QUANTIFICAÇÃO AUTOMÁTICA DA RIGIDEZ DA BORDA DA GOTA DE SANGUE PERIFÉRICO EM IMAGENS DE MICROSCOPIA ÓTICA C. F. F. Costa Filho, M. G. F. Costa, F. Pinagé, J. M. Aguiar. Universidade do Amazonas Laboratório de Processamento Digital de Imagens Av. Gal. Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 3000 Aleixo, CEP 69077-000, Manaus-AM-Brasil cicero.costa@internext.com.br RESUMO Neste trabalho são apresentados os resultados preliminares de um método desenvolvido para quantificação automática do percentual de área ocupado por hemácias, em uma região próxima a borda de uma imagem de gota de sangue periférico, analisada através de microscopia ótica. A motivação para o trabalho parte de uma constatação experimental da Teoria Ortomolecular em Medicina Clínica, que associa a densidade da concentração de hemácias com a deficiência de vitamina C no organismo. O método desenvolvido utiliza processamento de cor nos espaços RGB e HSV para identificação das hemácias e dos espaços vazios na gota de sangue; utiliza o processo de rotulação para filtragem de ruídos e utiliza processamento morfológico para determinação de áreas de interesse. A inexistência de medidas anteriores para a determinação dessa densidade impossibilita uma análise quantitativa do método proposto. No entanto, na análise de quatro lâminas, obteve-se uma boa concordância entre os resultados obtidos com o método e a classificação qualitativa do especialista. hemácias em uma região próxima a borda de uma gota de sangue periférico e a deficiência de vitamina C no organismo. Nesse trabalho não será feita essa correlação. O interesse maior é apenas na determinação de um método automático para quantificar a concentração de hemácias em uma região próxima a borda da gota de sangue periférico. Doravante, uma borda de gota de sangue com alta concentração de hemácias será denominada de borda rígida, enquanto que uma borda de gota de sangue com baixa concentração de hemácias será denominada de borda maleável. Na figura 1 mostramos um exemplo de borda rígida, enquanto que na figura 1 mostramos um exemplo de borda maleável. Palavras-chave: processamento digital de imagens, microscopia ótica. 1. INTRODUÇÃO Resultados preliminares na Teoria Ortomolecular apontam para uma correlação positiva entre o percentual da área ocupada por hemácias em uma região próxima a borda de uma gota de sangue periférico analisada através de microscopia ótica, e a concentração de vitamina C no organismo [1]. Essa associação deve-se ao fato da vitamina C exercer um papel fundamental no processo antioxidante dos radicais livres presentes nas células. Quanto mais oxidados estiverem os radicais livres nas hemácias, mais agrupadas as mesmas se encontrarão no sangue. O processo de oxidação dos radicais livres no organismo pode gerar problemas circulatórios, sendo responsável, por exemplo, pelo acúmulo de placas gordurosas nas artérias. A motivação desse trabalho é fornecer uma ferramenta automática para que o nutrologista possa melhor quantificar a concentração de hemácias na análise microscópica da gota de sangue periférico e com isso realizar um diagnóstico de deficiência vitamínica do organismo. Após o desenvolvimento dessa ferramenta automática, pretende-se, em conjunto com o especialista participante desse trabalho, proceder a um trabalho prospectivo em larga escala, a fim de estabelecer dados experimentais confiáveis sobre a correlação acima mencionada entre a concentração de Fig. 1. borda rígida e borda maleável. 2. METODOLOGIA Inicialmente, para cada gota de sangue periférico, o especialista obtém um conjunto de quatro imagens, através de microscopia ótica, conforme mostrado na figura 3. Para esse trabalho foram utilizados quatro desses conjuntos. Todas as imagens foram capturadas por um scanner a partir de fotografias fornecidas pelo especialista. Na figura 3, a imagem da borda da gota de sangue é a que está situada no quadrante inferior direito. Apenas essa imagem é utilizada para a determinação da concentração de hemácias. Não necessariamente a imagem contendo a borda estará na posição referida acima. Sendo assim, o aplicativo desenvolvido permite ao especialista que selecione, dentre as quatro imagens, aquela que contém a borda da gota de sangue. O processamento computacional é efetuado em um microcomputador Pentium II 266 MHz, 64MB RAM e monitor de 17. Para o desenvolvimento do aplicativo de detecção da incisura utilizou-se o Toolbox de processamento digital de imagens do Matlab. Este trabalho contou com o apoio financeiro do CNPq e da Fundação de Apoio Institucional Rio Solimões UNISOL.
