Instituto Superior Técnico de Lisboa Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Bioquímica e Biologia Molecular 1º semestre 2015/2016

Instituto Superior Técnico de Lisboa Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Bioquímica e Biologia Molecular 1º semestre 2015/2016 TP1 - Titulação potenciométrica de Aminoácidos TP2 - Determinação da concentração de uma proteína pelo método de Bradford. Análise de proteínas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) Ana Barriga Nº 80865 Diana Serrano Nº 81860 Miguel Tenreiro Nº 81856 1

Índice Página Resumo...3 Fundamentos Teóricos e Experimentais 4 Resultados..7 Discussão..13 Anexos...20 Bibliografia.22 2

Resumo As proteínas, macromoléculas biológicas, são constituídas por aminoácidos. Existem, no total, 20-α aminoácidos fundamentais, sendo estes determinados pelo código genético. Cada um dos aminoácidos contém um carbono central ou α que se liga a um grupo amina, NH 2, um grupo carboxilo, COOH, um átomo de hidrogénio e um grupo R, variável de aminoácido para aminoácido. As proteínas desempenham variados papéis na célula, desde o de suporte/estrutura, ao catalítico e regulador da expressão génica, sendo o seu estudo de grande interesse para a Bioquímica. A funcionalidade das proteínas está diretamente relacionada com a sua estrutura: arranjos 3D (estrutura terciária) ou mesmo associação de várias proteínas (estrutura quaternária) viabilizam e facilitam a função das proteínas, conferindo-lhes maior estabilidade, cooperatividade e eficiência na sua atividade. No TP1 foi realizada uma titulação potenciométrica para dois aminoácidos: a alanina e o ácido glutâmico. Esta tem com o objetivo a determinação, a partir do método da derivada, os valores de pka da alanina e do ácido glutâmico. Os valores de pka da alanina obtidos foram pka 1 = 2,71 e pka 2 = 9,44. A partir destes dados foi possível calcular o ponto isoelétrico deste aminoácido, pi = 6,33. Os valores de pka do ácido glutâmico, obtidos foram pka 1 = 2,65, pka R = 4,18 e pka 2 = 9,73. No TP2 foi determinada a concentração de soluções de Azurina, Catalase, BSA e Ovalbumina pelo método de Bradford, bem como a estimativa do seu peso molecular por eletroforese SDS-PAGE. A determinação da concentração da Azurina, Catalase, BSA e Ovalbumina foi feito com recurso a valores de absorvância experimentais, obtendo-se, respetivamente, os seguintes valores: 440,33 mg/l, 468,67 mg/l, 178,67 mg/l, 281,17 mg/l e 257,00 mg/l. A técnica de eletroforese, que se baseiam na sujeição das proteínas a um campo elétrico e consequente migração em função da sua densidade de carga, permitiu determinar o peso molecular das soluções de proteínas utilizadas por comparação da mobilidade eletroforética com a de proteínas de massa molecular conhecida (peso molecular padrão). Comprovou-se que quanto maior for o peso molecular, menor é a distância percorrida no gel. Os valores obtidos para a Azurina, Catalase, BSA e Ovalbumina foram, respetivamente, 15,58 KDa, 60,08 KDa, 60,74 KDa e 46,85 KDa, para um primeiro gel; e 15,90 KDa, 57,87 KDa, 60,04 KDa e 46,85 KDa, para um segundo gel. 3

Fundamentos Teóricos e Experimentais Titulação potenciométrica de Aminoácidos Na 1ª experiência foi estudado o comportamento ácido-base de dois aminoácidos: a alanina e o ácido glutâmico (ver Figura 1). A ph 7 (ph neutro em sistemas biológicos), o aminoácido apresenta o grupo amina protonado e o grupo carboxilo desprotonado, para além de que o seu grupo R também pode se encontrar protonado/desprotonado dependendo da sua constituição. Assim, aminoácidos que não contenham um grupo adicional ácido ou básico no grupo R comportam-se como ácidos dipróticos. É o caso da alanina. Por sua vez, o ácido glutâmico possui um grupo R ácido, comportando-se como ácido triprótico. No primeiro caso, na titulação potenciométrica com uma base forte gera-se uma curva de dois patamares; no segundo caso a curva tem 3 patamares. No laboratório precedeu-se à titulação potenciométrica destes dois aminoácidos com o NaOH com o intuito de determinar os valores de pka. A Figura 2 representa a curva de titulação típica para um aminoácido que se comporta como ácido diprótico, sem grupo R ionizável. Esta é uma curva de dois patamares pelo que existirão dois valores de pka. Num aminoácido, pka 1 corresponde à ionização do grupo carboxilo e pka 2 corresponde à ionização do grupo amina. Os pontos A e C representam os pontos de equivalência da titulação, em que a concentração de ácido é igual à de base. Atendendo à equação de Handerson-Hasselbach ph = pka + log ( [Base] [Ácido] ) Figura 1_Estrutura da alanina (em cima); Estrutura do ácido glutâmico (em baixo). Figura 2_Curva de titulação típica de dois patamares para um aminoácido. conclui-se que os pka pretendidos correspondem aos valores de ph medidos nos pontos A e C, i.e., a ordenada desses pontos. A determinação desses pontos é feito com base no método da derivada. Sabe-se que os pontos de inflexão correspondem a máximos da 1ª derivada, pelo que desenhando a derivada da curva de titulação facilmente se determina as coordenadas dos pontos B e D. A partir daí, determinam-se as coordenadas de A e C (pontos médios) e, consequentemente, o valor pretendido. 4

