e posteriormente tratadas com HCl 0,2N por 20 minutos em temperatura ambiente. O tempo de incubação na solução de Hidróxido de Bário variou de 10 a 20 segundos e o tempo de coloração em Giemsa 5% foi de 25 a 30 minutos. 17

2.3.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs) Para a detecção das RONs foi utilizada a técnica de precipitação de cristais de Prata (Ag-RON), descrita por Howell & Black (1980), que consistiu em pingar sobre a lâmina, uma gota de solução aquosa de gelatina a 2% acrescida de ácido fórmico na proporção de 1mL/100mL de solução, foram adicionadas sobre a gota de gelatina duas gotas de solução aquosa de Nitrato de Prata (AgNO 3 ) a 50%, quando se agitou levemente a lâmina que foi então coberta com lamínula; a lâmina foi colocada em câmara úmida e levada ao banhomaria ou estufa a 60 C, por um período de dois a quatro minutos, ou até que a lâmina apresenta-se uma coloração marrom-dourada; as lâminas foram lavadas em água destilada, permitindo que a lamínula e o excesso de soluções fossem removidos e deixadas secar ao ar. Para melhor visualização das marcas, algumas lâminas foram coradas com solução de Giemsa diluído a 2% em tampão fosfato ph 6,8, por 20-30 segundos, lavadas e deixadas secar ao ar. 2.3.5. Bandeamento G (GTG) Para o bandeamento G foi utilizada a técnica descrita por Seabright (1971), com pequenas modificações. Para Proechimys, as lâminas contendo duas ou três gotas da suspensão celular foram envelhecidas por uma semana em estufa a 28 ºC e para os marsupiais as lâminas tratadas eram recém preparadas. As lâminas foram tratadas por 15 minutos em solução 2XSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trissódico 0,06M e ph 6,8) a 60 C; lavadas e deixadas secar ao ar. Em seguida, estas foram imersas em uma solução contendo 5 ml de tripsina 1:250 1% e 95mL de solução tampão fosfato ph 6,8, a uma temperatura próxima do congelamento, por um período de cinco a oito segundos. A ação da tripsina foi bloqueada em uma solução de 49 ml de tampão fosfato e 1 ml de soro fetal bovino e em seguida, as lâminas foram imersas em uma solução tampão fosfato ph=6,8 e por último lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida, as lâminas foram coradas com solução de Giemsa, diluída a 3% em tampão fosfato ph 6,8. O tempo de coloração utilizado para Proechimys foi de 7 minutos e para os marsupiais variou de cinco a 10 minutos. As lâminas foram lavadas e secas ao ar. 18

2.3.6. Análise cariotípica As preparações cromossômicas foram examinadas em microscópio óptico comum com objetiva de imersão. Foram contadas pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo, com o intuito de estabelecer o valor modal (2n) e o número fundamental de braços autossômicos (NFa) de cada espécime, de acordo com Gardner & Patton (1976). As melhores metáfases foram digitalizadas com uma câmera fotográfica digital acoplada a um microscópio na objetiva de imersão. Para a montagem dos cariótipos, os arquivos fotográficos foram editados no programa Adobe Photoshop 7,0. Os cromossomos foram recortados, emparelhados, medidos utilizando o programa ImageJ e agrupados de acordo com a morfologia e em ordem decrescente de tamanho. A morfologia dos cromossomos foi determinada de acordo com a posição do centrômero segundo Levan et al. (1964), com base no índice de relação de braços (RB= comprimento do braço maior/comprimento do braço menor) e classificados em metacêntricos (RB=1,0-1,69), submetacêntricos (RB=1,7-2,99), subtelocêntricos (RB=3,00-6,99) e acrocêntricos (RB =7,00). Na determinação do número fundamental autossômico (NFa), para efeito de contagem, foram considerados apenas os autossomos, sendo que os metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços distintos e os acrocêntricos um. 19

3. Resultados 3.1. Ordem Didelphimorphia - Família Didelphidae Desta família foram analisadas três espécies em três gêneros: Micoureus demerarae, Marmosa murina e Didelphis marsupialis. 3.1.1 Micoureus demerarae 2n=14; NFa=20 Desta espécie foram analisados oito machos e três fêmeas coletados na REMAN e dois machos e uma fêmea coletados no rio Cuieiras, totalizando 378 células utilizadas para a determinação do número diplóide (Tabela 1). Todos os indivíduos apresentaram o número diplóide igual a 14 cromossomos e NFa= 20. Dentre os autossomos, os três pares submetacêntricos foram os maiores do complemento, com um decréscimo gradual de tamanho. O par metacêntrico possui um tamanho médio em relação aos demais, enquanto os dois pares acrocêntricos corresponderam à metade do tamanho do par metacêntrico. O par sexual consistiu de dois acrocêntricos, sendo o Y cerca de um terço do tamanho do X (fórmula cariotípica: 2m+6sm+4a+XX/XY) (Figura 3a). A região organizadora de nucléolo foi detectada na porção terminal dos dois pares acrocêntricos, sendo nos braços longos no par 5 e nos braços curtos no par 6 (próximas ao centrômero). Nenhuma variação quanto à distribuição das RONs foi observada entre os indivíduos (Figura 3b). A heterocromatina constitutiva foi observada em grandes blocos na região pericentromérica de todos os autossomos. O cromossomo Y esteve inteiramente heterocromático, enquanto o cromossomo X esteve quase todo heterocromático, exceto por uma estreita faixa eucromática proximal. Em ambos os pares cromossômicos, a RON foi negativa para banda C (Figura 3c). A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente dos maiores pares autossômicos (Figura 3d). 20

