Crescimento Microbiano

ATENÇÃO UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA DISCIPLINA: BIOQUÍMICA GERAL PROFESSORAS: Adriana Silva Lima e Márcia Aparecida Cezar Crescimento Microbiano Em Microbiologia quando falamos em crescimento microbiano estamos nos referindo ao número e não ao tamanho das células Microrganismos em crescimento estão aumentando seu número É importante entender as condições necessárias para o crescimento microbiano CRESCIMENTO MICROBIANO: Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares. O entendimento das influências ambientais ajuda a explicar a distribuição dos microrganismos na natureza, Figura 1: Crescimento Microbiano = associado ao crescimento de uma população de células (uma célula dará origem a duas ao fim de um certo tempo, tempo de geração ou de duplicação.) tornando possível o desenvolvimento de métodos para o controle ou a otimização das atividades microbianas. Curva de crescimento Fatores ambientais Fatores necessários para o crescimento Fatores Físicos ( temperatura, ph, pressão osmótica) Fatores Químicos (nutrientes, água, O 2 etc.) Meio de Cultura Meio Complexo Meio Definido Figura 02: Curva de crescimento O crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada) apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento. Crescimento da cultura bacteriana Quantificação Direta (nº. de colônias viáveis ou não) Quantificação Indireta (turbidez, peso seco etc.) 5 1

FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO - FATORES FÍSICOS: temperatura ph pressão osmótica (concentração de sal) - FATORES QUÍMICOS: água fontes de carbono e nitrogênio minerais oxigênio fatores orgânicos FATORES FÍSICOS 1. TEMPERATURA: Importante fator ambiental que afeta o crescimento e a sobrevivência dos microrganismos Estes não são capazes de crescer em temperaturas muito frias ou muito quentes Entretanto os valores absolutos de temperaturas mínima e máxima variam de maneira ampla dentre os diferentes microrganismos, refletindo a variação térmica e a temperatura média de seus habitats A elevação da temperatura, até certos limites leva ao aumento do crescimento e das atividades metabólicas Acima dessa temperatura, as funções celulares caem rapidamente para zero. Cada organismo Temperatura mínima Temperatura ótima Temperatura máxima A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos Temperatura de crescimento mínima: < temperatura onde a espécie é capaz de crescer Temperatura de crescimento ótima: onde a espécie apresenta melhor crescimento Temperatura de crescimento máxima: > temperatura, onde ainda é possível o crescimento A Temperatura pode afetar os seres vivos de duas maneiras opostas. À medida que a temperatura aumenta, as reações químicas e enzimáticas passam a ocorrer com maior velocidade. Certas proteínas podem sofrer danos irreversíveis. Figura 3. Taxa de crescimento vs. temperatura 2

FATORES FÍSICOS 1. TEMPERATURA: Termófilos extremos Microrganismos são classificados em 3 grupos: Psicrófilos: crescem em baixas temperaturas (-10 a 15 C) Mesófilos: crescem em temperaturas moderadas (10 a 50 C) Termófilos: crescem em altas temperaturas (40 a 70 C) Termófilos extremos (68 a 110 C) Figura 5. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos Psicrófilos: temperatura ótima: 15 C não causam problemas na preservação de alimentos Foram inicialmente caracterizados como organismos capazes de crescer a 0 C Pode crescer a 0 C, mas sua T ótima de crescimento é de 15 C A maioria desses organismos é altamente sensível a altas T C Encontrados em profundezas dos oceanos e regiões polares Psicrotróficos: Capaz de crescer a 0 C Crescimento temperatura ótima: 20 a 30 C Não podem crescer em T acima de 40 C Crescem em temperatura de refrigeradores Encontrados em alimentos estragados Os microrganismos podem sobreviver próximas a temperatura de congelamento Permanecem dormentes Efeito da temperatura no crescimento microbiano Mesófilos: temperatura ótima: 25 a 40 C (mais encontrados) corpo de animais (temperatura da pele) bactérias patogênicas: temp. ótima 37 C degradam alimentos e são patogênicos Figura 6: Efeito da temperatura no crescimento microbiano 17 3