Determinação da concentração de uma proteína pelo método de Bradford. Análise de proteínas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) As técnicas de electroforese constituem na migração de iões sob a ação de um campo elétrico. A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) de proteínas é um método rápido e sensível para analisar a composição de misturas proteicas complexas (crude), utilizando uma propriedade comum a todas elas: apresentam carga elétrica global ao estarem num meio cujo ph é diferente do ponto isoelétrico. Assim, submetendo a mistura a um campo elétrico, é possível provocar a sua migração. A PAGE utiliza géis de poliacrilamida (polímero de acrilamida) que permitem a separação molecular segundo tamanho/forma bem como a mobilidade electoforética. Em gel, a mobilidade electoforética de moléculas de menores dimensões é bastante superior às de maiores dimensões. Por sua vez, o ph do gel é suficientemente elevado (~ 9) para que a grande maioria das proteínas fique com carga elétrica negativa, movendo-se em direção ao polo positivo do elétrodo quando a corrente estiver ligada. Isto deve-se à adição Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) [CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 O SO 3 ]Na + detergente fortemente negativo (rodeia as cadeias proteicas e confere-lhes carga negativa) e desnaturante. Deste modo, a electroforese em gel SDS-PAGE permite garantir que migração electroforética das proteínas dependerá apenas da razão carga/massa. Tal como é ilustrado na Figura 3, no final obtém-se as proteínas dispostas segundo o seu peso molecular. As bandas são visualizadas recorrendo a corantes como o nitrato de prata ou o azul de coomassie. Na figura as colunas 2, 10 e 17 contêm amostras de massa molecular padrão que servirão para elaborar a reta de calibração do logaritmo da massa molecular em função da mobilidade relativa das proteínas, i.e., distância percorrida. Consequentemente, será possível determinar uma estimativa para a massa molecular de cada uma das proteínas da mistura e, caso for necessário, proceder à sua identificação. Figura 3_Aspecto final da SDS-PAGE com azul de coomassie. No laboratório, pipetou-se, em primeiro lugar, 25 μl de cada proteína em pequenos tubos, aos quais também foi adicionado 25 μl de uma solução contendo o corante azul de Coomassie e também Dodecil Sulfato de Sódio (SDS). Utilizou-se amostras de Albumina Sérica Bovina (BSA), Catalase, Azurina e Ovalbumina, todas elas puras. De seguida, em cada um desses tubos foi colocado em água a ferver durante cerca de 5 minutos para que as proteínas sofressem desnaturação. A desnaturação é fundamental à realização da electroforese, uma vez que destrói a estrutura terciária e quaternária da proteína. De seguida, 5

