RPCV (2009) 104 (569-572) 25-30 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Transferência embrionária em bovinos leiteiros na Ilha Graciosa (Açores): programa experimental de transferência de embriões sexados e congelados da raça Holstein Frísia Embryo transfer in dairy cattle at Graciosa Island (Azores): an experimental trial of sexed and frozen-thawed transfer of Holstein Friesian embryos João Chagas e Silva* Secção de Reprodução e Obstetrícia/CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Avenida da Universidade Técnica, Polo Universitário da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal Resumo: A transferência de embriões obtidos in vivo representa a 2ª geração das tecnologias reprodutivas e é aplicada comercialmente, no caso dos bovinos, há mais de 30 anos. Actualmente, são transferidos em todo mundo, mais de meio milhão desse tipo de embriões, o que representa um significativo negócio internacional. A Secretaria Regional da Agricultura e Florestas do Governo da Região Autónoma dos Açores, através da sua Direcção Regional do Desenvolvimento Agrário, tendo em conta o elevado estatuto sanitário e o apreciável efectivo bovino leiteiro da Ilha Graciosa, considerou-a como cenário privilegiado para a execução de um programa experimental de transferência de embriões sexados e congelados. Foram transferidos, ao longo de um período de 16 meses, um total de 76 embriões congelados, 65 sexados e 11 não sexados. Os resultados agora registados, face aos obtidos por outros autores, podem ser considerados bastante bons: 63,1% (41/65) de taxa de gestação aos 45-60 dias para os embriões sexados e 63,6% (7/11) para os não sexados. Este facto revela que, nas condições de maneio produtivo a que as novilhas da Ilha Graciosa estão sujeitas, é possível a transferência com sucesso de embriões sexados e congelados. Summary: Embryo transfer collected in vivo is the second generation of reproductive biotechnologies and has been used on cattle farms for more than thirty years. More than 500.000 embryos of these kinds are transferred worldwide annually, which represents a great international trade. The Regional Secretary of Agriculture and Forestry from Government of Azores, by the way of its Regional Direction of Agricultural Development, considering the high sanitary level and the number of dairy cattle females, chose Graciosa Island as the right location for the implementation of an experimental program of transfer of sexed and frozen Holstein Friesian imported embryos. 76 frozen-thawed embryos have been transferred, during a 16 months time period, 65 sexed and 11 non sexed. The results obtained in this experimental work may be considered good, compared to the field trials from others workers: 63,1% (41/65) of 45-60 days pregnancy rate with sexed embryos and, 63,6% (7/11) with non sexed embryos. *Correspondência: adnestorch@fmv.utl.pt Telef. +351213602053; Fax +351213652827 These results show that it was possible, with success, to transfer sexed frozen-thawed Holstein Friesian imported embryos to virgin heifers recipients raised on local management conditions of Graciosa Island. Introdução Há mais de três décadas que a transferência de embriões (TE) obtidos in vivo é aplicada comercialmente nos bovinos (Thibier, 2005). Relativamente à inseminação artificial (IA), apesar dos custos de aplicação serem superiores e a eficiência inferior, o futuro da TE encontra-se garantido, pois está intimamente associado a programas de melhoramento genético, sendo de registar que a grande maioria dos touros IA de todo o mundo, são obtidos através dela. É igualmente ferramenta privilegiada para a conservação ex situ de genes de espécies/raças ameaçadas de extinção e ainda, com o desenvolvimento de protocolos eficientes de congelação-descongelação, tem vindo a demonstrar ser a forma mais segura, em termos sanitários, de intercâmbio de genes entre regiões e continentes (Hasler, 2003; Thibier, 2005). Em 2002, foram transferidos em todo o mundo, 538 312 embriões bovinos colhidos in vivo (Thibier, 2002), valor (ainda que sub-estimado, pois inúmeras equipas de TE não fornecem dados) que revela, desde 1975, uma tendência para estabilização (Thibier, 2005) e representa um expressivo negócio de cariz internacional (Hasler, 2003). Em Portugal, a bovinicultura leiteira valoriza muito mais as vitelas (para substituição ou para venda) que os machos (quase sem valor comercial, com excepção dos raros que são recrutados por Centros de IA). Os vitelos obtidos por TE representam pois, globalmente, um sério prejuízo económico para a exploração leiteira (Lopes da Costa et al., 2002). 25