Termófilos: Capazes de crescer em altas temperaturas temperatura ótima de crescimento: 50 a 60 C ambiente de águas termais Endosporos formados por bactérias termofílicas são resistentes ao calor sobrevivendo ao tratamento por aquecimento nos alimentos enlatados A elevação da temperatura nos alimentos estocados pode permitir a germinação destes endosporos, degradando os alimentos Solo aquecido (***não crescem em temp. < 45 C) material estocado (altas temp.) Figura 7. Esquema de formação do endosporo Temperatura: Psicrófilos, Mesófilos e Termófilos Figura 8: Efeito da temperatura no crescimento microbiano Thermus aquaticus Min. 40 o C òtima:70-72 o C Máxima: 79 o C Park Nacional de Yellowstone Thermus aquaticus Figura 9: Exemplo de microrganismo termófilo 21 Figura 10: Exemplo de microrganismo termófilo 22 FATORES FÍSICOS 2. ph refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma solução; maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (ph 6,5 7,5); poucas bactérias são capazes de crescer em ph ácido (como ph 4,0) Figura 11. Distribuição de alguns microrganismos de acordo com o ph (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) 4

Bactérias: faixa entre ph 7,0 ph Exceções: Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5) Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (ph 10 11). Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (ph <5). Figura 12: Efeito do ph no crescimento microbiano 26 ph Mínimo, Ótimo e Máximo para o crescimento de alguns procariotos Organismo ph mínimo ph ótimo ph máximo Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-2.8 4.0-6.0 Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.0-3.0 5.0 Bacillus acidocaldarius 2.0 4.0 6.0 Zymomonas lindneri 3.5 5.5-6.0 7.5 Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8 Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3 Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0 Clostridium sporogenes 5.0-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0 Erwinia caratovora 5.6 7.1 9.3 Pseudomonas aeruginosa 5.6 6.6-7.0 8.0 Thiobacillus novellus 5.7 7.0 9.0 Streptococcus pneumoniae 6.5 7.8 8.3 Nitrobacter sp 6.6 7.6-8.6 10.0 FATORES FÍSICOS 3. PRESSÃO OSMÓTICA: Movimento da água através de uma membrana seletivamente permeável que produz uma pressão Os microrganismos retiram da água a maioria dos nutrientes solúveis (conteúdo celular 80 90 % de água) A água presente no interior da célula pode ser removida por elevações na Pressão osmótica Pressão osmótica: retira a H2O dentro da célula 27 OSMOSE: É o movimento líquido de moléculas de solvente através de uma membrana seletivamente permeável Que sai de uma área de ALTA concentração de moléculas de solvente (baixa concentração de Soluto) Condição Isotônica: Em um meio: a concentração geral de solutos se iguala com aquela encontrada dentro da célula A água sai e entra na célula na mesma velocidade (sem alteração líquida) O conteúdo celular está em equilíbrio com a solução fora da parede celular para uma área de baixa concentração de moléculas de solvente (alta concentração de Soluto) Nos sistemas vivos, o principal solvente é a água Figura 13: Célula em ambiente isotônico 5

Condição Hipotônica: Fora da célula é um meio cuja concentração de solutos é inferior ao interior da célula Condição Hipertônica: É um meio que possui uma concentração maior de solutos do que no interior da célula Perda de H2O do meio intracelular para o extracelular, através da membrana plasmática (meio com concentração de sais). Figura 14: Célula em ambiente hipotônico Figura 15: Célula em ambiente hipertônico Plasmólise: diminuição da membrana plasmática da célula devido a perda de H2O por osmose. Esse fenômeno é importante pois inibe o crescimento no momento em que a membrana plasmática se separa da parede celular Concentração de sais Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio. Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio. Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações. Área de Alimentos -adição de sais: plasmólise preservação de alimentos (peixe salgado, mel e leite) Alta concentração de sal ou açúcar Halofílicos Extremos (ou obrigatórios): necessitam de altas concentrações de sais para o crescimento Halofílicos Facultativos: mais abundantes não exigem altas concentrações de sais Figura 16. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal. -Adição de ágar: normalmente 1,5% para solidificar o meio > concentração = inibição de alguns microrganismo > concentração de sal = pressão osmótica 6

