2. FATORES FÍSICO-QUÍMICOS PRESENTES NO SUBSTRATO DE CULTIVO DE Pleurotus sp.

10 INTRODUÇÃO GERAL Os basidiomicetos Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes são fungos lignocelulósicos com capacidade de degradar diversos materiais, devido à produção de enzimas extracelulares, principalmente enzimas lignolíticas como a lacase (BALDRIAN et al., 2005; GIANFREDA et al., 1999; LECHNER; PAPINUTTI, 2006; POPPE, 2005; SILVA et al., 2005). Esta enzima atua em materiais lignocelulósicos, permitindo a utilização de subprodutos da agroindústria, ricos em lignina e celulose, para o cultivo de cogumelos. Sendo assim, o cultivo de cogumelos é uma forma de agregar valor a resíduos que seriam descartados e produzir biomassa de interesse terapêutico e nutricional (EIRA, 2003; ISHIKAWA et al., 2001; SHARMA; MADAN, 1993; SOUZA-PACCOLA et al., 2004; WASSER; WEIS, 1999). Alguns biocompostos de interesse terapêutico ou nutricional produzidos por estes fungos podem ser extraídos diretamente do micélio, não necessitando a formação de basidiocarpo, reduzindo assim o tempo e os custos de produção. Outro processo que utiliza o micélio é a produção de inoculantes para produtores de cogumelos (EIRA, 2003; HWANG et al; 2005; MATA et al., 2001; SANCHEZ, 2004; SHU et al., 2006). Dessa forma o desenvolvimento de substratos para o crescimento micelial de fungos é uma alternativa para acelerar o processo de obtenção de biocompostos. A manutenção adequada do micélio destes fungos é necessária para a preservação de suas características biológicas. A criopreservação é uma das técnicas mais utilizadas na preservação de fungos, podendo utilizar temperaturas de -70 ºC a -196 ºC (PUTZKE; PUTZKE, 1998). A utilização de temperaturas mais elevadas, como de -20ºC neste processo o torna mais acessível (HUBÁLEK, 2003; MATA; PEREZ-MÉRLO, 2003; MATA; SALMONES, 2005; PUTZKE; PUTZKE, 1998), Sendo assim, no artigo 1 foi realizado crescimento micelial de Pleurotus sp e no artigo 2 o crescimento micelial Lentinula edodes, em diferentes subprodutos da agroindústria, caracterizados físico-quimicamente. Primeiramente o micélio foi crescido em meios de cultivo em placa de Petri e posteriormente, baseado nos melhores meios de cultivo em placas de Petri, o fungo foi cultivado em substratos de cultivo com diferentes granulometrias em tubos de borosilicato. Em ambos os casos

11 mantiveram-se fixa a relação carbono-nitrogênio (C/N). Após estas etapas foi realizada a determinação da atividade da enzima lacase nos substratos com maior crescimento micelial em tubos de borosilicato, e adicionado indutores de produção da enzima de acordo com planejamento fatorial fracionário. Nos artigos 3 e 4 realizou-se a criopreservação de Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes, respectivamente. Para a preservação das linhagens foi realizado primeiramente um teste de inibição do crescimento micelial por diferentes concentrações de crioprotetores. Em seguida, selecionou-se a porcentagem de crioprotetor que causou menor porcentagem de inibição e cresceram-se os fungos em diferentes grãos ou cilindro de meio batata-dextrose-ágar. Assim, o fungo foi criopreservado em diferentes substratos e com adição de diversos crioprotetores nas temperaturas de -20 ºC ou -70 ºC. A recuperação do fungo foi feita após um ano de congelamento, em meio de cultivo batata-dextrose-ágar.

12 2. FATORES FÍSICO-QUÍMICOS PRESENTES NO SUBSTRATO DE CULTIVO DE Pleurotus sp. 2.1. INTRODUÇÃO A produção anual de resíduos da agricultura é estimada em 500 milhões de toneladas, sendo parte utilizada para alimentação animal e outra grande parte acumulada no ambiente (POPPE, 2005; RAJARATHNAM; BANO, 1987). O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de soja (Glycine max), mandioca (Manihot esculenta) e milho (Zea mays). Grande parte da produção nacional é proveniente do estado do Paraná, sendo o Estado também produtor de arroz (Oryza sativa) e trigo (Triticum aestivum) (PARANÁ, 2007). O processamento destes vegetais gera resíduos em função do processo tecnológico adotado, podendo os subprodutos serem constituídos de fibras, farelos, bagaços, cascas e outros materiais lignocelulósicos com potencial para o crescimento diversos microrganismos (CEREDA, 2001; HOSENEY, 1991). Os cogumelos comestíveis são uma alternativa de melhor utilização destes subprodutos, através do processo de bioconversão, auxiliando na diminuição do acúmulo destes resíduos e gerando biomassa de interesse comercial (POPPE, 2005; SILVA et al., 2005). Os fungos do gênero Pleurotus possuem capacidade de colonizar uma variedade de substratos quando comparado a outros fungos (POPPE, 2005), exigindo uma menor complexidade das técnicas de cultivo quando comparado com fungos do gênero Agaricus (SILVA et al., 2007). Este fato se deve principalmente pela produção de grande quantidade de enzimas extracelulares lignocelulóticas como xilanases, celulases e lacases (BALDRIAN et al., 2005). A lacase é a principal enzima envolvida na degradação de lignina do sistema lignolítico de fungos (GIANFREDA et al., 1999), sendo sua atividade fortemente influenciada pela linhagem, composição do substrato e condições de cultivo do fungo (ELISASHIVILI, 2008; HOU et al., 2004; STAJIC et al., 2006). As propriedades físicas do substrato de cultivo incluindo natureza cristalina, área de superfície, porosidade e principalmente tamanho da partícula são essenciais para a atividade enzimática (PANDEY, 2003). Existe uma diversidade de resíduos lignocelulósicos