A utilização de embriões sexados permite aumentar a eficiência económica dos programas de TE (Willett e Hillers, 1994) e a taxa de ganho genético, quer ao nível de uma exploração, quer de um núcleo de selecção (Colleau, 1991). A determinação do sexo de embriões pré-implantação de bovinos com recurso à técnica da reacção em cadeia da polimerase (PCR) e protocolo electroforético (Shea, 1999) ou não-electroforético (Bredbacka, 1998) é um serviço oferecido por algumas unidades comerciais de TE, revelando elevadas taxas de eficiência e de precisão (Hasler, 2003). Porém, a necessidade da obtenção de uma biópsia embrionária (6-8 blastómeros) exige um técnico experimentado (Hasler, 2003), eleva o risco de contaminação do embrião por agentes patogénicos (Wrathall e Sutmöller, 1998) e diminui a sua viabilidade após a congelação (Shea, 1999). A Ilha Graciosa, uma das nove ilhas do arquipélago dos Açores, situada no extremo noroeste do Grupo Central (Longitude 28º 05 W e Latitude 39º 05 N), possui um elevado estatuto sanitário, sendo considerada Ilha oficialmente indemne de brucelose (Decisão da Comissão nº 2002/588/CE, de 11 de Junho), de tuberculose e leucose, facto que poderá estar associado, até ao momento, à ausência de uma expressiva importação de animais vivos do exterior. A importância de manter esse estatuto sanitário aliada à necessidade de promover o melhoramento genético, de uma forma rápida e sustentada, levou a Secretaria Regional da Agricultura e Florestas, do Governo da Região Autónoma dos Açores, através da sua Direcção Regional do Desenvolvimento Agrário, a assinar um protocolo de cooperação com a Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa. Foi então, delineado e executado, por um período inicial de 18 meses, um Programa Experimental de Transferência Embrionária em Bovinos Leiteiros, naquela Ilha, com a finalidade de aferir resultados do uso da técnica para a obtenção de fêmeas de elite, a partir da aquisição de embriões congelados da raça Frísia Holstein (na sua grande maioria sexados), adaptadas às condições ambientais locais, que poderão vir a contribuir decisivamente, para o melhoramento genético dos efectivos leiteiros da região. Material e métodos Os trabalhos decorreram entre Janeiro de 2008 e Maio de 2009, distribuídos por 4 períodos de transferências embrionárias: Fevereiro de 2008, Abril de 2008, Janeiro de 2009 e Abril de 2009. Embriões Foram adquiridos 65 embriões sexados e congelados para transferência directa: 43 de origem canadiana, provenientes de 13 diferentes emparelhamentos e processados por 4 equipas de TE distintas; e 22 de origem francesa, de 6 emparelhamentos, processados por uma única equipa. Todos os embriões tinham 7 dias (dia 0 = dia do cio superovulatório - SOV). Adicionalmente, foram adquiridos 11 embriões não sexados e congelados para transferência directa, de 4 emparelhamentos diferentes, processados por única equipa e pertencentes ao Núcleo OMTE (Ovulação Múltipla e Transferência Embrionária) Juvenil da extinta Divisão de Selecção e Reprodução Animal (Venda Nova-Amadora). Todos os embriões tinham 7,5 dias (dia 0 = dia do cio SOV). Animais Maneio geral das novilhas na Ilha Na Ilha Graciosa, as fêmeas são enviadas para a pastagem ("os cerrados") a partir dos três meses de idade e aí permanecem até parirem. Durante todo ano, as novilhas alimentam-se dos pastos, sem qualquer suplementação, com excepção dos meses de Julho e Agosto. Nesse período, com os pastos secos, é-lhes fornecida silagem de milho ou de erva e feno de azevém. Não é administrado concentrado. Em função da qualidade da pastagem, são visitadas de 4 em 4 ou de 8 em 8 dias, para mudança das cercas ou de pastagem. De uma forma geral, as novilhas são beneficiadas por cobrição. As fêmeas seleccionadas para o programa eram todas novilhas, na sua grande maioria da raça Frísia, com idades compreendidas entre os 14 e os 24 meses e pelo menos 350 kg de peso vivo. Profilaxia médica e sanitária As novilhas disponibilizadas (n = 263), pertencentes a 20 