FATORES QUÍMICOS 1. ÁGUA: - Essencial para os microrganismos - Disponibilidade variável no ambiente Ambiente com < concentração de água: desenvolvem mecanismos para obter água através do aumento da concentração de solutos internos seja pelo bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese de solutos orgânicos (açúcares, álcoois ou aminoácidos). FATORES QUÍMICOS 2. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: a) CARBONO: essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos necessários para a viabilidade celular (elemento estrutural básico para os seres vivos) organismos quimio-heterotróficos: obtém C a partir de materiais orgânicos como proteínas, carboidratos e lipídeos. organismos quimio-autotróficos organismos fotoautotróficos C a partir de CO2 b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: - N, S: síntese de proteínas - N, P: síntese de DNA e RNA, ATP Peso seco de uma célula bacteriana: 14 % N, 4 % S, P NITROGÊNIO - utilizado para sintetizar os grupos aminos presentes nos aminoácidos. Obtenção de N: - Decomposição de materiais orgânicos (proteínas, aminoácidos) - Amônia (NH4 + ) - Nitrato (NO 3- ) Bactérias Fixadoras de Nitrogênio Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N gasoso diretamente da atmosfera. Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium) utilizam este processo para obtenção de N, tanto para elas como para as plantas que convivem simbioticamente (algumas leguminosas soja, feijão). Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a necessidade de implementação de fertilizantes químicos b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: ENXOFRE - utilizado na síntese de aminoácidos contendo S e de vitaminas (tiamina e biotina). Fontes naturais de S: íon sulfato (SO 4-2 ), sulfito de hidrogênio, aminoácidos FÓSFORO - essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os fosfolipídeos componentes da membrana celular. Fontes naturais de P: íon fosfato (PO 4-3 ), DNA, RNA, ATP c) POTÁSSIO, MAGNÉSIO E CÁLCIO: - também são elementos essenciais para os microrganismos - frequentemente encontrados como co-fatores para as reações enzimáticas. d) ELEMENTOS TRAÇOS: - FERRO, COBRE, MOLIBDÊNIO, ZINCO - utilizados como co-fatores essenciais para atividade de algumas enzimas utilizar água destilada para meio de cultura contém todos os elementos traços 7

Fatores Necessários FATORES QUÍMICOS Fontes de Energia - Orgânicos - Inorgânicos -Luz 3. OXIGÊNIO: Fontes de Carbono - Orgânicos (Heterotróficos): Açúcares, Proteínas - Inorgânicos (Autotróficos): CO 2 - extremamente importante no desenvolvimento microbiano - Orgânicos: NH + Fontes de N 4 - Inorgânicos: N 2 (fixadoras de nitrogênio), NO 2-, NO - 3 - HP0 2- Fontes de P e S 4 - SO 2-4 Fontes de outros Elementos - Na +, K +, Mg ++, Fe +++ - traços de Zn ++, Mn ++, Co ++, Mo +++, Se ++ Fatores de Crescimento - Vitaminas - Aminoácidos - Fatores presentes no SANGUE - Fatores presentes no SOLO - organismos classificados em: 1. AERÓBIOS - Estritos (obrigados): necessitam de O 2 - Facultativos: não necessitam de O 2 mas crescem melhor com O 2 - Microaerófilo: necessitam de O 2 mas em níveis menores 2. ANAERÓBIOS - Aerotolerantes: não necessitam de O 2 mas crescem melhor sem O 2 - Estritos (obrigados): não toleram O 2 (letal) 43 Efeito do oxigênio no crescimento microbiano Presença de Oxigênio 1 Aeróbios Obrigatórios Ex. Pseudomonas spp. Durante as reações de redução do O 2 são formados vários intermediários tóxicos. Ex: H 2 O 2, OH, O2 - Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas Meio gelatinoso com indicador redox: Rosa quando oxidado Incolor quando reduzido 2 3 Facultativos Ex. Escherichia coli Anaeróbios Obrigatórios Ex. Clostridium tetani Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante 1 2 Agar tioglicolato 3 Figura 17: Efeito do oxigênio no crescimento microbiano 45 Figura 18: Efeito do oxigênio no crescimento microbiano 46 Figura 19 Transporte de anaeróbios Figura 20:Sistema para cultivo de anaeróbios 47 48 8