Tabela 1. Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas para machos e fêmeas de Micoureus demerarae (identificados pela numeração de campo) para cada localidade de coleta. Local Sexo Indivíduos REMAN (Manaus) PAREST rio Cuieiras Fêmea Macho 2n 12 13 14 15 Total de células Número diplóide Número fundamental EE 149 0 1 29 0 30 14 20 EE 154 0 6 24 0 30 14 20 EE 158 3 4 22 1 30 14 20 EE 148 0 4 24 2 30 14 20 EE 151 3 3 22 2 30 14 20 EE 157 3 3 22 1 29 14 20 EE 167 0 2 8 0 10 14 20 EE 170 2 4 24 30 14 20 EE 176 5 5 20 0 30 14 20 EE 189 0 4 24 2 30 14 20 EE 235 0 0 8 1 9 14 20 Total 16 36 227 9 288 % 5,55 12,5 78,81 3,12 Fêmea EE 193 5 6 19 0 30 14 20 EE 194 4 4 21 1 30 14 20 Macho EE 196 3 5 20 2 30 14 20 Total 12 15 60 3 90 % 13,33 16,66 66,66 3,33 21

Figura 3. Cariótipos de Micoureus demerarae (EE 167): a) em coloração convencional; b) regiões organizadoras de nucléolo, impregnadas por nitrato de prata; c) após a aplicação da técnica de banda C; d) após aplicação da técnica de banda G. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. Barra igual a 5 µm. 22

3.1.2 Marmosa murina 2n=14; NFa=22 A fim de determinar o número diplóide de M. murina foram analisadas 201 células de cinco machos e duas fêmeas (Tabela 2). Todos os indivíduos apresentaram 2n=14 e NFa= 22. Dentre os autossomos os três pares submetacêntricos foram os maiores do complemento, com um decréscimo gradual de tamanho. O par metacêntrico possui um tamanho médio em relação aos demais. Os últimos dois pares, um subtelocêntrico e um acrocêntrico, foram os menores do complemento autossômico com metade do tamanho do par meatcêntrico. O cromossomo X foi classificado como acrocêntrico e o Y como puntiforme, com aproximadamente a metade do tamanho do cromossomo X (fórmula cromossômica: 2m+6sm+2st+2a+XX/XY) (Figura 4a). O par seis apresentou um heteromorfismo em todos os indivíduos, quanto à morfologia dos seus acrocêntricos, onde um dos homólogos desse par possui um pequeno braço acima de seu centrômero. A região organizadora de nucléolo foi evidenciada em dois pares cromossômicos. A primeira marcação foi observada na porção terminal dos braços longos do par subtelocêntrico (par 5), enquanto que no par 6 a região organizadora de nucléolo localizouse terminalmente nos braços curtos, porém uma inversão pericêntrica foi observada em um dos homólogos (Figura 4b, 9 e 10). A heterocromatina constitutiva foi observada na região pericentromérica dos autossomos, porém muito tênue. No maior par submetacêntrico uma marcação foi evidenciada na região telomérica dos braços longos. Os cromossomos sexuais apresentaram-se completamente heterocromáticos. Um dos homólogos do par 6 apresentou uma marcação pericentromérica e outra pequena quantidade na porção distal do pequeno braço curto, acima da região organizadora de nucléolo (Figura 4c, 9 e 10). A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente dos maiores pares autossômicos (Figura 4d). 23

Tabela 2: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas para machos e fêmeas de Marmosa murina (identificados pela numeração de campo) coletados em Balbina. Local Sexo Indivíduos UHE Balbina Macho Fêmea 2n 12 13 14 15 Total de células Número diplóide Número fundamental CEF 04 4 8 13 5 30 14 22 CEF 08 2 8 10 1 21 14 22 CEF 18 5 7 18 0 30 14 22 CEF 28 5 10 14 1 30 14 22 CEF 32 3 8 19 0 30 14 22 CEF 16 2 4 23 1 30 14 22 CEF 27 4 7 19 0 30 14 22 Total 25 52 115 8 201 % 12,6 25,8 57,6 4,0 24

Figura 4. Cariótipos de Marmosa murina (CEF 08): a) em coloração convencional; b) regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por nitrato de prata; c) após bandeamento C; d) após bandeamento G. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. Barra igual a 5 µm. 25