produtores, foram desparasitadas com fenbendazole (7,5 mg/kg de peso vivo, administrados por via oral, em dose única, Panacur Suspensão 10%, Intervet Portugal-Saúde Animal, Lda.), vacinadas contra o IBR/IPV com a vacina viva e marcada Bovilis IBR (2 ml de vacina reconstituída, administrados por via IM, Intervet Portugal-Saúde Animal, Lda.) e sujeitas a uma colheita de sangue para pesquisa do antigénio BVD para a identificação e eliminação de animais persistentemente infectados. Estas intervenções ocorreram sempre, a mais de 3 semanas da data das transferências. Selecção das novilhas As fêmeas foram seleccionadas para o programa de sincronização de cios em função da sua condição corporal ( 2,25 e < 4) e ciclicidade (só foram aprovadas, as fêmeas cíclicas) (n = 136). As novilhas foram sujeitas a um exame do estado geral e a um exame ginecológico, tendo sido elimi- 26
nadas todas as novilhas que não pudessem ser admitidas no programa de sincronização ou que de alguma forma inviabilizassem uma transferência embrionária (n = 127). Protocolo de sincronização e de detecção de cios O protocolo de sincronização de cios escolhido foi o da dupla aplicação de dose luteolítica de um análogo de síntese da PGF2alfa (2 ml administrados por via IM, com onze dias de intervalo, Veteglan, Calier Portugal, S.A.). A detecção dos cios teve início 24 horas após a segunda administração do análogo de síntese da PGF2alfa e prolongou-se por 3 dias (com, pelo menos, três períodos de observação diários, de cerca de 30 minutos cada), tendo sido os respectivos proprietários os responsáveis pelo registo da data e hora dos eventos comportamentais e físicos da fêmea em cio. Só foram aceites para TE as novilhas com uma assincronia de +12 horas a 12 horas (n = 99), relativamente à idade do embrião a transferir. Transferência directa dos embriões As transferências foram executadas sempre pelo mesmo técnico e tiveram lugar em 4 locais distintos: 2 explorações particulares, com "cornadis" como dispositivo de imobilização das fêmeas (pelo pescoço e diante da mangedoura) e 2 estações de pesagem de animais, dispondo cada uma delas do seu tronco balança. Todas as novilhas com cio detectado e registo de reflexo de imobilização (RI) foram sujeitas a um exame ginecológico prévio para a identificação, localização e avaliação de um corpo lúteo (CL) com desenvolvimento adequado, relativamente ao dia da TE (dia 7 do ciclo éstrico). As fêmeas seleccionadas (n = 76) foram imobilizadas, com os membros anteriores elevados 35 cm, relativamente ao pavimento e foram sujeitas a uma anestesia epidural baixa com cloridrato de lidocaína (5 ml por animal, Anestesin, Laboratório Sorológico, Portugal). Os embriões foram descongelados de acordo com o protocolo aconselhado pela equipa de TE responsável pelo seu processamento e transferidos por via não-cirúrgica com auxílio da cânula de transferência miniaturizada Cassou (IMV Technologies, L Aigle, France), um por receptora, para o corno uterino ipsilateral ao ovário com o CL, profundamente e sem provocar traumatismo (Figura 1). Entre a descongelação do embrião e o final da transferência foram dispendidos entre 5 a 12 minutos (7,63 ± 0,15 minutos). Figura 1 - Transferência não-cirúrgica com recurso à cânula de transferência miniaturizada Cassou. Diagnóstico de gestação O diagnóstico de gestação realizou-se por palpação transrectal aos 45-60 dias (dia 0 = dia do cio da receptora) e foi efectuado sempre pelo mesmo técnico. Foi aconselhado aos proprietários de receptoras sujeitas à TE que mantivessem o sistema de detecção de cios para registo de eventuais situações de retorno ao cio, aos 12 dias após a transferência e por um período de 5 dias. A detecção inequívoca de um cio deveria ser aproveitada para a beneficiação da fêmea. Análise estatística Na análise dos dados foi usado um programa informático de estatística (SPSS Statistics, versão 17.0). Para além dos métodos descritivos (Média ± E.P.) foi utilizado o Teste de Mann-Whitney U na comparação de idades e de condição corporal entre receptoras aprovadas e rejeitadas para o programa de sincronização de cios e entre as aprovadas e rejeitadas para TE, em virtude da distribuição não paramétrica dos dados. O Teste de Qui-Quadrado de Pearson foi usado na comparação das taxas de gestação em função da origem do embrião sexado (Correcção de Yates) e em função da época da TE. O nível de significância foi determinado para um grau de confiança de 5% (p < 0,05). Resultados Das 263 novilhas pertencentes a 20 produtores, com idade e condição corporal médias de 18,01 ± 0,31 meses e 2,60 ± 0,02, respectivamente, apresentadas para o programa de desparasitação e vacinação, apenas 136 (idade e condição corporal médias, respectivamente de 17,53 ± 0,37 meses e de 2,63 ± 0,03), 27