13 regionais que apresentam estas características e que podem ser utilizados como substrato. Devido à sua capacidade de degradar compostos fenólicos, a lacase pode ser aplicada em diversas áreas da indústria, como branqueamento e aumento da resistência do papel e tratamento de efluentes (WIDSTEN; KANDELBAUER, 2008). Sendo assim é importante o aumento da habilidade dos basidiomicetos produzirem lacase para aplicações industriais (HOU et al., 2004). O aumento na produção de lacase por Pleurotus ostreatus pode ocorrer com a adição de indutores (ARORA; GILL, 2001; BALDRIAN, 2003; BALDRIAN et al., 2005; BALDRIAN; GABRIEL, 2002). Além da habilidade de crescer em grande variedade de resíduos, o gênero Pleurotus possui alto valor nutricional (SHARMA; MADAN, 1993) e capacidade de produzir biocompostos antitumorais (WASSER; WEIS, 1999) e hipocolesterolêmicos (HOSSAIN et al., 2003). Os diferentes biocompostos produzidos por cogumelos podem ser extraídos diretamente do micélio do fungo (HWANG et al., 2005; SHU et al., 2006), não necessitando o desenvolvimento do corpo de frutificação. Isto diminuiria o custo do processo, pois envolve um menor número de mão de obra e de etapas de cultivo. Portanto, a análise do crescimento micelial, bem como a otimização deste processo é fundamental para a produção de princípios ativos terapêuticos em escala industrial. Outro processo que utiliza a produção de biomassa micelial é a indústria de produção de inoculantes (spawn). Inoculantes são propágulos viáveis do fungo, geralmente em veículo sólido, utilizados para colonizar o substrato de produção (EIRA, 2003). Segundo Herrera (2001), cerca de 80% dos produtores de cogumelos não produz substrato de cultivo próprio, encarecendo o produto final aos consumidores. Portanto, a busca de matérias-primas alternativas regionais poderia abrir perspectivas de preparo de inóculo e de substrato próprios, evitando os custos de transporte de outras regiões (DIAS et al., 2003). Buscando a melhor utilização dos resíduos regionais agrícolas o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição físico-química para a produção de biomassa e de lacase de diferentes formulações de substratos a partir de subprodutos da agroindústria para o gênero Pleurotus.

14 2.2 MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Paranaense - Campus sede de Umuarama, Paraná, Brasil. Foram utilizadas quatro linhagens do gênero Pleurotus: Pleurotus ostreatus (U6/8), Pleurotus ostreatus (U6/9), Pleurotus florida (U6/10), Pleurotus ostreatus (U2/11), provenientes da micoteca da Universidade Estadual de Londrina - UEL. O fungo foi cultivado em meio batata-dextrose-ágar (BDA) (39 g/l) a 25 ºC em estufa sem circulação de ar. Após a recuperação do vigor de crescimento, foram selecionadas como inóculo placas com ramificação homogênea, sem setoriamento. 2.2.1 Crescimento do fungo em placas de Petri As matérias-primas utilizadas para compor os meios de cultivo foram: fibra de soja (FS), farelo de trigo (FT), farelo de arroz (FA), grãos de milho (GM), sabugo de milho (SM), fibra de mandioca (FM) e serragem de eucalipto (SE). A FM foi obtida a partir de tubérculos, provenientes do horto medicinal da Universidade Paranaense, descascados, lavados e triturados com água em liquidificador. A massa obtida foi transferida para um filtro de pano e lavada com água corrente. A FM resultante foi seca em estufa com circulação de ar a 45 ºC por dez horas. A FS (Fibrarich FN 17/01/2001) foi fornecida moída e desidratada pela empresa Solae do Brasil. Os demais subprodutos foram obtidos de cooperativas da região. Todas as matériasprimas, desidratadas, foram moídas em liquidificador e peneiradas a fim de obter granulometria menor que 355 µm, e em seguida armazenadas em freezer a -20 ºC. As matérias-primas foram analisadas quanto o seu teor de nitrogênio determinado pelo método de Kjeldahl, umidade em estufa a 105 ºC até massa constante, cinzas em mufla a 550 ºC. Em seguida foram calculados os diferentes meios de cultivo para obter-se relação C/N de 30 (WU et al., 2004). A relação C/N foi calculada, conforme Griensven (1988), considerando que 50% da matéria orgânica é composta por carbono (conteúdo de massa seca total menos cinzas, multiplicado por 0,5). O meio de cultivo foi preparado com 15 g/l de ágar e 30 g/l de diferentes misturas de matéria-prima (Tabela 1) e então autoclavado a 121 ºC por 20 min. Quando necessário o ph do meio foi ajustado para 6,0 com NaOH ou HCl