3.1.3 Didelphis marsupialis 2n=22; NFa=20 Esta espécie foi encontrada nas três áreas de coleta e um total de 17 indivíduos foram analisados, sendo sete machos e quatro fêmeas da REMAN, dois machos e duas fêmeas do rio Cuieiras e um macho e uma fêmea da UHE de Balbina, totalizando 465 células observadas para a determinação do número diplóide. Todos os indivíduos desta espécie, das três localidades, apresentaram 2n=22, NFa=20 e fórmula cariotípica: 20a + XX/XY (Tabela 3). Três pares foram de tamanho grande e os demais de tamanho médio. O cromossomo X é um acrocêntrico pequeno e o Y puntiforme (Figura 5a). As regiões organizadoras de nucléolo foram evidenciadas em três pares cromossômicos, provavelmente, nos pares 5,7 e 8. Nos pares 5 e 8 as marcações foram observadas em posição terminal dos braços longos, enquanto que no par 7 foram observadas marcações terminais em ambos os braços (Figura 5b). Porém, quanto à atividade, as marcações variaram de quatro a oito. A heterocromatina constitutiva apresentou-se num padrão difuso e se distribuiu na região centromérica de todos os cromossomos e na região telomérica de alguns, sendo que em um par foi mais evidente. No par sexual, o X marcou o centrômero e o Y apresentou-se totalmente heterocromático (Figura 5c). A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente dos maiores pares autossômicos (Figura 5d). 26

Tabela 3: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas para machos e fêmeas de Didelphis marsupialis (identificados pela numeração de campo) por área de coleta. Local Sexo Indivíduos UHE Balbina REMAN (Manaus) PAREST rio Cuieiras 2n 20 21 22 23 Total de células Número diplóide Número fundamental Macho CEF 13 1 1 16 0 18 22 20 Fêmea CEF 05 7 5 21 2 35 22 20 Fêmea Macho Macho Fêmea Total 8 6 37 2 53 % 13,33 10,00 61,66 3,33 EE 174 3 3 11 2 19 22 20 EE 224 3 4 20 0 27 22 20 EE 227 1 4 17 0 22 22 20 EE 250 3 4 17 3 30 22 20 EE 155 3 4 20 3 30 22 20 EE 173 8 5 15 2 30 22 20 EE 183 5 4 18 3 30 22 20 EE 190 7 5 12 0 24 22 20 EE 232 5 5 15 5 30 22 20 EE 237 3 6 19 2 30 22 20 EE 249 2 4 24 0 30 22 20 Total 42 47 188 20 297 % 14,14 17,60 63,29 6,73 EE 203 2 2 21 5 30 22 20 EE 206 1 1 9 5 16 22 20 EE 197 2 2 25 1 30 22 20 EE 204 4 2 23 1 30 22 20 Total 9 9 78 12 108 % 8,33 8,33 72,22 11,11 27

Figura 5. Cariótipos de Didelphis marsupialis (EE 249): (a) em coloração convencional; (b) regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por Nitrato de Prata; (c) após bandeamento C; (d) após bandeamento G. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. Barra igual a 5 µm. 28

3.2. Ordem Rodentia - Família Echimyidae Foram analisados citogeneticamente 11 indivíduos do gênero Proechimys, sendo dois machos e uma fêmea da REMAN, dois machos da PAREST- rio Cuieiras, identificadas como Proechimys cuvieri, e quatro machos e duas fêmeas da UHE Balbina, identificados como Proechimys guyannensis, totalizando 314 células para a determinação do número diplóide (Tabela 4). Dois números diplóides foram detectados: 2n=28 cromossomos para os indivíduos da REMAN e da PAREST- rio Cuieiras e 2n=46 para os indivíduos da UHE Balbina. Tabela 4: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas por locais de coleta para machos e fêmeas do gênero Proechimys (identificados pela sua numeração de campo). Local Sexo Indivíduos Número diplóide 26 27 28 29 30 44 45 46 47 Total de células Número fundamental autossômico REMAN (Manaus) PAREST - rio Cuieiras UHE Balbina Macho Fêmea Macho Macho Fêmea EE 238 4 5 17 3 1 30 46 EE 251 6 6 15 2 1 30 46 EE 252 3 3 13 1 0 20 46 Total 13 14 45 6 2 80 % 16,2 17,5 56,3 7,5 2,5 EE 217 7 4 12 3 4 30 46 EE 218 6 8 15 1 0 30 46 Total 13 12 27 4 4 60 % 21,6 20,0 45,0 6,7 6,7 CEF 01 4 9 17 0 30 52 CEF 10 4 5 20 1 30 52 CEF 12 7 7 16 0 30 52 CEF 15 6 6 18 0 30 52 CEF 14 9 7 14 0 30 52 CEF 24 7 6 11 0 24 52 Total 37 40 96 1 174 % 21,2 23,0 55,2 0,6 29

3.2.1 Proechimys cuvieri - 2n=28; NFa=46 Os indivíduos coletados na PAREST - rio Cuieiras (dois machos) e na REMAM - Manaus (dois machos e uma fêmea) apresentaram número diplóide 2n=28 cromossomos e NFa=46, sendo que os autossomos consistiram de: sete pares metacêntricos, dois pares submetacêntricos e três acrocêntricos. O cromossomo X apresentou-se como um acrocêntrico médio e o Y como um cromossomo puntiforme (fórmula cariotípica: 14m+4sm+2st+6a+XX/XY). Os maiores cromossomos do cariótipo consistiram de um par metacêntrico (par 1), um par subtelocêntrico (par 10) e um par acrocêntrico (par 11) (Figura 6a). A região organizadora de nucléolo (RON) localizou-se intersticialmente, nos braços longos de um par de cromossomos submetacêntricos (par 9). Em algumas metáfases em coloração convencional, essa região foi facilmente reconhecida como uma constrição secundária (Figura 6b). A heterocromatina banda C positiva foi observada na região centromérica de sete pares autossômicos: os três pares metacêntricos pequenos, o par 9 submetacêntrico e todos os acrocêntricos. Porém, foi observado um heteromorfismo quanto ao tamanho dos blocos heterocromáticos do par portador da RON (par 9). Nos cromossomos sexuais, apenas o X apresentou um bloco heterocromático proximal no braço longo fracamente corado (Figura 6c). A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente dos maiores pares cromossômicos. O padrão observado mostrou-se idêntico em todos os indivíduos analisados (Figura 6d). 30