pertencentes a 19 produtores, foram seleccionadas para a fase seguinte. As causas para a rejeição de 127 fêmeas (idade e condição corporal médias, respectivamente de 18,52 ± 0,50 meses e de 2,55 ± 0,04) foram as seguintes: gestação (39); anestro (31); deficiente condição corporal (27); free-martinismo (7); quistos ováricos (6); infecção por descorna (3); idade excessiva (3); infantilismo genital (3); útero unicórnio (2); aplasia segmental (2); fotossensibilização (1); agenésia ovárica (1); fêmea repetidora (1); e luxação da bacia (1). As receptoras aprovadas para o programa de sincronização revelaram, relativamente às não aprovadas, diferenças não significativas quanto à idade (17,53 ± 0,37 versus 18,52 ± 0,50 meses, p > 0,05), mas significativas quanto à condição corporal (2,63 ± 0,03 versus 2,55 ± 0,04, p < 0,01). Noventa e nove das novilhas tratadas com PGF2alfa (72,8%) foram detectadas pelos seus proprietários (n = 17) como tendo revelado RI e a sincronia desejada. Previamente à TE, todas elas foram sujeitas a um exame ginecológico para ser avaliada a sua adequação à condição de receptora, tendo sido eliminadas 23 fêmeas (23,2%) pelas seguintes razões: anovulação (n = 7); cobrições não desejadas (n = 6); quistos ováricos (n = 5); anestro (n = 2); CL de desenvolvimento inadequado (n = 2; e deficiente condição corporal (n = 1). Não foram registadas diferenças significativas entre a idade e a condição corporal das receptoras aprovadas para TE e as rejeitadas (17,46 ± 0,52 meses e 2,67 ± 0,04 versus 16,93 ± 0,66 meses e 2,57 ± 0,06, p > 0,05). Por conseguinte, foram realizadas 76 TE, para as quais se utilizaram 65 embriões sexados, 43 canadianos e 22 franceses e, os 11 não sexados, de origem portuguesa. Os dados relativos à eficiência do processo e as taxas de gestação aos 45-60 dias para cada um dos tipos de embrião e para as diferentes épocas de transferência são apresentados nos Quadros 1 a 3. Apesar de numericamente superior, a taxa de gestação obtida com embriões sexados de origem canadiana (67,4%) não foi significativamente diferente da obtida com os de origem francesa (54,5%) (p = 0,46). Não foram igualmente encontradas, diferenças significativas entre as taxas de gestação em função da época de TE (71,4% x 64,0% x 56,3% x 57,1%, p = 0,76), a despeito de as duas primeiras fases de TE terem revelado valores numericamente superiores. Discussão e conclusões A rejeição de 48,3% (127/263) das novilhas para o programa de sincronização de cios resultou, essencialmente, do elevado número de fêmeas gestantes, em anestro e com deficiente condição corporal. Este cenário sugere um medíocre controlo reprodutivo dos Quadro 1 - Taxa de gestação em função do tipo de embrião Tipo do Embrião Nº de Transferências Nº de Gestações Taxa de Gestação (%) Sexado 65 41 41/65 (63,1)* Não Sexado 11 7 7/11 (63,6)* Totais 76 48 48/76 (63,2) * não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos (p > 0,05) Quadro 2 - Taxa de gestação em função do tipo e origem do embrião Tipo de Embrião Origem do Embrião Nº de Transferências Nº de Gestações Taxa de Gestação (%) Sexado Canadiana 43 29 29/43 (67,4)* Francesa 22 12 12/22 (54,5)* Não Sexado Portuguesa 11 7 7/11 (63,6) * não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos (p > 0,05) Quadro 3 - Taxa de gestação em função da época das transferências Época das TE Tipo de Embrião Nº de Transferências Nº de Gestações Taxa de Gestação (%) 1ª Fase Sexado 17 13 13/17 (76,5) Fev. 2008 Não Sexado 4 2 2/4 (50,0) Totais 21 15 15/21 (71,4)* 2ª Fase Sexado 18 11 11/18 (61,1) Abr. 2008 Não Sexado 7 5 5/7 (71,4) Totais 25 16 16/25 (64,0)* 3ª Fase Sexado 16 9 9/16 (56,3)* Jan. 2009 4ª Fase Sexado 14 8 8/14 (57,1)* Abr. 2009 * não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos (p > 0,05) 28