15 previamente esterilizados por filtração (filtro de 0,22 µm), em seguida os meios foram vertidos em placas de Petri (90 mm). Para a inoculação dos meios de cultivo foi retirado um cilindro de cinco milímetros de diâmetro da área periférica de crescimento do micélio e disposto no centro da placa de Petri contendo meio de cultivo, tomando-se o cuidado para que o micélio do cilindro ficasse em contato direto com o meio de cultivo. As placas inoculadas foram dispostas ao acaso para crescimento em estufa a 25 ºC no escuro por 6 dias. O crescimento foi acompanhado pela medida do diâmetro do micélio através de paquímetro em quatro pontos diferentes das placas de Petri, sendo estes valores utilizados para a determinação da média de crescimento fúngico de cada meio de cultivo. A densidade micelial e possíveis degenerações do crescimento foram registradas através de fotografia digital ao final do experimento. Todos os tratamentos tiveram quatro réplicas. A média e o desvio padrão do crescimento do micélio foram calculados e as diferenças determinadas pela análise de variância e teste de Tukey (p<0,05). 2.2.2 Crescimento em tubos de borosilicato Os melhores meios de cultivo e a melhor linhagem do crescimento em placas de Petri foram selecionadas para esta etapa experimental. Foi efetuada uma estratificação granulométrica das matérias-primas componentes do substrato de cultivo em quatro faixas principais, sendo determinado então, dois níveis de granulometria. Cada diferente faixa foi analisada quanto à quantidade de nitrogênio, carbono, cinzas e umidade conforme descrito no item 2.1. A formulação dos substratos foi calculada para manter a relação C/N de 30 (WU et al., 2004) e todos os tratamentos tiveram quatro réplicas. Depois de misturados os componentes do substrato em Erlenmeyers e autoclavados com excesso de água ultra pura a 121 ºC por 10 min retirou-se o excesso de água e adicionou-se carbonato de cálcio (CaCO 3 ) para ajustar o ph para 6,0. Os substratos foram acondicionados nos tubos de borosilicato (de 300 mm por 30 mm) com densidade de 0,70 g/cm 3 e após 24 h da primeira autoclavagem foram novamente autoclavados a 121 ºC por 40 min.

16 Em seguida inoculou-se os tubos com cilindros miceliais de 30 mm de diâmetro da área periférica da colônia crescida em meio BDA, de forma a cobrir toda superfície de uma das extremidades do tubo, foram então armazenandos em estufa a 25 ºC, com cerca de 70% de umidade, no escuro. O crescimento micelial do fungo foi medido com paquímetro através de quatro medidas ao longo de cada tubo, sendo estes valores utilizados para a determinação da média de crescimento do fungo e desvio padrão. A densidade micelial e possíveis degenerações do crescimento foram registradas através de fotografia digital ao final do experimento. Os dados obtidos foram analisados e as diferenças determinadas pela análise de variância e teste de Tukey (p<0,05). 2.2.3 Determinação da atividade da lacase Com base nos resultados obtidos do crescimento em tubos de borosilicato, escolheu-se os dois melhores substratos de cultivo e realizou-se um planejamento fatorial fracionário. A linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus cresceu nos substratos acondicionados em tubos Falcon. A estes substratos foram adicionados água ultra pura em excesso e então autoclavados a 121 ºC por 10 min. Após o resfriamento foi removido o excesso de água, adicionado carbonato de cálcio (CaCO 3 ) para ajustar o ph para 6,0 e adicionada soluções de metais para indução da atividade da lacase (Tabela 1). As soluções de metais foram utilizadas nas seguintes concentrações: CuSO 4 (2mM), ZnSO 4 (1mM), Cd(NO 3 ) 2 (2mM), MnSO 4 (1mM) e Fe(SO 4 ) (1mM) (BALDRIAN; GABRIEL, 2002; GALHAUP et al., 2002; ROBINSON et al., 2001). Em seguida os tubos foram autoclavados a 121 ºC por 40 min, inoculados com o fungo e mantidos a 25 ºC por oito dias. Para a determinação da atividade da lacase foi obtido um extrato bruto (1:4) g do meio colonizado em tampão acetato de sódio (10 mm, ph 4,2), mantido em banho de gelo por 1 h com agitação de 30 segundos em vórtex, a cada 15 min. A mistura foi centrifugada a 9,5 g a 4 C, por 2 min, sendo o sobrenadante considerado o extrato bruto. A atividade de lacase foi medida pela redução da absorvância de uma mistura contendo 400 µl do extrato bruto, 1400 µl de água, 900 µl de tampão acetato de sódio 0,1 M (ph 5,0) e 300 µl de 1 mm de ABTS (C 18 H 18 N 4 O 6 S 4.2H 3 N). A reação

17 ocorreu a 30 C por 10 min. Após este período, a reação foi paralisada com a adição de 100 µl de ácido tricloroacético (5%). Foi então adicionado 8,5 ml de água ultra pura e realizada a leitura da absorvância a 420 nm. Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como 1 µmolar de ABTS oxidado por minuto. Para calcular a atividade enzimática, o coeficiente de absorção de 3,6 10 4 M -1 cm -1 foi utilizado. A fim de quantificar a porcentagem de lignina e celulose presente nos substratos, realizou-se análise de fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de detergente ácido (FDA). Sendo que FDN representam as fibras insolúveis em detergente neutro (lignina, celulose e hemicelulose), enquanto FDA representa a porcentagem de lignina e celulose, fibras insolúveis em detergente ácido (SILVA; QUEIROZ, 2002). Tabela 1. Níveis das variáveis indutores metálicos na produção de lacase estudadas no planejamento fatorial fracionário 2 6-2 (I-III). A sexta variável foi o substrato de crescimento definido pelo teste de crescimento em tubos de borosilicato (item 2.2). Variáveis Níveis (ppm) -1 +1 Cu 0,000 1,103 Zn 0,000 0,588 Fe 0,000 1,324 Cd 0,000 0,368 Mn 0,000 0,882