O método computacional implementado nesse trabalho pode ser classificado, em última instância, como um método de visão computacional, pois parte de uma imagem e obtém uma informação numérica, a concentração de hemácias. No entanto, o processamento digital de imagens, processamento que tem como entrada uma imagem e como saída outra imagem, é extensivamente utilizado nas etapas intermediárias. As etapas do método desenvolvido podem ser agrupadas em três categorias: Detecção da borda da gota de sangue. Delimitação de uma área próxima à borda da gota de sangue. Determinação da concentração das hemácias. Fig. 3. Conjunto de quatro imagens da gota de sangue. Detecção da borda da gota de sangue Após o usuário selecionar a imagem contendo a borda da gota de sangue a ser detectada, inicia-se o processamento automático para detecção da mesma. Os passos seguidos nessa etapa são os seguintes: binarização da imagem, remoção de ruídos, suavização da borda e detecção da borda. A binarização divide a imagem em duas regiões, uma correspondendo, aproximadamente, à região da gota de sangue e a outra correspondendo, aproximadamente, à região da lâmina sem sangue. Na figura 4 mostramos uma imagem antes de ser binarizada, enquanto na figura 4 mostramos a mesma imagem após a binarização. A fim de se estabelecer o critério para a binarização observou-se preliminarmente que a região da lâmina que não contém sangue é predominantemente de tonalidade azul, enquanto a região da gota de sangue contendo as hemácias caracterizase por uma forte presença da cor vermelha. Dessa forma, considerando que a imagem está armazenada no formato RGB, aplicou-se o seguinte critério para a binarização: Se a componente R de um pixel for maior do que a componente B, o mesmo assume o valor lógico 1 (um); Se a componente R de um pixel for menor do que a componente B, o mesmo assume o valor lógico 0 (zero). Conforme se pode observar na figura 4 a imagem resultante da binarização não contém exatamente duas regiões homogêneas, aparecendo muitos ruídos em ambas. A remoção desses ruídos foi efetuada através de dois processos de rotulação. O primeiro deles correspondeu à rotulação das regiões brancas e objetivou remover os ruídos brancos na grande região preta. Após as regiões brancas terem sido rotuladas, à exceção da maior delas, as outras assumiram o valor lógico zero. O resultado desse processo é mostrado na figura 5. O segundo deles correspondeu à rotulação das regiões pretas e objetivou remover os ruídos pretos da grande região branca. Após as regiões pretas terem sido rotuladas, à exceção da maior delas, as outras assumiram o valor lógico um. O resultado desse processo é mostrado na figura 5. A interface entre as duas regiões mostradas na figura 5 é muito irregular. Antes de se extrair a linha que define essa interface, a qual denominouse de borda da gota de sangue, realizou-se uma suavização da mesma, através da aplicação de uma operação de abertura morfológica: uma erosão morfológica seguida de uma dilatação morfológica [2]. Nesse processo foi utilizado um elemento estruturante de 2x2. O resultado da operação de suavização da imagem da figura 5 é mostrada na imagem da figura 6. Finalmente, a extração da borda foi efetuada realizando-se uma varredura vertical em todas as colunas da imagem da figura 6, no sentido de cima para baixo. Um ponto de borda é detectado nessa varredura no momento em que se verifica uma transição do valor lógico um para o valor lógico zero. As coordenadas de todos os pixels onde ocorreu uma transição desse tipo foram armazenadas em um vetor de pixels de borda. Na figura 6 mostra-se a borda detectada de acordo com esse procedimento. Em algumas imagens, como a borda resultante desse processo mostrou-se descontínua, foi necessário, além da varredura vertical, realizar-se também uma varredura horizontal. Na figura 7 mostra-se a borda detectada superposta a imagem original, onde se percebe uma coincidência entre a borda real e a borda detectada automaticamente. Fig. 4. imagem original com a borda e imagem após a binarização. Fig. 5. remoção dos ruídos na região preta através da rotulação das áreas brancas e remoção dos ruídos da região branca através da rotulação das áreas pretas.
Delimitação de uma área próxima à borda Após a determinação da borda da gota de sangue, através da utilização dos procedimentos descritos na seção Fig. 9. Superposição da área delimitada na figura 8 à imagem original. Determinação da concentração das hemácias Fig. 6. resultado da suavização da borda mostrada na figura 5 e borda detectada. Fig. 7. Borda detectada superposta a imagem original. anterior, realizou-se a delimitação de uma região vizinha à mesma através de duas operações de processamento digital de imagens: uma dilatação morfológica da imagem contendo a borda mostrada na figura 6, seguida de uma operação lógica AND entre a imagem resultante dessa dilatação e a imagem suavizada mostrada na figura 6. Na dilatação da imagem mostrada na figura 6 utilizou-se um elemento estruturante de 24x24. A imagem resultante desse processo é mostrada na figura 8. Em seguida efetuou-se a operação lógica AND entre a imagem mostrada na figura 8 e a imagem suavizada mostrada na figura 6. A imagem resultante dessa operação lógica é mostrada na figura 8. A região branca presente nessa imagem corresponde à região onde será realizada a quantificação das hemácias. A superposição dessa região na imagem original é mostrada na figura 9. A concentração das hemácias foi obtida determinandose o percentual da área delimitada na figura 9 ocupada pelas mesmas. Com esse objetivo, verificou-se, nas