Figura 21:Sistema para cultivo de anaeróbios 49 Figura 22:Sistema para cultivo de anaeróbios 50 MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: QUANTIFICAÇÃO DIRETA: - CONTAGEM EM PLACAS - FILTRAÇÃO - MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL - CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO (1) CONTAGEM EM PLACAS - técnica mais utilizada na determinação do tamanho da população bacteriana; QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: - TURBIDIMETRIA - ATIVIDADE METABÓLICA - PESO SECO VANTAGEM: qualificação de células viáveis DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias) Cálculo: nº de colônias na placa x índice de diluição da amostra = nº de bactérias/ml -DILUIÇÃO SERIADA -MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA Figuras 14 e 15: Cultura pura e visualização sob microscópio 53 Figura 23. Contagem em placas e diluição seriada 9

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO (2) FILTRAÇÃO - < nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração para a sua contagem. - concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos após a passagem de um volume de 100 ml de água. - filtro posteriormente transferido para uma placa de petri contendo meio sólido. Figura 24: Contagem de bactérias utilizando método de filtração MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) - utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio sólido. A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 ml) B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 ml) c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 ml) d) contagem do nº de tubos positivos e) estimativa do nº de células/ml de bactérias Figura 25: Contagem de bactérias utilizando método de filtração 10 ml de inóculo 6 tubos positivos (com crescimento bacteriano) 6 Tabela de combinações (NMP) 6-3-1 1 ml de inóculo 3 tubos positivos 3 Índice de NMP/100 ml = 110 Inferior = 40 Superior = 300 Confiabilidade de 95% 0,1 ml de inóculo 1 tubos positivos 1 Figura 26. Método do número mais provável (NMP) Figura 27. Método do número mais provável (NMP) 10

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO contagem direta QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO - um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina de microscópio. - a amostra pode ser corada ou analisada a fresco. - utilizam câmaras de contagem DESVANTAGENS: - não separa células mortas e vivas - pode haver erros de contagem - difícil contagem para bactérias móveis Figura 28. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser. MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO contagem direta MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: (1) TURBIDIMETRIA - monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez - espectrofotômetro (660 nm) Vantagens: método rápido e fácil (2) ATIVIDADE METABÓLICA Desvantagens Não distingue as células vivas das mortas Pode-se omitir células pequenas Células móveis precisam ser imobilizadas - quantidade de um certo produto (como ácido ou CO 2 ) é diretamente proporcional ao número de células bacterianas. 65 11

- Quero traçar uma Curva de Crescimento Bacteriano. - Como o crescimento da cultura bacteriana pode ser acompanhado? Acompanhando-se o aumento da turvação ao longo do cultivo A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. de bactérias. Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida Figura 29. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria. 68 MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO contagem indireta QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: (3) PESO SECO - principalmente para fungos filamentosos b) Contagem de células viáveis: Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas. a) fungo é removido do meio por filtração b) seco em dessecador c) posterior pesagem. 70 Contagem eletrônica 71 12