18 2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 2.3.1 Crescimento micelial em placas de Petri Na Tabela 2 é apresentada a análise físico-química das matérias-primas para o crescimento do fungo em placas de Petri. Observou-se, quanto ao teor de nitrogênio, que as matérias-primas ficaram divididas em dois grupos. Um grupo de maior quantidade de nitrogênio composto por FS, FT, FA e GM e outro grupo de menor quantidade de nitrogênio, composto pelo SM, FM e SE. Tabela 2. Análise físico-química das matérias-primas para meio de cultivo em placas de Petri (%), em base seca. Matéria -prima Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade FS 4,330 44,100 3,83 7,99 FT 2,600 42,310 5,04 10,34 FA 1,760 38,380 12,22 11,03 GM 1,620 43,830 1,15 11,18 SM 0,530 42,850 2,23 12,07 FM 0,090 44,990 0,39 9,64 SE 0,040 33,020 0,12 33,76 Legenda: FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, GM = milho, SM = sabugo de milho, FM = fibra de mandioca, SE = serragem de eucalipto. *Carbono calculado segundo Griensven (1988). Usualmente matérias-primas com maiores concentrações de nitrogênio são adicionadas a matérias-primas volumosas e com menores concentrações de nitrogênio. A fim de obter relação C/N de 30 (WU et al., 2004) os meios de cultivo foram formulados independentes deste aspecto (Tabela 3). O controle (CT) (Tabela 3) possui relação C/N de 28 não sendo alterada para 30 como os demais tratamentos para não modificar a porcentagem de matéria-prima usualmente utilizada.

19 Tabela 3. Composição dos meios de cultivo (M1 a M12 e controle (CT)) em g e porcentagem do meio, em base seca. MATÉRIA-PRIMA EM g (%) FS FT FA GM SM FM SE Total M1 9,6 (32) - - - - - 20,4 (68) 30,0 (100) M2-16,2 (54) - - - - 13,8 (46) 30,0 (100) M3 - - 22,2 (74) - - - 7,8 (26) 30,0 (100) M4 - - - 27,0 (90) - - 3,0 (10) 30,0 (100) M5 7,2 (24) - - - 22,8 (76) - - 30,0 (100) M6-12,9 (43) - - 17,1 (57) - - 30,0 (100) M7 - - 19,5 (65) - 10,5 (35) - - 30,0 (100) M8 - - - 25,5 (85) 4,5 (15) - - 30,0 (100) M9 9,9 (33) - - - - 20,1 (67) - 30,0 (100) M10-16,2 (54) - - - 13,8 (46) - 30,0 (100) M11 - - 22,2 (74) - - 7,8 (26) - 30,0 (100) M12 - - - 27,0 (90) - 3,0 (10) - 30,0 (100) CT - - 6,0 (20) - 24,0 (80) - - 30,0 (100) Legenda: FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, GM = grãos de milho, SM = sabugo de milho, FM = fibra de mandioca, SE = serragem de eucalipto. Na figura 1 é apresentada a média do crescimento micelial em placas de Petri das diferentes linhagens de Pleurotus, demonstrando sua capacidade em utilizar uma diversidade de substratos, com rápido crescimento micelial, confirmando o relato de Poppe (2005) sobre a capacidade do fungo de utilizar diversos resíduos agrícolas. Houve crescimento similar, em geral com baixo desvio padrão, entre as linhagens nos diferentes meios de cultivo, ressaltando a semelhança na capacidade de degradação de linhagens para um mesmo gênero (Figura 1). Maiores variações ocorreram com os meios de cultura M2 e M7, onde a linhagem 10-6 (dados não apresentados) apresentou menor crescimento em relação às demais, o que se deve

20 provavelmente a uma variação da linhagem que não está apta a degradar estes dois meios de cultivo. Os meios de cultivo com maior crescimento micelial foram M5, M6, M9 e M10 (Figura 1, Tabela 1). Os meios M9 e M10 são compostos por alta porcentagem de fibra de mandioca, que possui porosidade permitindo um melhor acesso enzimático do fungo e maior absorção de nutrientes, o que é também observado na fibra de soja com maior porosidade e capacidade ainda maior de absorção de água que a fibra de mandioca (LINDE; MACHADO, 2001). Já o farelo de trigo, que é o principal subproduto da moagem do trigo, diferentemente das fibras, é constituído de uma mistura heterogênea de fragmentos da camada hialina-aleurona dos grãos, sendo fonte de minerais, vitaminas e outros nutrientes de valor biológico (DI LENA et al., 1997). A FS e o FT são adequados para o crescimento micelial de Pleurotus, no entanto quando adicionado SE à mistura não apresentam o mesmo desempenho (Figura 1), isto se deve provavelmente a algum composto tóxico presente na SE. Os meios de cultivo M5 e M6 contêm porcentagens maiores de sabugo de milho, um material poroso que absorve grande quantidade de água e permite o acesso enzimático do fungo a nutrientes (RODRIGUEZ et al., 1998), sendo usualmente utilizado como material volumoso em substratos para cultivo de fungos (EIRA et al., 2005; GABRIEL, 2005). Segundo Neiva-Junior et al. (2007) o SM tem uma porcentagem de lignina e celulose de 16,04 e 28,99% respectivamente, o que propicia o cultivo de fungos com alta capacidade lignocelulótica. Menores concentrações de SM (M7 e M8) e de FM (M11 e M12) apresentaram crescimento micelial inferior a concentrações elevadas destas matérias-primas (Figura 1). Crescimento intermediário foi observado em meios de cultivo com FA ou GM, (Figura 1). O FA é o subproduto mais importante do arroz, sendo constituído pelo gérmem e pela camada de aleurona, rico em fibras, minerais e proteínas (ALENCAR; ALVARENGA, 1991). Embora seja muito utilizado na suplementação de substratos para cultivo de fungos (RAJARATHNAM; BANO, 1987; SINGH, 2000), observou-se crescimento inferior ao CT nos meios de cultivo com adição de farelo de arroz.