efectivos no que às cobrições indesejadas diz respeito e, igualmente, um aproveitamento por parte dos proprietários do programa gratuito de desparasitação e vacinação, com a apresentação de animais sem as condições ideais (por ex. idade e peso). O facto de a idade média das fêmeas reprovadas ter sido numericamente superior (ainda que a diferença não tenha sido significativa), em conjunto com uma condição corporal média inferior e significativamente diferente, relativamente às novilhas aprovadas, parece ter dado maior evidência à eficiência do processo selectivo, quanto à eliminação das fêmeas menos capazes. Por seu turno, a taxa de detecção de cios (72,8%) foi indicadora de boa eficácia dos produtores no registo dos dados comportamentais e físicos das fêmeas que exibiram estro, tendo em conta as condições de maneio a que as novilhas estão sujeitas na Ilha. Porém, onze das eliminadas para TE (47,8%: anovulação 7; anestro 2; e CL de desenvolvimento inadequado 2) poderão tê-lo sido em virtude de uma incorrecta interpretação dos sinais de cio. No entanto, na globalidade, os produtores demonstraram que foram capazes de alterar a rotina habitual das suas explorações de forma a respeitarem as exigências de um correcto protocolo de detecção visual de cios. São vários os trabalhos que referem resultados de campo com embriões sexados e congelados: Chagas e Silva e Cidadão (1997) obtiveram uma eficiência de 54,5%, após a transferência de 22 embriões da raça Frísia Holstein, importados do Canadá; Shea (1999) registou uma taxa de gestação de 37% (91/244) entre 1992 e 1997 e atribuíu a baixa eficiência à falta de experiência técnica, uma vez que, em 1998, ainda que com apenas 29 transferências, já tinham melhorado os resultados para 66%; Lacaze et al. (2007), após a transferência de 205 embriões, ao abrigo de um programa comercial, conseguiram uma taxa de gestação de 51,7%. Tendo em consideração os dados atrás referidos, o presente trabalho, com os registos de uma taxa de gestação global de 63,2% (48/76) e das parcelares de 63,1% (41/65) para os embriões sexados e de 63,6% (7/11) para os embriões não sexados, revelou elevada eficiência. Os resultados agora obtidos indicam que, nas condições de maneio produtivo a que as novilhas da Ilha Graciosa estão sujeitas, é possível a transferência, com sucesso, de embriões sexados e congelados. Porém, apenas foi ultrapassada a primeira fase do Programa. Resta esperar que os proprietários, com a colaboração/supervisão dos Serviços, saibam recriar eficientemente, as fêmeas de elite que já estão a nascer, de forma que as mesmas possam expressar cabalmente o seu potencial genético, quer em termos de produção de embriões de 2ª geração, perpetuando o ciclo com menores custos, quer em termos produtivos. Agradecimentos O autor agradece ao Director Regional do Desenvolvimento Agrário, Eng. Joaquim Pires, o convite para elaborar um protocolo de colaboração entre a Direcção Regional do Desenvolvimento Agrário e a Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa, para o que garantiu todas as condições necessárias à obtenção dos resultados agora registados. Agradece igualmente ao Presidente do Conselho Directivo da Faculdade de Medicina Veterinária, Prof. Doutor Luís Tavares, a autorização para a participação/execução da componente técnica do protocolo e pelo apoio a cada momento. À Eng. Ana Luísa Pavão (DRDA) e ao Eng. Hélder Bettencourt (SDAG) pela colaboração na elaboração do protocolo, na selecção e acompanhamento dos produtores nas várias fases do trabalho de campo e, sobretudo, pelo espírito de equipa que se estabeleceu. A todos os técnicos do SDAG que, de alguma forma, participaram no Programa, pois também a eles se devem os resultados agora obtidos. A todos os produtores que cederam as suas novilhas para receptoras e que, interiorizando as exigências da tecnologia, contribuiram activamente para o sucesso desta fase do Programa Por fim, à Prof. Doutora Isabel Neto pela ajuda no tratamento estatístico dos dados. Bibliografia Bredbacka P (1998). Recent developments in embryo sexing and its field application. Reprod Nutr Dev, 38, 605-613. Chagas e Silva JN e Cidadão MR (1997). Transferência directa de embriões sexados de bovino, importados do Canadá. Em: Publicações do 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 3-6 Jul., Estoril (Portugal), Vol. II, pp. 205-211. Colleau JJ (1991). 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