imagens originais mostradas na figura 1, que as regiões onde não se tem a presença de sangue a tonalidade é predominantemente azul. Com essa constatação, procurouse, dentro da gota de sangue, separar regiões com a tonalidade azul e sem a tonalidade azul. As primeiras correspondem a regiões sem hemácias e as segundas a regiões com hemácias. O procedimento estabelecido para quantificar os pixels com tonalidade predominantemente azul e os pixels sem essa característica foi converter a imagem de RGB para HSV e, no espaço de cores HSV, determinar todos os pixels cujo ângulo de cor estiver dentro da faixa correspondente ao ângulo da cor azul ± 30. A esses pixels damos o nome de pixels de fundo. Os pixels correspondentes a hemácias foram determinados subtraindo-se o total de pixels de fundo da contagem de todos os pixels da região delimitada na figura 9. A concentração de hemácias foi então determinada dividindose o número de pixels correspondentes a hemácias pelo número total de pixels da região delimitada na figura 9. Quanto maior a concentração de hemácias assim definida maior será a rigidez da borda da gota de sangue. Na figura 10 é mostrada a mesma imagem da figura 9 vista de outro ângulo, ressaltando os pixels de fundo e os pixels correspondentes a hemácias e o percentual da concentração de hemácias obtido pelo aplicativo. Fig. 10. Imagem da figura 9 vista de outro ângulo, com a região de fundo e a região de hemácias ressaltadas e valores de saída do aplicativo para a concentração de hemácias. Fig. 8. imagem resultante da dilatação da imagem 6 por um elemento estruturante de 24x24 e imagem resultante da operação lógica AND entre a imagem da figura 6 e a imagem da figura 8. 3. RESULTADOS Com o objetivo de testar o algoritmo desenvolvido foram utilizadas 4 imagens com diferentes graus de rigidez da borda da gota de sangue. Essas quatro imagens são mostradas na figura 11. A ordem de aparecimento das mesmas (da letra a a letra d ) corresponde a um grau de rigidez crescente, estabelecido pelo especialista. Na tabela 1
mostra-se a concentração de hemácias determinada pelo aplicativo para essas imagens, conforme procedimento estabelecido na seção anterior. Ao comparar-se a ordem estabelecida pelo especialista do grau de rigidez da borda das imagens mostradas na figura 11 e os dados da tabela 1, observa-se a existência de uma correlação positiva entre os mesmos. das imagens (scanner) sobre as cores resultantes na imagem digital e a influência do tamanho da região angular (30 ) utilizada para determinar os pixels de fundo na região estabelecida para o cálculo da concentração de hemácias. Pretende-se consolidar os pontos ora expostos, antes de utilizar o método em um trabalho prospectivo que estabeleça a correlação entre a rigidez da borda da gota de sangue e a deficiência de vitamina C no organismo. REFERÊNCIAS [1] OLIVEIRA, J. M., "A Teoria Ortomolecular em Medicina Clínica", Nova Letra, 1998. [2] GONZALEZ, R. C. E WOODS, R. E., Digital Image Processing, Addison Wesley, 1993. (c) (d) Fig. 11. Imagens de bordas de gotas de sangue periféricos mostradas da esquerda para direita e de cima para baixo com graus de rigidez crescentes da letra para a letra (d). Tabela 1. Concentração de hemácias calculada pelo aplicativo para as imagens da figura 11. Imagem Figura 11 Figura 11 Figura 11 (c) Figura 11 (d) Concentração calculada (%) 67,50 73,95 98,44 98,65 4. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Embora tenha havido uma correlação entre os resultados obtidos pelo aplicativo e a classificação qualitativa do especialista, o número de amostras testadas foi muito pequeno, exigindo que seja feita uma avaliação mais aprofundada com um maior número de amostras e com o estabelecimento de uma escala qualitativa de classificação a ser utilizada pelo especialista. Salienta-se, no entanto, a importância dos resultados obtidos, que demonstraram a possibilidade de realizar a quantificação da concentração de hemácias na borda da gota de sangue periférico, analisada através de microscopia ótica, por métodos automáticos de processamento digital de imagens. Para o estabelecimento de um método definitivo é necessário que se investigue ainda alguns pontos do método proposto, como: a influência do tamanho da região onde é feita a quantificação da concentração de hemácias sobre os valores dessa concentração; a influência do método de digitalização
AUTOMATIC QUANTIFICATION OF THE PERCENTAGE OF AREA OCCUPIED BY RED BLOOD CELLS IN A REGION NEAR THE BORDER OF A MICROSCOPY IMAGE OF PERIPHERAL BLOOD DROP ABSTRACT This work shows the preliminary results of a method meant to automatically measure the percentage of area occupied by red blood cells in a region near the border of a microscopy image of peripheral blood drop. This work was motivated by an experimental finding of Ortomolecular Theory in Clinical Medicine, which relates density of concentration of red blood cells to C vitamin deficiency. The method uses colour processing in RGB space and in HSV space for the identification of red blood cells and of blank spaces in the blood drop. For the filtering of noises and definition of areas of interest, the method uses the labeling process and the morphological process. The absence of previous measures to determine the density of red blood cells precludes any quantitative analysis of the proposed method. However, the analysis of four plates showed the results of the method to be fairly consistent with the qualitative classification made by the physician. Key-words: microscopy image, peripheral blood drop, vitamin C, ortomolecular theory