AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIMICROBIANO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Thymus vulgaris ASSSOCIADO A EXTRATO DE Zingiber officinale EM FORMULAÇÕES DE USO TÓPICO Daniella Souza Fiore Faculdade de Ciências Farmacêuticas Centro de Ciências da Vida daniella.sf@puccamp.edu.br Resumo: Este estudo foi enfocado em duas plantas, Zingiber officinale (gengibre) e Thymus vulgaris (tomilho), que devido à sua composição podem ter aplicações cosméticas, fitoterápicas e também alimentícias. Ambas são utilizadas como condimento e como medicamentos, devido às suas ações antioxidante e antimicrobiana. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a atividade antimicrobiana de óleo essencial de Thymus vulgaris em associação com o extrato glicólico de rizomas de gengibre, pensando-se no emprego desta associação em preparações de uso tópico com finalidades preventivas e de tratamento de diversas condições onde se tenha um crescimento microbiano pronunciado, podendo-se citar uma desordem de baixa gravidade como a acne, e até mesmo, problemas mais graves, como as feridas infectadas. Assim, o óleo essencial de tomilho foi obtido através do método de destilação por arraste de vapor de água, sendo este mantido em temperatura de congelamento até o momento do uso. O extrato glicólico de gengibre foi obtido através de turboextração com propilenoglicol. A ação antimicrobiana de ambos os insumos, em associação ou não, foi avaliada por método de microdiluição, como previsto pelo CLSI M27- A2, 2010 [1], visando à avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), além de subculturas, para avaliação da Concentração Bactericida Mínima (CBM). Concluiu-se que o óleo essencial de tomilho inibiu o crescimento microbiano de três das quatro cepas bacterianas avaliadas e o extrato glicólico de gengibre isoladamente inibiu o crescimento de todas as cepas bacterianas avaliadas. Quando em associação, ocorreu a inibição de todas as cepas bacterianas avaliadas, de forma a indicar que são promissores para o uso proposto. Palavras-chave: Zingiber officinale, Thymus vulgaris, antimicrobiano. Área do Conhecimento: Saúde Farmácia - CNPq. Gisele Mara Silva Gonçalves Obtenção e aplicação de insumos de origem vegetal e animal em alimentos, fitoterápicos e cosméticos. Centro de Ciências da Vida gmsg@puc-campinas.edu.br 1. INTRODUÇÃO O Thymus vulgaris, conhecido popularmente como tomilho, é um vegetal muito interessante sob o ponto de vista cosmético e também fitoterápico, sendo muito utilizado como medicamento caseiro e na culinária como condimento. Os óleos essenciais, derivados de plantas utilizadas como condimentos, representam um grupo de antimicrobianos naturais tradicionalmente utilizados em alimentos para acentuar gosto ou aroma destes [2]. Esse vegetal também é muito conhecido pela diversidade de sua composição, tal como: p-cimeno, α- pinemo, nopinemo, canfeno, limoneno, careno, γ- terpinemo, linalol, α-terpineol e seus acetatos, borneol, geraniol, 3-hexeno-1-ol, terpineol-4, um outro álcool, citral, carvacrol, timol, cariofileno e outros hidrocarbonetos e alcoóis sesquiterpenos, que conferem diversas ações, como antifúngicas. O processo de extração do óleo essencial requer grandes quantidades de material vegetal, tendo em vista que o óleo representa cerca de 0,05 a 10% da planta [3]. LÓPEZ e colaboradores (2007) [4] estudaram a ação do óleo essencial de tomilho sobre o crescimento microbiano de várias cepas bacterianas, como Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, e concluíram que esta ação ocorreu devido provavelmente à ação dos terpenóides presentes neste óleo essencial. Outro vegetal também muito interessante sob o ponto de vista cosmético e fitoterápico é o Zingiber officinale, conhecido também como gengibre, que é utilizado como planta medicinal há muito tempo, conferindo propriedades diversas, como: bactericida, antifúngica, antiviral, antiulcerativa, antitumoral, antioxidante, dentre outras. A parte da planta mais conhecida é o rizoma, o qual é rico em carboidratos, lipídeos e dentre eles ácidos graxos livres, como ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico, e óleos como o gingerol, zingerona e óleos voláteis, como o zingibereno, felandreno, canfeno, dentre outros, sendo que o gingerol, por exemplo, tem sido muito estudado para fins medicinais. Em um estudo realizado por JAIN e