prosseguiu-se para a montagem da electroforese, a qual consiste em duas placas, uma de vidro e outra de cerâmica, que assentam numa base, entre as quais se encontra o gel desnaturante de poliacrilamida. Na elaboração dos géis procedemos de acordo o que estava indicado no protocolo [1]. Na parte superior existem poços através das quais se vão colocar as amostras anteriormente preparadas. Dado que usámos dois géis, cada um deles com 15 poços, foram utilizados no total 30 poços para dentro dos quais pipetou-se cerca de 5 μl de cada solução preparada. Em alguns dos poços, normalmente o primeiro e o último, pipetouse a mesma quantidade de solução padrão. Finalmente, já com a solução tampão de electroforese na base, a qual permite a manutenção de um valor de ph constante, ligou-se os elétrodos da electroforese à fonte de energia, regulada para uma voltagem de 150 V. A base da electroforese funcionou como ânodo e a parte superior como cátodo, pelo que as proteínas migraram para a base do aparelho. Uma vez concluída a migração das proteínas, que durou cerca de uma hora, desligou-se os elétrodos da fonte de energia. O azul de coomassie, por estabelecer ligações muito fortes com as proteínas e muito fracas com o gel de poliacrilamida, permite que as proteínas, uma vez separadas, não se movam no gel, após a finalização da eletroforese. Findo o processo de espera, separou-se, cuidadosamente, as placas dos géis, mergulhando-os imediatamente na solução de electroforese. Foram posteriormente descorados, para as bandas se tornarem mais evidentes. Enquanto se processava a electroforese, preparámos as amostras para a determinação da concentração de cada uma das proteínas pelo método de Bradford. O método de Bradford é um método colorimétrico que se baseia na formação de um complexo entre o corante azul de coomassie e as proteínas, cujo máximo de absorção corresponde a um comprimento de onda de 595 nm. Pipetou-se cerca de 5μL de cada proteína para uns tubos, diluindo-se depois a solução com fator 10 e juntando-se 2,5 ml de azul de coomassie. Noutro tubo, colocou-se, para referência 500 μl de água e também 2,5 ml de azul de Coomassie. Introduzidos os tubos no espectrofotómetro, procedeu-se ao registo dos valores de asorvância registados para cada uma das proteínas em dois ensaios. Depois de obtidos os valores para as absorvâncias calcularam-se as concentrações das proteínas pela Lei de Lambert-Beer. 6

ph Resultados Titulação potenciométrica de Aminoácidos As curvas de titulação dos dois aminoácidos foram feitas à custa de dados recolhidos laboratorialmente, a uma temperatura de 19,4 ºC (71 medições de ph e volume adicionado de NaOH para o ácido glutâmico; 43 medições para a alanina). A derivada da curva de titulação foi obtida, ponto a ponto, usando a noção de taxa média de variação (Gráficos 1 e 2 e Anexos). Após a representação das duas curvas para cada um dos aminoácidos procedeu-se à determinação dos pka: pka 1, que corresponde à ionização do grupo carboxilo, e o pka 2, que corresponde à ionização do grupo amina. No caso do ácido glutâmico ainda existe pka R, correspondente á ionização do grupo carboxilo adicional presente no radial. Procedemos ao cálculo dos respetivos pka recorrendo ao método da derivada, fazendo interpolação linear sempre que necessário para determinar os valores de ph para os quais não havia medições de volume obtidas laboratorialmente. Para a alanina obteve-se pka 1 = 2,71 e pka 2 = 9,94. Para o ácido glutâmico obteve-se pka 1 = 2,65, pka R = 4,18 e pka 2 = 9,73. Alanina 25,0 20,0 15,0 Curva de Titulação 10,0 5,0 Derivada da Curva de Titulação 0,0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 Gráfico 1_Curva de titulação da alanina e respetiva e derivada. Volume de NaOH (ml) 7

ph Ácido Glutâmico 25,0 20,0 15,0 Curva de Titulção 10,0 5,0 Derivada da Curva de Titulação 0,0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 Gráfico 2_Curva de titulação do ácido glutâmico e respetiva e derivada. Volume de NaOH (ml) Determinação da concentração de uma proteína pelo método de Bradford. Análise de proteínas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) Determinação da concentração de uma proteína pelo método de Bradford O método de Bradford permitiu não só o cálculo da concentração de cada uma das proteínas, mas igualmente o cálculo da massa de proteína que foi ser aplicada no gel da elctroforese. Em primeiro lugar procedeu-se à determinação da concentração das várias amostras de proteínas preparadas. Tal como foi descrito na secção anterior foram determinadas as absorvências de cada solução no espectrofotómetro e a concentração foi determinada por aplicação da Lei de Lambert-Beer (A = ε I [M]). A equação da reta de calibração encontrada no rótulo da solução de azul de coomassie + SDS (Figura 4) corresponde, de facto, à aplicação dessa Lei em que: y = 0,0006x + 0,0073 Absorvância = 0,0006 concentração + 0,0073 Figura 4_Reta de calibração no rótulo da solução de azul de coomassie + SDS. 8