21 Diâmetro de crescimento do micélio (mm). 80 70 60 50 40 30 20 10 0 g f ef e e cde M1 M2 M3 M11 M7 M4 CT M8 M12 M6 M5 M9 M10 Meios de cultivo Figura 1. Crescimento médio do gênero Pleurotus (média das linhagens U6/8, U6/9, U6/10 e U2/11) após seis dias de crescimento em diferentes meios de cultivo. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). cd c b ab ab a a Os substratos com serragem de eucalipto apresentaram menor crescimento micelial (Figura 1). De acordo com Eira e Montini (1997), a serragem possui uma composição nutricional pobre, tornando-se indispensável sua correção com aditivos. Na Figura 1 observa-se que o aumento na concentração de SE diminui a produção de biomassa pelo fungo, sendo que o melhor resultado para a SE ocorreu quando misturada a 90% de milho (M4), resultado que se deve provavelmente a alta concentração de amido encapsulado na matriz protéica no endosperma de milho, fonte rica de carbono e nitrogênio (ECKHOFF; PAULSEN, 1996). Segundo Figura 1, maiores concentrações de GM proporcionaram maior crescimento micelial. A análise visual da densidade do micélio (dados não apresentados) mostrou vigor semelhante entre as diferentes linhagens nos diversos meios de cultivo, com exceção do M1, que possui maior porcentagem de SE e apresentou densidade micelial inferior aos demais, evidenciando a escassez de nutrientes neste meio de cultivo. 2.3.2 Crescimento em tubos de borosilicato Para a formulação dos substratos em tubos de borosilicato foi realizada uma estratificação granulométrica das matérias-primas com tamisador. Na faixa 1 (F1) o tamanho das partículas foram de 1,7 a 5 mm, faixa 2 (F2) de 0,8 a 1,7 mm, faixa 3

22 (F3) de 0,3 a 0,8 mm e faixa 4 (F4) menor que 0,3 mm. Foram determinados dois níveis de granulometria. No primeiro nível (G1) usou-se a faixa F1 para a matériaprima com menor quantidade de nitrogênio e F2 a F4 para a matéria-prima com maior quantidade de nitrogênio. No segundo nível (G2) usou-se a faixa F2 a F4 para ambas as matérias-primas do substrato. Na G2 as matérias-primas foram adicionadas de forma proporcional para cada faixa, assim como no G1 para as faixas F2 a F4. Realizou-se então, uma análise físico-química das diferentes faixas de granulometria para cada matéria-prima, conforme Tabela 4, mantendo-se a relação C/N em 30 e a densidade média de 0,69 ± 0,08 g/cm 3. Os controles (Tabela 5) possuem relação C/N de 53 (CTG1) e 33 (CTG2) não sendo alteradas para não modificar a porcentagem de matéria-prima usualmente utilizada. Pode se observar variação da quantidade de compostos de uma mesma matéria-prima dependendo do tamanho das partículas (Tabela 4). Isto esta relacionado à moagem dos subprodutos, onde é esperado que os minerais, por normalmente encontrarem-se na forma de sais de fácil quebra, concentrem-se nas frações de menor granulometria (FENNEMA, 2000) alterando assim as frações orgânicas e inorgânicas dos substratos de cultivo. A fração orgânica é responsável pelo fornecimento de carbono e nitrogênio, enquanto que a fração inorgânica exerce importante papel na disponibilização de micronutrientes normalmente envolvidos no funcionamento dos sistemas de transporte celular e das reações enzimáticas (BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 2000; LEHNINGER et al., 1995). Desta forma, o conhecimento da composição química das frações granulométricas do substrato de cultivo é importante para a compreensão do crescimento do fungo em diferentes substratos. Tabela 4. Análise físico-química das matérias-primas utilizadas para o crescimento em tubos de borosilicato em porcentagem (base seca). Resultado de análise (%) MP G Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade F1 0,453 44,712 1,766 8,810 SM F2 0,817 44,270 2,301 9,160 F3 1,038 44,250 2,130 9,370 F4 1,229 43,006 4,318 9,670 FS F2 5,520 43,497 3,736 9,270 F3 4,590 43,826 3,668 8,680

23 F4 4,834 43,616 3,959 8,810 F2 1,959 42,711 5,229 9,350 FA F3 2,508 41,762 7,696 8,780 F4 2,667 39,455 12,040 9,050 F2 3,575 41,935 5,421 10,710 FT F3 3,820 42,038 4,794 11,130 F4 3,299 42,514 3,142 11,830 Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, SM = sabugo de milho, F1 a F4 = faixa de granulometria. *Carbono calculado segundo Griensven (1988). Tabela 5. Composição dos substratos (M5G1 a M7G2 e controles (CTG1 e CTG2)) em g e porcentagem do substrato, em base seca. SUBSTRATO EM g (%) MP G M5G1 M5G2 M6G1 M6G2 M7G1 M7G2 CTG1 CTG2 SM FS FA FT F1 29,0 (74,0) F2 - F3 - F4 - F2 F3 F4 3,4 (8,6) 3,4 (8,6) 3,4 (8,6) - 10,6 (27,0) 10,6 (27,0) 10,6 (27,0) 2,5 (6,3) 2,5 (6,3) 2,5 (6,3) 23,6 (60,0) - - - - 9,1 (23,3) 9,1 (23,3) 9,1 (23,3) F2 - - - - F3 - - - - F4 - - - - F2 - - F3 - - 16,7 (43,0) - - - - 6,5 (17,3) 6,5 (17,3) 6,5 (17,3) 32,0 (80,0) - - - - 10,1 (26,7) 10,1 (26,7) 10,1 (26,7) - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5,2 (13,3) 5,2 (13,3) 3,9 (10,0) 3,9 (10,0) 7,5 (19,0) 7,5 (19,0) 7,5 (19,0) 6,6 (16,0) 6,6 (16,0) 6,6 (16,0) 2,4 (6,6) 2,4 (6,6) 2,4 (6,6) 3,0 (6,6) 3,0 (6,6) 3,0 (6,6) - - - - - - - - 5,2 3,9 F4 - - - - - - (13,3) (10,0) Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, SM = sabugo de milho, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, F1 a F4 = faixa de granulometria.