Figura 6. Cariótipos de Proechimys cuvieri (EE 238): (a) coloração convencional; (b) regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por Nitrato de Prata, em conjunto à constrição secundária em Giemsa; (c) após bandeamento C; (d) após bandeamento G. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. Barra igual a 5 µm. 31

3.2.2 Proechimys guyannensis - 2n=46; NFa=50 Os indivíduos coletados na UHE Balbina (quatro machos e duas fêmeas) apresentaram número diplóide igual a 46 cromossomos, número de braços autossômicos NFa=50, sendo que os autossomos consistiram de: dois pares metacêntricos, um submetacêntrico e 19 pares acrocêntricos. Os cromossomos X e Y são acrocêntricos, sendo o Y aproximadamente metade do tamanho do X (fórmula cariotípica 4m+2sm+38a+XX/XY). Os maiores cromossomos foram os pares acrocêntricos 4, 5 e 6 (Figura 7a). A região organizadora de nucléolo localizou-se intersticialmente no braço longo de um par submetacêntrico (par 3), sendo que a constrição secundária não foi observada em todas as metáfases, em coloração convencional (Figura 7b). A banda C positiva foi observada na região centromérica e se distribuiu entre 10 pares cromossômicos, sendo um par metacêntrico, um par submetacêntrico e os demais acrocêntricos, e nos cromossomos sexuais. Nos autossomos e no cromossomo X a heterocromatina localizou-se na região pericentromérica enquanto o Y apresentou-se totalmente heterocromático (Figura 7c). A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos e neste citótipo a RON, presente no terceiro par, mostrou-se negativa para banda G (Figura 7d). 32

Figura 7. Cariótipos de Proechimys guyannensis (CEF 01): (a) em coloração convencional; (b) regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por Nitrato de Prata; (c) após bandeamento C; (d) após bandeamento G. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. 33

4. Discussão Os primeiros dados citogenéticos de marsupiais remontam ao trabalho de Jordan (1911) apud Reig et al. (1977) sobre a espermatogênese de Didelphis virginiana. Desde então, dados citogenéticos de espécies de marsupiais australianos e americanos têm sido gerados e atualmente são conhecidos os cariótipos de aproximadamente 180 espécies. Considerando-se apenas a família Didelphidae, três números diplóides são encontrados: 2n=14, 18 e 22, sendo que o 2n=14 é o mais freqüente tanto nesta família como nos demais marsupiais (Reig et al., 1977; Hayman, 1990, Palma & Yates, 1996; Carvalho et al., 2002). Os cariótipos dos marsupiais possuem um alto grau de conservação e isso pode ser observado pela grande similaridade dentro de cada número diplóide e entre eles (Reig et al., 1977; Svartman & Vianna-Morgante, 1998; Carvalho et al., 2002). Por exemplo, os cariótipos com 2n=14 cromossomos são muito similares em sua estrutura, variando apenas nos dois pares menores do conjunto autossômico, quanto à posição do centrômero, registrando-se diversas morfologias. Esse grau de conservação também pode ser observado na porção eucromática dos cromossomos como demonstrado por Svartman & Vianna- Morgante (1999) com a aplicação de técnicas de hibridização in situ,. 4.1. Micoureus demerarae e Marmosa murina 2n=14 No presente trabalho foram analisadas duas espécies com número diplóide igual a 14: Micoureus demerarae e Marmosa murina (Figuras 3 e 4). O gênero Marmosa é considerado de taxonomia problemática e muitas espécies, inclusive Micoureus demerarae, foram anteriormente alocadas neste táxon, que segundo o conceito de Tate (1933) chegou a englobar o que é hoje reconhecido como pertencente a cinco gêneros distintos de marsupiais didelfídeos de pequeno porte. A semelhança entre Marmosa e Micoureus é observada na morfologia externa, onde indivíduos adultos podem ser confundidos com jovens da outra espécie e vice-versa, assim como na morfologia craniana dessas espécies (Voss & Jansa, 2003; da Silva comunicação pessoal). Já em relação aos seus cariótipos, podem ser facilmente identificados. A diferença entre os dois 34

cariótipos está evidente tanto na coloração convencional como no padrão de banda C, principalmente nos pares cromossômicos sexuais (Figura 8). Figura 8. Posição do centrômero e padrão de heterocromatina dos pares 5, 6 e sexuais, de Micoureus demerarae e Marmosa murina. Em M. demerarae tanto o par cinco quanto o seis são acrocêntricos com grandes blocos de heterocromatina constitutiva na região centromérica, enquanto que em M. murina o par cinco é subtelocêntrico e o par seis é acrocêntrico e os blocos de heterocromatina são muito pequenos. Ainda, em Marmosa murina foi encontrado um heteromorfismo entre os homólogos do par seis. Essa diferença revela-se como um pequeno braço acima do centrômero em um dos homólogos em coloração convencional, mas também na posição da RON, que em um dos homólogos está entre dois blocos de heterocromatina e no outro 35