Substituindo os valores de absorvância obtidos laboratorialmente na relação linear obtiveram-se as seguintes concentração de cada solução, os quais estão detalhados na Tabela 1. Tabela 1_Concentração das soluções de proteína aplicadas nos géis. Proteínas Absorvância Concentração (mg/l) Azurina 0,268 434,5 Azurina 0,275 446,1666667 Catalase 0,115 179,5 Catalase 0,114 177,8333333 BSA 0,169 269,5 BSA 0,183 292,8333333 Ovalbumina 0,107 166,1666667 Ovalbumina 0,216 347,8333333 Azurina 0,286 464,5 Azurina 0,291 472,8333333 Determinação da massa de proteína aplicada no gel Sabemos que a concentração de uma dada proteína é por c = m, pelo que o valor V procurado para a massa de proteína é o produto entre a concentração da solução de proteína pelo volume total de cada proteína aplicada no gel. As concentrações das várias proteínas foram anteriormente determinadas pelo método de Bradford. Para cada uma das proteínas usou-se o valor mais provável da concentração. Quanto ao volume, sabemos que em cada amostra utilizada foram utilizados 25 μl de proteína e 25 μl de solução tampão. Em cada poço pipeta-se cerca de 5 μl de cada amostra de 50 μl. Portanto, tem-se, por poço, 2,5 μl de solução de proteína e 2,5 μl de solução tampão, uma vez que a mistura é homogénea. Por gel tem-se: 3 amostras com BSA: 3 2,5 = 7,5 μl 3 amostras com Catalase: 3 2,5 = 7,5 μl 3 amostras com Ovalbumina: 3 2,5 = 7,5 μl 4 amostras com Azurina: 4 2,5 = 10 μl As massas determinadas para cada proteína por gel encontram-se na Tabela 2. Tabela 2_Valor médio da massa de proteína aplicada nos géis. Concentração (mg/μl) Volume (μl) Massa (μg) BSA 2,8117 10 4 7,5 2,11 Catalase 1,7867 10 4 7,5 1,34 Ovalbumina 2,57 10 4 7,5 1,98 Azurina 4,545 10 4 10 4,545 9

A massa total de proteína aplicada por gel consiste na soma das massas anteriores: m BSA + m catalase + m ovalbumina + m azurina = (2,11 + 1,34 + 1,98 + 4,545)μg = 9,975μg 10μg de proteína aplicadas por gel Separação electroforética de proteínas por SDS-PAGE Concluída a electroforese os aspectos finais dos dois géis de poliacrilamida foi a que está ilustrada nas Figuras 5 e 6. Figura 5_ Proteínas utilizadas em cada poço no gel 1: 1,15- Solução-padrão molecular 2,7,11- BSA 3,8,12- Catalase 4,10,13- Ovalbumina 5,6,9,14- Azurina Figura 6_ Proteínas utilizadas em cada poço no gel 2: 1,15- Solução-padrão molecular 2,7,11- BSA 3,8,12- Catalase 4,10,13- Ovalbumina 5,6,9,14- Azurina Nos poços 1 e 15 de cada um dos géis foi adicionada uma solução de padrão molecular (NZYTECH Marker II). Medindo a distância migrada em pixeis com o auxílio do programa informático Paint foi possóvel a elaboração de uma reta de calibração, uma para gel utilizado (logaritmo na base 10 do peso molecular em kda em função da distância migrada em pixeis). Os resultados obtidos estão nas Tabelas 3 e 4 e Gráficos 3 e 4. 10

Tabela 3_Pesos moleculares padrão (e logaritmo do peso molecular padrão) e correspondente distância percorrida em pixéis para o gel 1. Gráfico 3_Reta de calibração para o gel 1. Tabela 4_Pesos moleculares padrão (e logaritmo do peso molecular padrão) e correspondente distância percorrida em pixéis para o gel 2. Gráfico 4_Reta de calibração para o gel 2. As retas obtidas são da forma: log(peso molecular) = a Distância percorrida + b. Essa equação é equivalente a Peso molecular = 10 a Distância percorrida+b. Utilizando a equação anterior e medindo, de forma semelhante, as distâncias migradas de cada uma das proteínas colocadas em cada um dos poços dos geís foi possível estimar o seu peso molecular (em KDa). Os valores obridos para as proteínas do gel 1 e para o gel 2 estão, respectivamente, nas Tabelas 5 e 6. 11

Tabela 5_Pesos moleculares para as proteínas aplicadas no gel 1. Tabela 6_Pesos moleculares para as proteínas aplicadas no gel 2. É de salientar que não foi possível obter uma estimativa para o poço 11 do gel 2 por a banda não ter ficado nítida o suficiente para se poder medir a distância migrada. 12