24 Os meios de cultivo utilizados para crescimento micelial em placas de Petri que continham FM ou GM não foram utilizados para a fase experimental de crescimento do fungo em tubos de borosilicato (Tabela 2). Ambas as matériasprimas, são ricas em amido, que por sua vez, gelatinizam em temperaturas acima de 52 ºC, para FM, e 62 ºC para GM (BELITZ; GROSCH, 1997). Devido à autoclavagem do substrato haveria a formação do gel, provavelmente limitando a passagem de oxigênio ao longo do tubo e inviabilizando o crescimento do micélio. Desta forma, algumas matérias-primas nutricionalmente adequadas para o crescimento micelial em placas de Petri, não tem o mesmo resultado, em maior escala, principalmente no sistema axênico de produção, em que calor é utilizado para esterilizar o substrato. Entretanto especula-se que em pequenas quantidades, desde que este complexo seja capaz de ser degradado pelo fungo, pode ser fonte de reserva de água e nutrientes para produção em longo prazo. Isto pode ser verificado na Figura 2, onde o substrato M7G2 apresentou o menor crescimento micelial, devido alta concentração de FA, que sofreu gelatinização durante a autoclavagem, inviabilizando o crescimento micelial. Entretanto o substrato M7G1, que possui a mesma formulação, exceto a granulometria, não apresentou gelatinização visível do FA. Este fator físico do substrato proporcionou um crescimento micelial no M7G1 cerca de 10 vezes maior que no M7G2. Neste caso a maior granulometria do substrato proporcionou uma maior aeração evitando o bloqueio físico do micélio. Observou-se que a G1 proporcionou maior crescimento micelial para todos os substratos, com exceção do M5G1 e M5G2, em que a menor granulometria apresentou melhores resultados (Figura 2). A maior granulometria proporciona uma maior aeração do meio e permite ao micélio crescer em superfície mais rapidamente na maioria dos meios. Entretanto para o substrato M5G1 e M5G2, a menor granulometria não implicou em limitação da aeração permitindo, portanto, um melhor aproveitamento do substrato devido a maior área específica do meio. O FA que não foi eficiente nas placas de Petri apresentou resultado semelhante nos tubos de borosilicato, exceto no CTG1. Nos substratos M7G1 e M7G2 foi utilizado uma maior quantidade de FA (Tabela 5), isto sugere que houve gelatinização alterando a matéria-prima de forma a dificultar a sua metabolização e, portanto, a menor velocidade de crescimento do micélio verificado claramente no

25 substrato M7G2. No CTG2 a menor granulometria do SM dificultou o maior crescimento do fungo de forma similar a maioria dos tratamentos com esta granulometria. Já o CTG1 apesar de nutricionalmente ser menos eficiente, apresentou condições melhores de aeração o que permitiu o maior crescimento do fungo. Portanto os fatores nutricionais e de aeração tem importância na decisão do tipo de formulação utilizada e merece atenção por parte dos produtores. Média do crescimento micelial (mm). 300 250 200 150 100 50 0 5 9 14 19 23 27 30 35 40 44 49 Tempo (Dias) Figura 2. Crescimento micelial da linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus durante 49 dias em tubos de borosilicato. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). b a c d M5G1 M5G2 M6G1 M6G2 M7G1 M7G2 CTG1 CTG2 A cinética de crescimento micelial (Figura 2) mostra um crescimento uniforme entre os tratamentos ao longo do tempo, com taxas de crescimento semelhantes, exceto do M7G2. Para M5G2, M6G1 e CTG1 a velocidade média de crescimento do micélio foi de 6,1 mm/dia, para M5G1 foi de 4,9 mm/dia e para M6G2, M7G1, e CTG2 foi de 3,7 mm/dia. Na Figura 2 observa-se que ao longo do tempo, houve uma diminuição do crescimento do micélio do dia 27 ao dia 35, provavelmente devido à diminuição na demanda de oxigênio na parte interna do tubo, retornando a velocidade de crescimento conforme o micélio se aproxima da extremidade do tubo. Isto é verificado no crescimento de inóculo (spawn) em que ocorre a diminuição da velocidade de crescimento do micélio após a metade do frasco ou saco. Dessa forma, a criação de bolsões de ar nestes recipientes pode permitir a manutenção da velocidade de crescimento do micélio diminuindo o tempo de colonização do substrato e evitando o surgimento de contaminantes oportunistas.

26 A densidade micelial foi semelhante entre os substratos no tubo de borosilicato, confirmando os resultados de densidade micelial encontrados em placas de Petri. 2.3.3 Determinação da atividade da lacase Na Figura 3 são apresentados os efeitos das variáveis na passagem do nível inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase. A variável que mais influenciou a produção da lacase foi o substrato, sendo que os indutores avaliados exerceram menor efeito na atividade enzimática (Figura 3). Observa-se que a produção de lacase aumenta quando utilizado o substrato M5G2 e diminui quando utilizado o substrato CTG1. Isto se deve provavelmente ao tamanho da partícula de SM, que sendo menor em M5G2 apresenta maior área de contato para ação da enzima, permitindo o acesso do fungo aos nutrientes. Substrato * Cd * Mn * Variáveis Zn * Cu * Fe 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Efeito (U/g meio seco) Figura 3. Efeito em U/g (base seca) das variáveis na passagem do nível inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase para a linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus. *Indicativo de diferença significativa pela análise de variância (p<0,05).