ocupa a região distal, e na banda C, que em um dos homólogos aparece em um bloco centromérico e outro terminal, e no outro sendo apenas centromérico (Figura 9). Figura 9. Par seis de Marmosa murina em coloração convencional, impregnação por Ag- NO 3 e banda C. Considerando as semelhanças entre o cariótipo de M. murina apresentado e o registrado por Reig et al. (1977) onde o par 6 possui morfologia acrocêntrica, parece plausível apontar que o evento gerador desse heteromorfismo foi uma inversão pericêntrica que alterou a posição da RON e a distribuição da heterocromatina constitutiva em um dos homólogos (Figura 10). Figura 10. Esquema mostrando a inversão pericêntrica em um dos homólogos do par seis. As faixas pretas representam os blocos heterocromáticos e os círculos, a região organizadora de nucléolo. 36

Uma outra característica que permite diferenciar estas duas espécies é o padrão geral da heterocromatina constitutiva, onde M. demerarae apresenta grandes blocos heterocromáticos na região centromérica de todos os autossomos e do X, mas o Y não é heterocromático. Por outro lado, M. murina apresentou heterocromatina na região centromérica de todos os autossomos e do X, porém os blocos são tênues e o Y é totalmente heterocromático. Como mostrado nas figuras 3 e 4, as duas espécies têm um sistema múltiplo de regiões organizadoras de nucléolo, estando uma localizada na porção terminal dos braços longos do par cinco e a outra na porção terminal dos braços curtos do par seis. Na literatura foram descritos outros dois padrões para M. murina procedentes de uma região que engloba uma vasta área que se estende desde o Peru e noroeste da Amazônia e através do Amapá e Tocantins até o estado do Pernambuco, no nordeste do Brasil. O primeiro foi descrito por Palma & Yates (1996), para indivíduos coletados em Goiás (Serra da Mesa), onde eles observaram marcações apenas nos braços curtos do par seis, enquanto Souza et al. (1990) encontraram marcações nos braços curtos dos pares três e cinco e nos braços longos do par seis em indivíduos coletados em Pernambuco. Já em M. demerarae a posição da região organizadora de nucléolo não foi diferente da registrada na bibliografia, em toda sua distribuição já analisada (Casartelli et al., 1986; Souza et al., 1990; Palma & Yates, 1996; Svartman & Vianna-Morgante, 1999). A banda G possibilitou emparelhar corretamente os pares de cromossomos e reconhecer algumas homeologias entre os pares das duas espécies, sobretudo nos maiores pares. A comparação dos padrões de bandas obtidos neste estudo com os da literatura foi dificultada devido à baixa resolução das bandas obtidas para os espécimes analisados no presente trabalho. Os cromossomos sexuais também possibilitam distinguir as duas espécies. Em M. demerarae os cromossomos X e Y são acrocêntricos e em M. murina o X é submetacêntrico e o Y é puntiforme (Figura 8). A morfologia do par sexual de M. demerarae não diferenciou dos dados disponíveis na literatura, porém para M. murina a literatura apresenta diferentes morfologias para os cromossomos sexuais. Souza et al. (1990) descreveram, em indivíduos coletados no estado de Pernambuco, o X como acrocêntrico e o Y puntiforme; Palma & Yates (1996) descreveram o X como metacêntrico 37

e o Y como acrocêntrico em indivíduos coletados em duas localidades da Serra da Mesa; Carvalho et al. (2002) descreveram o X e o Y como acrocêntricos, em indivíduos coletados nos estados do Amapá, Tocantins e Goiás (Quadro 1). Os cromossomos sexuais dos indivíduos de M. murina analisados no presente trabalho são semelhantes aos encontrados por Reig et al. (1977) em indivíduos coletados em três localidades no Peru e Venezuela, nos quais o X é submetacêntrico e o Y é acrocêntrico. Portanto, quanto aos cromossomos sexuais de M. murina, quatro formas foram descritas, sendo que apenas em Serra da Mesa, Goiás, duas dessas formas foram encontradas juntas sendo as demais de localidades bastante distantes entre si. Assim, embora os cariótipos com 2n=14 cromossomos apresentem uma estrutura conservada, a presença de rearranjos não Robertsonianos do tipo inversão (paracêntricas e pericêntricas) é evidente. Estes rearranjos aparentemente estão ocorrendo principalmente nos menores pares do conjunto autossômico e nos sexuais. Porém, apenas um estudo mais amplo envolvendo dados biogeográficos, morfológicos, moleculares e citogenéticos poderá avaliar o real significado destes rearranjos. 38