Discussão Titulação potenciométrica de Aminoácidos Estrutura e carga dos aminoácidos ao longo da curva de titulação Para a alanina, temos uma curva de titulação que indica a existência de dois valores de pka distintos: um que corresponderá à desprotonação do grupo carboxilo e outro ao do grupo amina. O radical metil da alanina, CH 3, não sofre ionização. Inicialmente a alanina apresenta-se com a composição + NH 3 CHCH 3 COOH, em que nenhum dos seus grupos funcionais sofreu desprotonação (carga +1). À medida que se adiciona NaOH, atinge-se o primeiro ponto de equivalência (PE 1, de coordenadas (2.15; 2.71)). Neste ponto há igual concentração de COOH e COO, sendo que metade das moléculas de alanina tem estrutura + NH 3 CHCH 3 COOH e a outra metade está sob a forma + NH 3 CHCH 3 COO. A ordenada do primeiro ponto de equivalência PE 1 (ph do titulado) coincide também com o primeiro pka 1 para este ponto de equivalência, conforme é indicado na equação de Henderson-Hasselbach. De seguida, verifica-se uma subida de ph muito acentuada, atingindo-se o primeiro ponto de inflexão da curva (PI 1 ). O grupo carboxilo de todas as moléculas de alanina encontra-se desprotenado, sendo que estão sob a forma + NH 3 CHCH 3 COO. Este é o ponto onde a carga total do aminoácido é nula. O declive da curva de titulação volta a diminuir, o que indica uma estabilização do valor de ph até ser atingido o segundo ponto de equivalência (PE 2, de coordenadas (4.73; 9.94)). Verifica-se, agora, igual concentração das espécies + NH 3 e NH 2, onde em metade das moles de alanina o grupo amina já desprotonou, encontrando-se sob a forma NH 2 CHCH 3 COO, e a restante metade sob a forma + NH 3 CHCH 3 COO. À semelhança de PE 1, a ordenada de PE 2 corresponde ao valor de pka 2. Há de novo um aumento do valor de ph, indicando que a totalidade dos grupos amina já se encontra desprotonada. Atingiu-se o segundo ponto de inflexão da curva (PI 2 ). Neste ponto todas as moléculas de alanina aminoácido estão sob a forma NH 2 CHCH 3 COO. O aminoácido encontra-se então com uma carga -1. início: 100% + NH 3 CHCH 3 COOH PE 1 : 50% + NH 3 CHCH 3 COOH e 50% + NH 3 CHCH 3 COO PI 1 : 100% + NH 3 CHCH 3 COO PE 2 : 50% + NH 3 CHCH 3 COO e 50% NH 2 CHCH 3 COO PI 2 : 100% NH 2 CHCH 3 COO 13

Gráfico 5_Curva de titulação da alanina com os pontos de interesse assinalados. Para o ácido glutâmico, a titulação foi semelhante mas nela foram obtidos três valores de pka. Existe à mesma pka 1, correspondente à desprotonação do grupo carboxilo α, pka 2, correspondente à desprotonação do grupo amina, e surge, ainda, pka R, relacionado com a desprotonação do grupo carboxilo presente no radical R. Este grupo carboxilo sofre desprotonação primeiro que o grupo amina, pois revela um carácter mais ácido. Este aminoácido apresenta uma carga inicial de +1. Assim, na curva de titulação do ácido glutâmico, podemos distinguir os pontos: PE 1, primeiro ponto de equivalência (coordenadas (1.275; 2.65)), cujo valor de pka 1 é igual ao ph nesse local. Aí apenas 50% das moles do aminoácido têm o grupo carboxilo α totalmente desprotonado. PI 1, primeiro ponto de inflexão, indicador de uma variação brusca no valor de ph; neste ponto os grupos carboxilo α de todas as moléculas de ácido glutâmico já se encontram desprotonados. Há um equilíbrio entre as cargas positivas e as cargas negativas, pelo que a carga total do aminoácido é nula. PE R, segundo ponto de equivalência (coordenadas (3.40; 4.18)), onde metade dos grupos carboxilos do grupo R estão desprotoados. O valor de pka R corresponde ao valor de ph nesse ponto. PI 2, segundo ponto de inflexão, onde todas os grupos carboxilos dos grupos R, estão desprotonados. A carga do aminoácido é, então -1; PE 2, terceiro ponto de equivalência (coordenadas (6.33; 9.73)),cujo valor de pka 2 é igual ao ph nesse local. Aí apenas 50% das moles do aminoácido têm o grupo amina totalmente desprotonado. 14

Por fim, todos os grupos amina foram ionizados e a carga final do aminoácido é -2. Gráfico 6_Curva de titulação do ácido glutâmico com os pontos de interesse assinalados. 15