27 Pandey (2003) cita o tamanho da partícula como propriedade física essencial para a atividade enzimática, outros pontos importantes destacados pelo autor são natureza cristalina, porosidade e área de superfície do substrato. Membrillo et al. (2008) observaram que a razão geométrica e o tamanho das fibras do bagaço da cana-de-açúcar influenciam fortemente o perfil da atividade enzimática do gênero Pleurotus. Isso se deve provavelmente, ao perfil da lacase que possui massa molecular alta, não conseguindo penetrar fundo nos tecidos, agindo na lignina presente na superfície das partículas do substrato (WIDSTEN, KANDELBAUER, 2008). Uma maior concentração de lignina no substrato aumenta a atividade da lacase (NILADEVI; PREMA, 2008), no entanto, observamos que a disponibilidade da lignina é fundamental. Na tabela 6 é apresentada a composição química do substrato, observa-se que a porcentagem de minerais é semelhante nos dois substratos, enquanto o conteúdo protéico é o dobro em M5G2, isto se deve a granulometria, pois em partículas menores concentra-se compostos cristalinos como as proteínas, que podem facilmente sofrer quebra mecânica. Já em frações mais grossas concentram-se fibras de maior elasticidade, como lignina e celulose (BELITZ; GROSCH, 1997; FELLOWS, 2006; FENNEMA, 2000). Em relação às fibras, observa-se que uma maior quantidade de lignocelulose está presente no CTG1 (Tabela 6). Considerando que no SM cerca de 35% da lignocelulose é lignina (NEIVA-JUNIOR et al., 2007), seria esperado que este substrato de cultivo induzisse uma maior atividade da lacase. Contudo isto não foi verificado (Figura 3), indicando que a área de contato entre o substrato e a enzima possui maior efeito para sua maior produção. Tabela 6. Conteúdo de cinzas, proteínas, fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de detergente ácido (FDA) nos substratos de cultivo para determinação da atividade da lacase na linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus. Valores expressos em porcentagem de base seca. Substrato Cinzas Proteína FDN FDA M5G2 2,81 10,55 70,29 30,84 CTG1 2,86 5,19 77,49 49,92

28 Em relação aos indutores avaliados observou-se, com exceção do metal Fe, que todos os outros apresentaram efeito significativo no aumento da produção de lacase (Figura 3). Baldrian et al. (2005) verificaram um aumento na degradação de lignocelulose por Pleurotus ostreatus na presença de Cu, Mn e Zn. Cu e Mn participam diretamente do processo de degradação da lignina, o primeiro atua como cofator para o centro catalítico da lacase e o Mn participa diretamente do ciclo da peroxidase Mn-dependente, outra enzima envolvida na degradação da lignina (BALDRIAN, 2003; PALMIERI, et al. 2000). O Cd também é citado como indutor do aumento da atividade da lacase em Pleurotus ostreatus em concentrações de 1 a 5 mm (BALDRIAN; GABRIEL, 2002). Segundo Singhal e Rathore (2001) o Zn é necessário para o funcionamento do sistema enzimático lignolítico, atuando na mineralização e solubilização da lignina. Sendo assim a adição de indutores metálicos contribui de forma significativa para o aumento da produção de lacase por Pleurotus ostreatus (U6/9).

29 2.4 CONCLUSÃO Em função da metodologia adotada e das condições experimentais concluiuse que o gênero Pleurotus é capaz de degradar uma ampla variedade de substratos, sendo as matérias-primas mais adequadas ao crescimento micelial em placas de Petri a fibra de mandioca, sabugo de milho, fibra de soja e farelo de trigo. Já a serragem não foi adequada nas condições avaliadas, demonstrando a influência da composição química do meio de cultivo no crescimento micelial. Diferentes granulometrias afetam a composição física e nutricional do substrato de cultivo e interferem no crescimento do fungo. Tamanho de partículas diferentes, de uma mesma matéria-prima, tem relação C/N distintas. O maior diâmetro da partícula do substrato proporciona maior crescimento micelial devido à maior aeração do substrato. As matérias-primas que gelatinizam após autoclavagem (121 ºC) não são adequadas ao crescimento micelial axênico de fungos quando em quantidades iguais ou superiores a 48% do substrato. O aumento da atividade da lacase esta relacionado diretamente a maior quantidade de lignina disponível pela maior área de contato das partículas (menores) do substrato. AGRADECIMENTOS À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e pela bolsa de estudos concedida.

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35 3. FATORES FÍSICO-QUÍMICOS PRESENTES NO SUBSTRATO PARA O CULTIVO DE Lentinula edodes 3.1 INTRODUÇÃO A produção anual de resíduos da agricultura é estimada em 500 milhões de toneladas sendo que enquanto uma parte é utilizada para alimentação animal, outra grande parte é acumulada no ambiente (POPPE, 2005; RAJARATHNAM; BANO, 1987). O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de soja (Glycine max), mandioca (Manihot esculenta) e milho (Zea mays). Grande parte da produção nacional é proveniente do estado do Paraná, sendo o Estado também produtor de arroz (Oryza sativa) e trigo (Triticum aestivum) (PARANÁ, 2007). O processamento dos vegetais gera resíduos em função do processo tecnológico adotado, podendo os subprodutos serem constituídos de fibras, farelos, bagaços, cascas e outros materiais lignocelulósicos com potencial para o crescimento de microrganismos (CEREDA, 2001; HOSENEY, 1991). Os cogumelos comestíveis são uma alternativa de melhor utilização destes subprodutos, através do processo de bioconversão, auxiliando na diminuição de resíduos e gerando biomassa de interesse comercial (POPPE, 2005; SILVA et al., 2005). O fungo Lentinula edodes possui enzimas extracelulares lignocelulóticas capazes de degradar eficientemente materiais lignocelulósicos (LECHNER; PAPINUTTI, 2006). A lacase é a principal enzima envolvida na degradação de lignina do sistema lignolítico de fungos (GIANFREDA et al., 1999), sendo sua atividade fortemente influenciada pela linhagem, composição do substrato e condições de cultivo do fungo (ELISASHIVILI, 2008; HOU et al., 2004; STAJIC et al., 2006). As propriedades físicas do substrato de cultivo incluindo natureza cristalina e amorfa, área acessível, área de superfície, porosidade e principalmente tamanho da partícula são essenciais para a atividade enzimática (PANDEY, 2003). Existe uma diversidade de resíduos lignocelulósicos regionais que apresentam estas características e que podem ser utilizados como substrato.