Quadro 1: Formas de cromossomos sexuais descritos para M. murina. X Formas Y Localidade Referência Goiás (Serra da Mesa), Brasil Palma & Yates, (1996) Amapá, Tocantins e Goiás (Serra da Mesa), Brasil Carvalho et al. (2002) Pernambuco Souza et al. (1990) Peru, Venezuela e UHE Balbina (Amazonas, Brasil) Reig et al. (1977) e presente trabalho Entretanto, alguns fatores devem ser considerados antes de se concluir que exista diferenciação intraespecífica em Marmosa murina. Como Bueno et al. (1989) observaram, o estado de condensação pode dificultar a determinação da morfologia dos cromossomos de dois braços. Por outro lado, existem problemas na taxonomia e sistemática do gênero Marmosa e estudos recentes apontam para a falta de suporte desse gênero como um táxon monofilético (Voss & Jansa, 2003; Voss et al., 2004). Historicamente, muitas espécies já foram inseridas e removidas desse gênero, ilustrando a problemática do grupo e, principalmente, como para a grande maioria das espécies de pequenos marsupiais didelfídeos, os limites entre as espécies ainda não foram devidamente estabelecidos. 39

4.2 Didelphis marsupialis 2n = 22 No presente trabalho a única espécie analisada com 2n=22 cromossomos foi Didelphis marsupialis. Este número diplóide também é encontrado nas demais espécies de maior porte dentre os didelfídeos como nos gêneros: Lutreolina, Philander, Chironectes, além de outras espécies de Didelphis e em uma espécie de catita mexicana, Tlacuatzin canescens (Engstrom and Gardner, 1988; Zarza et al., 2003). Esses cariótipos são compostos por 10 pares de autossomos acrocêntricos com uma diminuição gradual de tamanho, sendo mais acentuada entre os pares três e quatro. Os cromossomos sexuais também apresentam variação interespecífica quanto ao tamanho relativo e à posição do centrômero, mas geralmente são menores que os autossomos. Os cromossomos X e Y são acrocêntricos, exceto em Lutreolina crassicaudata, onde o X é metacêntrico e em Philander frenata, onde o Y é metacêntrico (Reig et al., 1977). A heterocromatina não esteve presente em todos os cromossomos e os blocos heterocromáticos localizaram-se de forma difusa na região centromérica de alguns pares, como observado por Carvalho et al. (2002) em indivíduos do Amapá, Pará e Bahia, e de forma diferente da descrita por Svartman & Vianna-Morgante (1999), em que os blocos estiveram na posição distal. Yonenaga-Yassuda et al. (1982) observaram uma variação de 1 a 9 regiões organizadoras de nucléolo para essa espécie, mas a variação encontrada nos espécimes do presente trabalho foi semelhante àquela registrada por Svartman & Vianna-Morgante (2003), consistindo de quatro a oito marcações. Os últimos autores verificaram, com a utilização de sondas de rdna, que D. marsupialis possui oito cístrons ribossomais presentes nos cromossomos e que estes são menores nos braços curtos, mostrando que existe uma expressão diferencial entre essas regiões. Os pares 5 e 7 foram descritos como portadores das RONs originalmente por Yonenaga-Yassuda et al. (1982), com a utilização da precipitação por Nitrato de Prata e reconhecimento pela banda G. Aqui, estes mesmos pares e adicionalmente o par 8 apresentaram marcações. Devido a baixa qualidade do padrão de bandas G obtidas neste estudo, não foi possível perceber exatamente quais pares corresponderiam aos portadores 40

das RONs entre os números diplóides 2n=14 e 2n=22. Svartman & Vianna-Morgante (2003) concluíram que o par 7 do cariótipo 2n=22 corresponderia ao par 6 do 2n=14 enquanto o par 5 estaria na mesma posição em ambos os cariótipos. Evolução cromossômica na Família Didelphidae O número diplóide 2n=22 cromossomos foi apontado inicialmente como o ancestral, porém esta hipótese não pôde ser sustentada devido aos poucos dados dos primeiros estudos (Reig et al., 1977). Posteriormente, comparações dos padrões de bandeamento G sugeriram que o número diplóide ancestral seria o 2n=14 cromossomos e o 2n=22 teria sido originado por uma série de eventos de fissão cêntrica e que este último número diplóide poderia ter originado novos cariótipos inclusive 2n=14, diferente do cariótipo básico, por fusões (Hayman, 1990). Entretanto, Svartman & Vianna-Morgante (1998), a partir de estudos de hibridização in situ, sugeriram que o cariótipo dos didelfídeos teria derivado do número diplóide 2n=22 por fusões cêntricas, uma vez que seqüências teloméricas foram identificadas próximas aos centrômeros de cromossomos com dois braços dos cariótipos com 2n=14. Nesse panorama o 2n=18 representaria uma forma intermediária. Carvalho & Mattevi (2000) observaram três diferentes padrões de sinais de sondas teloméricas no grupo dos 2n=14. Estes autores interpretaram que provavelmente a existência desses padrões se deve à não-retenção dessas seqüências em algumas espécies e reafirmam a ancestralidade dos cariótipos 2n=22. Voss & Jansa (2003) realizaram uma ampla análise filogenética da família Didelphidae e nessa análise as espécies portadoras do número diplóide igual a 22 cromossomos agruparam-se em um único grupo monofilético, com exceção de Tlacuatzin canescens, anteriormente considerada como pertencente ao gênero Marmosa, tendo sido retirada deste gênero. Ainda, nessa análise é possível observar que o número diplóide igual a 14 está presente em várias espécies de outros grupos, inclusive naquelas consideradas mais basais. Infelizmente o uso de dados citogenéticos em estudos filogenéticos ainda é muito restrito, porém a cada cariótipo analisado, não se pode negar a importância dos rearranjos cromossômicos no processo evolutivo dos marsupiais, tornando-se necessária uma 41

interpretação desses dados como um caráter passível de ser analisado dentro de um contexto filogenético. 42