Poder tampão da alanina e do ácido glutâmico O poder tampão da solução de um aminoácido define-se, qualitativamente, como a capacidade que o aminoácido tem de resistir a mudanças de ph, face à adição do titulante básico, neste caso o NaOH. Consequentemente, quanto menor a alteração do ph à medida que se adiciona NaOH, maior será o poder tampão. Este depende do pka e das concentrações das várias espécies nas soluções em causa. Em termos quantitativos, verifica-se quando a derivada da curva de titulação é aproximadamente constante. Na alanina considerou-se haver poder tampão entre as adições 1.35 ml a 2.35 ml, 3.70 ml a 5.85 ml e 7.05 ml a 9,40 ml de NaOH. No ácido glutâmico verificou-se haver poder tampão entre as adições de 0.75 ml a 4.1 ml, 5.6 ml a 6.75 ml e 8.35 ml a 9.6 ml de NaOH. Estas regiões correspondem a zonas na curva de titulação onde o valor de ph estabiliza, não havendo variações bruscas, ainda que seja adicionado um volume considerável de titulante. Determinação do ponto isoelétrico da alanina No caso dos aminoácidos, o ponto isoelétrico é o valor de ph para o qual este tem carga neutra, isto é, o ponto para o qual o há equivalência entre as cargas positivas e as cargas negativas. O seu valor corresponde à média aritmética entre pka 1 e pka 2. pka 1 + pka 2 2 Para a alanina, sabe-se que este é atingido no primeiro ponto de inflexão, PI 1, em que há um equilíbrio entre as cargas positiva do grupo amina, estando sob a forma + NH 3, e negativas do grupo carboxilo, tendo o COOH passado a COO. Assim: Ponto isoelétrico = 2,71 + 9,94 2 = 6,33 Comparação dos valores tabelados e os obtidos experimentalmente Nas Tabelas 7 e 8 estão, novamente, indicados os valores de pka dos aminoácidos estudados obtidos experimentalmente a uma temperatura de 19,4 ºC, bem como os valores tabelados, a 25 ºC. Tabela 6_Erro relativo cometido na determinação dos pka da alanina. pka experimental pka tabelado erro relativo (%) pka 1 2.71 2.35 15.3 pka 2 9.94 9.69 2.57 16

Tabela 7_Erro relativo cometido na determinação dos pka do ácido glutâmico. pka experimental pka tabelado erro relativo (%) pka 1 2.65 2.19 21.0 pka R 4.18 4.25 1.64 pka 2 9.73 9.67 0.62 Os resultados experimentais apresentam, em geral, erros relativos menores que 20%. Desvios inferiores a 20% podem ser justificados por possíveis erros de paralaxe (por exemplo, erros na leitura da escala da bureta pelo operador). Apenas o valor de pka 1 do ácido glutâmico comporta um erro superior, uma vez que foi difícil a identificação dos máximos da derivada da curva de titulação que permitem a sua determinação. É de salientar, igualmente, que a temperatura a que foram obtidos os resultados laboratoriais é distinta da dos resultados teóricos. Apesar de o pka depender da temperatura do meio, a diferença em 5.6 ºC não é significativa e a comparação efetuada para o cálculo do erro relativo é legítima. Determinação da concentração de uma proteína pelo método de Bradford. Análise de proteínas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) Comparação dos valores tabelados e experimentais das massas moleculares das proteínas. Vantagens e limitações da técnica SDS-PAGE Primeiramente, comparou-se os valores obtidos experimentalmente com os valores tabelados expectáveis e determinámos o seu erro relativo. Para a técnica considera-se uma boa aproximação quando a estimativa de erro relativo, em percentagem, está compreendida entre 5 e 10% [2]. Relativamente ao primeiro gel, nos poços 4, 5, 9, 11 e 14 obtiveram-se percentagens de erro maiores, respetivamente 11,24% (Ovalbumina), 13,60% (Azurina), 10,81% (Azurina), 12,76% (BSA) e 10,81% (Azurina). Quanto ao segundo gel, apenas nos poços 5, 7, 10 e 12 se obtiveram percentagens de erro superiores a 10%, para, respetivamente, uma amostra de BSA, duas de Azurina e uma de Ovalbumina. Em média, para cada gel, obtivemos os valores sumarizados nas Tabelas 8 e 9. 17