36 Devido à sua capacidade de degradar compostos fenólicos, a lacase pode ser aplicada em diversas áreas da indústria, como branqueamento e aumento da resistência do papel e tratamento de efluentes (WIDSTEN; KANDELBAUER, 2008). Sendo assim é importante o aumento da habilidade dos basidiomicetos produzirem lacase para aplicações industriais (HOU et al., 2004). O aumento na produção de lacase por Pleurotus ostreatus pode ocorrer com a adição de indutores (ARORA; GILL, 2001; BALDRIAN, 2003; BALDRIAN et al., 2005; BALDRIAN; GABRIEL, 2002). O interesse da comunidade científica internacional pelos cogumelos tem aumentado devido às propriedades medicinais (EIRA, 2003). O cogumelo Lentinula edodes, conhecido como shiitake, exibe propriedades antimicrobianas (ISHIKAWA et al., 2001), antitumorais (SUZUKI et al., 1994), antimutagênicas (SOUZA-PACCOLA et al., 2004); antivirais (SAZAKI et al., 2001; SUZUKI et al., 1990) e hipocolesterolêmicas (SAZAKI et al., 2001). Os diferentes biocompostos produzidos por cogumelos podem ser extraídos diretamente do micélio do fungo (HWANG et al., 2005; SHU et al., 2006), não necessitando o desenvolvimento do corpo de frutificação, o que diminui o custo do processo, pois envolve um menor número de mão de obra e etapas de produção. Desta forma, a análise do crescimento micelial e a otimização deste processo é fundamental para a produção de princípios ativos terapêuticos em escala industrial. Outro processo que utiliza a produção de biomassa micelial é a indústria de produção de inoculantes (spawn). Inoculantes são propágulos viáveis do fungo, geralmente em veículo sólido, utilizados para colonizar o substrato de produção (EIRA, 2003). Segundo Herrera (2001), cerca de 80% dos produtores de cogumelos não produz substrato de cultivo próprio, encarecendo o produto final aos consumidores. Portanto, a busca de matérias-primas alternativas regionais poderia abrir perspectivas de preparo de inóculo e de substrato próprios, evitando os custos de transporte de outras regiões (DIAS et al., 2003). Buscando substratos mais adequados a produção micelial e potencial produção de cogumelos o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição físicoquímica de diferentes formulações de substratos para o crescimento micelial a partir de subprodutos da agroindústria para o fungo Lentinula edodes.

37 3.2 MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Paranaense - Campus sede, Umuarama, Paraná, Brasil. Foram utilizadas as linhagens U6/1, U6/11 e U6/12 de Lentinula edodes provenientes da micoteca da Universidade Estadual de Londrina - UEL. O fungo foi cultivado em meio batata-dextrose-ágar (BDA) (39 g/l) a 25 ºC em estufa sem circulação de ar. Após a recuperação do vigor de crescimento, foram selecionadas como inóculo placas com crescimento radial, ramificação homogênea e sem setoriamento. 3.2.1 Crescimento em placas de Petri As matérias-primas utilizadas para compor os meios de cultivo foram: fibra de soja (FS), farelo de trigo (FT), farelo de arroz (FA), grãos de milho (GM), sabugo de milho (SM), fibra de mandioca (FM) e serragem de eucalipto (SE). A FM foi obtida a partir de tubérculos, provenientes do horto medicinal da Universidade Paranaense, descascados, lavados e triturados com água em liquidificador. A massa obtida foi transferida para um filtro de pano e lavada com água corrente, em seguida foi seca em estufa com circulação de ar a 45 ºC por dez horas. A FS (Fibrarich FN 17/01/2001) foi fornecida pela empresa Solae do Brasil. Os demais subprodutos foram obtidos de cooperativas da região. Todas as matérias-primas desidratadas foram moídas em liquidificador e peneiradas a fim de obter granulometria menor que 355µm, e armazenadas em freezer a -20 ºC. As matérias-primas foram analisadas quanto o seu teor de nitrogênio determinado pelo método de Kjeldahl, umidade em estufa a 105 ºC até massa constante e cinzas em mufla a 550 ºC. A partir destes resultados, os diferentes meios de cultivo foram calculados a fim de obter-se relação C/N de 25 (OEI, 1996). A relação C/N foi calculada conforme Griensven (1988), considerando que 50% da matéria orgânica é composta por carbono (conteúdo de massa seca total menos cinzas, multiplicado por 0,5). O meio de cultivo foi preparado com ágar (15g/L) e 30g/L de diferentes misturas de matéria-prima e então autoclavado a 121 ºC por 20 min. Quando necessário o ph do meio foi ajustado para 6,0 com NaOH ou HCl