4.3 Gênero Proechimys As relações filogenéticas entre as espécies de Proechimys ainda permanecem incertas, principalmente nos seus níveis mais basais (Patton & Reig, 1989; da Silva 1998; Patton et al., 2000). A falta de uma hipótese filogenética dificulta as tentativas de propor um modelo de evolução cromossômica para este grupo. Tentando contribuir para essas e outras questões sobre a sistemática desses organismos, estudos morfológico e molecular estão sendo feitos em conjunto com o presente trabalho (da Silva, dados não publicados; Schetino, da Silva & Porto, dados não publicados, respectivamente). Eler (2007), em uma revisão da literatura dos dados citogenéticos do gênero Proechimys, incluindo os seus, encontrou 57 formas cariotípicas descritas para 35 espécies nominais, sendo que o número diplóide variou de 14 a 62 cromossomos. Nesta revisão foi observado que grupos de espécies (sensu Patton, 1987) apresentam mais de um número diplóide e mais de um número fundamental, assim como uma mesma espécie apresenta diversos citótipos ou um mesmo número diplóide é encontrado em mais de um táxon, evidenciando-se a grande diversidade cariotípica nesse gênero. 4.3.1 Proechimys cuvieri 2n=28 O número diplóide 2n=28 está presente em cinco espécies pertencentes a três grupos sensu Patton (1987): em P. quadruplicatus do grupo goeldii; em P. longicaudatus, P. brevicauda e Proechimys sp.1 do grupo longicaudatus e em P. cuvieri do grupo cuvieri (Eler 2007). Alguns desses grupos de espécies possuem mais de um número diplóide, mas considerando apenas as formas com 2n=28, 15 fórmulas cromossômicas foram verificadas e o número fundamental variou de 44 a 50. Segundo Patton (1987), Proechimys cuvieri está distribuído na bacia amazônica, desde o sudeste do Peru e Acre, Brasil (a oeste) até a região das Guianas e no Pará, Brasil (a leste). Esta área se sobrepõe com as dos grupos: goeldii, longicaudatus, simonsi e guyannenesis. Desses, os únicos que possuem citótipos semelhantes ao do presente trabalho (2n=28 e NFa=46) são os grupos cuvieri e longicaudatus. Apesar das similaridades na fórmula cromossômica, os cromossomos sexuais apresentam diferenças no tamanho e na posição do centrômero. Assim, a morfologia dos cromossomos sexuais e o padrão de distribuição da heterocromatina 43

constitutiva permitiram relacionar os espécimes do presente trabalho com os cariótipos descritos para indivíduos do rio Jaú (Patton et al., 2000), com os indivíduos da UHE Balbina, rio Uatumã analisados por Maia & Langguth (1993), e indivíduos do vale do Jarí (Eler, 2007), todos classificados como do grupo cuvieri. Devido às similaridades cariotípicas observadas entre os exemplares deste estudo e aqueles descritos por esses autores e considerando as análises em andamento com dados moleculares e morfológicos (respectivamente, Schetino, da Silva & Porto, com. pess.; da Silva, com. pess.) dos mesmos indivíduos aqui estudados, esses espécimes foram classificados como pertencentes ao grupo cuvieri. Embora Patton (1987) considere o grupo cuvieri como monotípico, atualmente são registradas três formas cariotípicas para este grupo, todas possuindo 2n=28 cromossomos, mas variando no número fundamental: NFa=46 foi encontrado em indivíduos coletados em quatro localidades na Amazônia central (UHE de Balbina no rio Uatumã, no rio Jaú, REMAN-Petrobrás (município de Manaus) e rio Cuieiras), assim como em uma localidade no leste amazônico ao norte do rio Amazonas, no vale do Jarí; NFa=48 foi encontrado também no leste amazônico mas ao sul do rio Amazonas em Altamira, Pará (Brasil); e NFa=50 foi encontrado em localidades tão distantes quanto o alto rio Juruá (Acre, Brasil) e Caiena, na Guiana Francesa (Figura 11) (Reig et al., 1979; Maia & Langguth, 1993; Patton et al., 2000; Eler 2007 e presente trabalho). Se compararmos os dados do presente trabalho com aqueles do rio Jaú (Patton et al., 2000), considerando apenas a coloração convencional, verificamos que estes cariótipos são muito semelhantes entre si e diferem dos indivíduos da UHE de Balbina (Maia & Langguth, 1993) e do vale do Jari (Eler, 2007) na morfologia do par sexual. O indivíduo analisado por Eler (2007), uma fêmea, possui o cromossomo X metacêntrico. Já nos indivíduos analisados no presente trabalho (REMAN e rio Cuieiras) e nos do rio Jaú, o X é acrocêntrico e o Y é puntiforme, enquanto que nos indivíduos da UHE Balbina X e Y são acrocêntricos (Maia & Langguth,1993). Porém, quando comparamos os padrões de banda C, verificamos que os dados do presente trabalho (REMAN e rio Cuieiras) são diferentes em relação aos espécimes da UHE Balbina, onde os pares cinco e seis não possuem heterocromatina, os pares quatro e onze são polimórficos, o X apresenta dois blocos heterocromáticos, um proximal e outro 44