Tabela 8_Peso molecular estimado para as proteínas do gel 1 e respetivo erro relativo. Proteína Média das Distâncias (Pixéis) Peso molecular (KDa) Peso molecular Tabelado (KDa) Erro relativo (%) BSA 61,33 60,74 66,43 8,56 Catalase 62,67 60,08 57,50 4,48 Ovalbumina 92,67 46,85 42,70 9,72 Azurina 225,50 15,58 14,00 11,27 Tabela 9_Peso molecular estimado para as proteínas do gel 2 e respetivo erro relativo. Proteína Média das Distâncias (Pixéis) Peso molecular (KDa) Peso molecular Tabelado (KDa) Erro relativo (%) BSA 71,33 60,04 66,43 9,62 Catalase 76,33 57,87 57,50 0,64 Ovalbumina 105,00 46,85 42,70 9,72 Azurina 251,67 15,90 14,00 13,56 Portanto, em média, os pesos moleculares que calculados para as proteínas analisadas estão próximos dos valores tabelados. Quanto ao primeiro gel, o erro percentual para a Catalase é inferior a 5%. Para a Azurina a percentagem de erro é de 11,27%, ligeiramente mente superior a 10%, ainda assim uma boa estimativa. No segundo gel, para a Catalase obteve-se um erro percentual de 0,64%, o que se traduz numa excelente aproximação. Quanto à Azurina, obteve-se um erro relativo de aproximadamente 14% que, não estando compreendido entre 5 e 10%, é relativamente reduzido. Assim, quanto à técnica SDS-PAGE, pode-se afirmar que os erros cometidos tiveram origem em eventuais erros experimentais associados. Para além da incerteza associada às distâncias percorridas relativamente à amostra padrão, o que poderá ter induzido erros nos pesos moleculares, também ao colocar as amostras de proteínas pode ter havido contaminação de um poço com solução de outro, afetando a distância migrada em cada poço. Um dos poços não foi analisado por este mesmo motivo (11º poço do segundo gel). Na medição da distância migrada, também se considera que possam ter ocorrido erros, dado que a medição em pixéis não constituiu um método tão preciso quanto aquilo que se pretenda. Por exemplo, por vezes houve dificuldades em determinar ao certo a região das bandas das proteínas onde se tinha que efetuar as medições. Após análise de dados e tendo em conta que a SDS-PAGE avalia a mobilidade eletroforética das proteínas, comprovou-se a noção teórica de que a mobilidade é inversamente proporcional ao peso molecular, isto é, quanto menor o peso molecular de uma proteína, maior a distância por ela percorrida no gel e vice-versa. De facto, é a Albumina Sérica Bovina (BSA) a proteína que menos distância percorreu, em média, em cada um dos géis, é a que tem um maior peso molecular. Por sua vez, a Azurina é a molécula com menor peso molecular (cerca de 14 kda) e à qual corresponde uma maior distância migrada, em média, para cada gel. Foi, igualmente, possível obter uma correlação entre as espessuras das bandas correspondentes às proteínas na electroforese e a respetiva absorvância, a 595 nm, coradas com azul de Coomassie. Verificou-se que quanto maior a absorvância de uma dada proteína 18

a maior é a espessura da banda no poço de electroforese onde a amostra foi colocada. Por oposição, se a espessura da banda é menor, significa que o seu valor de absorvância para o mesmo comprimento de onda considerado é menor. Tome-se a título de exemplo a Azurina, proteína que maior absorvância. Apresenta, para um comprimento de onda de 595 nm, em média, uma absorvância de 0,280. Em ambos os géis de electroforese pode-se verificar que a banda correspondente a esta proteína é, de longe, muito mais espessa comparativamente às restantes. Uma vez que obtivemos valores experimentais relativamente próximos dos valores teóricos, pode-se inferir que este método tem inúmeras vantagens. Trata-se de um método muito prático e simples de realizar, dado que o equipamento e os reagentes necessários são de fácil aquisição. Além disso a quantidade de proteína pura necessária é bastante reduzida (alguns microgramas). É, igualmente, um método muito abrangente porque o SDS consegue solubilizar um espectro muito variado de proteínas. No entanto, tal como foi enunciado, existem erros cometidos experimentalmente associados a este método e que contribuem para o aumento da incerteza nos resultados. Alguns deles já foram referidos, mas a desnaturação incompleta, presença de resíduos e existência de sequências de aminoácidos pouco usuais podem, de igual modo, aumentar o erro na determinação do peso molecular. É de salientar que nesta experiência as proteínas eram conhecidas, mas caso não o fossem seria difícil proceder à sua identificação dado que existem várias proteínas cujo peso molecular é semelhante. Observações quanto ao método de Bradford No método de Bradford, para a Azurina, Catalase e BSA, encontrámos valores consistentes entre si para a absorvância, o que confere fiabilidade ao método. Contudo, para a Ovalbumina os valores obtidos apresentam uma elevada discrepância entre si (0,107 e 0,216). Esta discordância deve-se possivelmente a erros ao pipetar as várias quantidades de soluções para a amostra utilizada no espectrofotómetro. Assim, o valor médio entre estes dois valores obtidos para a Ovalbumina pode afastar-se de maneira significativa do valor tabelado para a absorvância desta proteína a 595 nm, o que altera a sua concentração, influenciando o cálculo para determinar de massa de Ovalbumina aplicada no gel, não se obtendo uma boa aproximação do valor real. NOTA: neste trabalho decidimos não utilizar os géis que obtivemos no nosso turno de laboratório, mas sim os de outro turno, uma vez que considerámos que os nossos géis não estavam nas melhores condições para serem analisados. As bandas estavam pouco coradas e vários poços tinham sido deixados vazios, o que dificultava as medições e aumentava o desvio associado aos valores teóricos. 19

Anexos Titulação potenciométrica de Alanina e Ácido Glutâmico Dados experimentais usados para a obtenção da curva de titulação dos aminoácidos e da respectiva derivada Alanina ph V NaOH (ml) ph V NaOH 1,76 0,05 1,79 0,15 0,30 1,82 0,25 0,30 1,92 0,50 0,40 2,03 0,75 0,44 2,16 1,10 0,37 2,30 1,35 0,56 2,43 1,60 0,52 2,59 1,95 0,46 2,77 2,20 0,72 2,87 2,35 0,67 3,17 2,60 1,20 3,37 2,70 2,00 3,67 2,80 3,00 3,95 2,85 5,60 5,06 2,90 22,20 7,63 2,95 51,40 8,13 3,00 10,00 8,36 3,10 2,30 8,54 3,15 3,60 8,87 3,30 2,20 8,95 3,35 1,60 9,02 3,40 1,40 9,17 3,55 1,00 9,30 3,70 0,87 9,44 3,90 0,70 9,61 4,15 0,68 9,76 4,40 0,60 9,90 4,70 0,47 10,05 4,95 0,60 10,14 5,10 0,60 10,31 5,40 0,57 10,69 5,85 0,84 11,07 6,10 1,52 11,34 6,25 1,80 11,56 6,40 1,47 11,80 6,50 2,40 12,06 6,75 1,04 12,22 7,05 0,53 12,46 7,70 0,37 12,59 8,30 0,22 12,69 8,85 0,18 12,76 9,40 0,13 20

Ácido Glutâmico ph V NaOH (ml) ph V NaOH ph V NaOH (ml) ph V NaOH 1,86 0 1,9 0,1 0,4 1,94 0,2 0,4 2 0,3 0,6 2,05 0,55 0,2 2,1 0,6 1 2,22 0,75 0,8 2,36 1,05 0,466666667 2,49 1,2 0,866666667 2,66 1,5 0,566666667 2,85 1,75 0,76 3,06 1,95 1,05 3,26 2,2 0,8 3,47 2,45 0,84 3,66 2,7 0,76 3,84 2,95 0,72 4,02 3,25 0,6 4,12 3,35 1 4,18 3,45 0,6 4,24 3,6 0,4 4,31 3,7 0,7 4,34 3,75 0,6 4,38 3,8 0,8 4,41 3,85 0,6 4,48 3,95 0,7 4,53 4 1 4,57 4,05 0,8 4,61 4,1 0,8 4,66 4,15 1 4,76 4,25 1 4,87 4,35 1,1 5,01 4,45 1,4 5,18 4,55 1,7 5,43 4,65 2,5 5,61 4,7 3,6 5,91 4,75 6 6,66 4,8 15 7,82 4,85 23,2 8,2 4,9 7,6 8,41 4,95 4,2 8,55 5 2,8 8,66 5,05 2,2 8,76 5,1 2 8,84 5,15 1,6 8,91 5,2 1,4 8,98 5,25 1,4 9,04 5,3 1,2 9,09 5,35 1 9,18 5,45 0,9 9,31 5,6 0,866666667 9,42 5,75 0,733333333 9,52 5,9 0,666666667 9,62 6,05 0,666666667 9,75 6,25 0,65 9,84 6,4 0,6 9,95 6,55 0,733333333 10,05 6,75 0,5 10,16 6,85 1,1 10,25 7 0,6 10,59 7,25 1,36 11,09 7,55 1,666666667 11,77 7,8 2,72 11,95 7,95 1,2 12,07 8,05 1,2 12,16 8,15 0,9 12,24 8,2 1,6 12,31 8,35 0,466666667 12,36 8,45 0,5 12,42 8,55 0,6 12,6 9,05 0,36 12,73 9,6 0,236363636 21

Bibliografia [1] Fialho A., Moreira L., Leitão J. H., Mira N., Teixeira M., Sá-Correia I., Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioquímica e Biologia Molecular, 1ºSemestre, 2015/2016, Instituto Superior Técnico. [2] Voet, Voet, Pratt, Fundamentals of Biochemestry: life at the molecular level, John Wiley & Sons, Inc., 4ª edição, 2013 (páginas 102-104). [3] Baynes, Dominiczak, Medical Biochemestry, Mosby, 2ª edição, 2014 22