centromérico e o Y é totalmente heterocromático. Entretanto, o padrão de banda C autossômico se assemelha ao descrito para os indivíduos do vale do Jari (Eler, 2007). Não existem dados de banda C para os indivíduos do rio Jaú. Figura 11. Distribuição dos citótipos de Proechimys cuvieri. (a) 2n=28, NFa=50, rio Juruá, Acre, Brasil (Patton et al., 2000) e Caiena, na Guiana Francesa (Reig et al., 1979); (b) 2n=28, NFa=46, rio Uatumã (Maia&Langguth, 1993), rio Jaú (Patton et al., 2000), rio Cuieiras e REMAN-Manaus (presente trabalho) e vale do Jari (Eler, 2007); (e) 2n=28, NFa=48, rio Xingu, Pará, Brasil (Patton et al., 2000). Aparentemente, o padrão de distribuição geográfica para estes citótipos não sugere um cline, uma vez que NFa=50 foi encontrado em localidades situadas no oeste e leste da Amazônia na Guiana Francesa, correspondendo aproximadamente aos extremos da distribuição do grupo, enquanto NFa=48 está no leste ao sul do eixo Solimões-Amazonas e NFa=46 está na Amazônia central ao norte do eixo Solimões-Amazonas. Assim, apesar da monotipia do grupo cuvieri sugerida por Patton (1987), a presença de rearranjos pode estar indicando que este grupo é na realidade formado por com um complexo de espécies. De fato, análises moleculares do gene mitocondrial citocromo b realizadas por Patton et al., 45

(2000) e por Schetino, da Silva & Porto (dados não publicados) indicam a existência de unidades regionais bastante diferenciadas cujas seqüências apresentam níveis de divergência similares aos apresentados entre outras espécies de Proechimys. Esses resultados reforçam a necessidade de ampliação da amostragem em toda a área de distribuição do grupo cuvieri associada a estudos genéticos e morfológicos a fim de elucidar a composição específica do grupo. 4.3.2 Proechimys guyannensis 2n=46 No grupo guyannensis existem quatro números diplóides descritos (30, 38, 40 e 46) e uma variação do número fundamental de 50 a 56 (Reig & Useche, 1976; Reig et al., 1979; Gardner & Emmons, 1984; Weksler et al., 2001; Machado et al., 2005; Bonvicino et al., 2005, Eler, 2007). Weskler et al (2001: Tab. 1) também associaram o número diplóide 2n=40 encontrado em P. pattoni e P. gardneri (da Silva, 1998) ao grupo guyannensis, mas não apresentam explicação para tal associação, que não parece ser apoiada pelos dados existentes. Do mesmo modo, esses mesmos autores associam espécimes de Balta, Peru, com 2n=40 ao grupo guyannensis, provavelmente em função da identificação taxonômica original realizada por Gardner & Patton (1972). Entretanto, posteriormente, Patton (1987) inclui os animais de Balta no grupo cuvieri e da Silva (1998) considera esses animais como pertencentes a P. pattoni. Adicionalmente, também foi registrada a ocorrência do número diplóide 2n=44 para a região ao norte de Manaus (Machado et al., 2005), mas devido à inexistência de espécime testemunho associado a esse cariótipo, apenas novas coletas de animais com esse mesmo número diplóide permitirão avaliar de forma definitiva a associação desse cariótipo ao grupo guyannensis. O cariótipo de 46 cromossomos descrito no presente trabalho foi encontrado em animais provenientes da UHE de Balbina, localidade situada dentro da área de distribuição geográfica dos grupos goeldii, guyannensis e cuvieri (Patton, 1987). Este número diplóide já foi identificado em outros três táxons de Proechimys, como P. guairae do grupo trinitatis, com variação no NFa: 68, 70 e 72 (George & Weir, 1973; Reig & Useche, 1976; Aguilera & Corti, 1994). Porém, a forma encontrada no presente trabalho é idêntica, tanto em relação ao número diplóide (2n=46) quanto ao número fundamental (NFa=50), àquela descrita por Bonvicino et al. (2005) para os espécimes do 46

rio Jatapu (Roraima, Brasil). Devido às similaridades cariotípicas observadas entre os exemplares deste estudo e aqueles descritos por Bonvicino et al. (op. cit.), e considerando a associação destes exemplares com outras espécies do mesmo grupo, demonstrada por análises moleculares e morfológicas em andamento (Schetino, da Silva & Porto, comunicação pessoal; da Silva, comunicação pessoal), os espécimes aqui analisados foram classificados como pertencentes ao grupo guyannensis. Figura 12. Distribuição de três cariótipos de P. guyannensis: (a) 2n-44; NFa=52, Acampamento Cabo Frio, Manaus (Machado et al., 2005); (b) 2n=38, NFa=52, rio Negro Amazonas e vale do Jari, Pará (Bonvicino et al., 2005; Eler, 2007); (c) 2n=46, NFa=50, rio Jatapu (Bonvicino et al., 2005) e UHE Balbina (presente trabalho). Comparando o cariótipo (2n=46, NFa=50) analisado neste trabalho com o descrito por Machado et al. (2005) com 2n=44 e NFa=52 da região de Manaus, muitas similaridades 47