colaboradores (2008) [5], que propôs a avaliação de algumas plantas medicinais, segundo suas atividades antioxidantes, o gengibre foi considerado um antioxidante de ação moderada. Além de ser utilizado para finalidades medicinais, o gengibre também é muito empregado na culinária, devido ao seu sabor ardente e intenso característicos, próprios dos temperos picantes. Portanto, o estudo dessas duas plantas torna-se promissor, uma vez que ambas, mais especificamente o óleo essencial de tomilho e as enzimas proteolíticas presentes nos rizomas de gengibre, possuem ação antimicrobiana em relação à várias cepas de bactérias. simples. 2. OBJETIVOS O objetivo desta pesquisa foi avaliar a atividade antimicrobiana de óleo essencial de Thymus vulgaris em associação com o extrato glicólico de rizomas de gengibre, e se haveria efeito sinérgico na inibição do crescimento microbiano, a fim de empregar tal associação em preparações de uso tópico, para o tratamento de diversas condições onde se tenha crescimento microbiano pronunciado, como desordens de baixa gravidade, como a acne, e até mesmo, problemas mais graves, como as feridas infectadas. 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Amostras Planta fresca de Thymus vulgaris; rizomas frescos de Zingiber officinale. 3.2 Extração do oleo essencial de Thymus vulgaris Em uma etapa preliminar deste estudo, utilizou-se óleo essencial de tomilho obtido comercialmente. Depois, passou-se a obter o óleo essencial experimentalmente, a partir de planta fresca de Thymus vulgaris. O material vegetal foi lavado em água corrente e triturado em mixer. A extração do óleo essencial foi realizada pelo método de hidrodestilação em aparelho de Clevenger, por um período de duas horas a partir da ebulição [6]. Após a obtenção do hidrolato, foi realizada uma partição liquido-líquido com três porções de 50ml de clorofórmio. A fração orgânica obtida (óleo essencial e clorofórmio) foi tratada com 2g de sulfato anidro de sódio para a remoção da água remanescente, e logo em seguida, filtrada em filtro de naylon, diretamente em um funil de fundo redondo de 500ml, para a retenção do sulfato de sódio anidro. Em seguida, o balão de fundo redondo, contendo a fração orgânica, foi levada ao evaporador rotatório, à temperatura de 50ºC e à 40rpm, para a evaporação do solvente (clorofórmio) e obtenção do óleo essencial de tomilho. 3.3 Avaliação da ação antimicrobiana do óleo essencial de Thymus vulgaris A avaliação da ação antimicrobiana do óleo essencial de tomilho obtido foi realizada pelo método de microdiluição, como previsto pelo CLSI (NCCLS) M27-A2, 2010 [1], visando a avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). As cepas de bactérias avaliadas foram: S.aureus, Spidermidis, P.aeruginosa e E.coli. Segundo Pires & Gonçalves [7], a diluição eficaz para estas cepas de bactérias é 4,5% (v/v). Portanto, com base nestes autores, foram avaliadas as seguintes diluições de oleo essencial: 4; 4,1; 4,2; 4,3; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; e 4,8% (v/v). As placas de microdiluição foram incubadas a 35ºC, sendo realizadas leituras visuais após um período de 24 horas, utilizando-se o reativo Cloreto de Trifeniltetrazólio. E, quando necessário, foi realizada a subcultura para confirmar a atividade bactericida ou bacteriostática. 3.4 Obtenção do Extrato Glicólico de Zingiber offcinale O material vegetal (rizomas de Zingiber officinale) foi higienizado com etanol 70% e descascado. Em seguida, foi submetido à uma turboextração com propilenoglicol, em equipamento do tipo centrífuga para a obtenção do sumo. O sumo obtido foi diluído para diversas concentrações: 20%, 30%, 40% e 50% em propilenoglicol, sendo estes em seguida agitados e filtrados em filtro de nylon. As diluições foram armazenadas em frascos âmbar e envoltos em papel alumínio, tendo sido mantidos em temperatura de congelamento até o momento do uso, quando então foram descongeladas e centrifugadas a 3000rpm durante 5 minutos, com o intuito de eliminar possíveis resquícios de material insolúvel [Método adaptado a partir de AZU e ONYEAGBA (2007)] [8]. 3.5 Avaliação da ação antimicrobiana do extrato glicólico de Zingiber officinale A avaliação da ação antimicrobiana do extrato glicólico de Zingiber officinale obtido foi realizada, assim como para o óleo essencial de Thymus vulgaris, pelo método de microdiluição, como previsto pelo CLSI (NCCLS) M27-A2, 2010 [1], visando a avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). As cepas utilizadas foram as mesmas, ou seja, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
e Pseudomonas aeruginosa. A leitura visual das placas de microdiluição foram realizadas através do reativo Cloreto de Trifeil Tetrazólio, assim como para o oleo essencial de tomilho, após estas terem sido incubadas por um período de 24 horas, à 35ºC. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO A ebulição ocorreu em, aproximadamente, 30 minutos e o processo de hidrodestilação, em 3 horas, sendo que pelo processo de hidrodestilação foram obtidos 20mL de hidrolato (água destilada e óleo essencial de tomilho). Considerando os resultados inicialmente obtidos, pelo método da microdiluição, para o óleo essencial de tomilho adquirido comercialmente e o óleo essencial obtido experimentalmente, pode-se observar que estes divergiram entre si (Tabela 1), pois, somente a cepa de Staphylococcus aureus teve seu crescimento inibido. Como os resultados obtidos foram diferentes entre as cepas, nas demais etapas desta pesquisa utilizouse somente o óleo essencial de tomilho obtido experimentalmente, tendo sido realizada outra microdiluição somente com óleo essencial obtido experimentalmente. Segundo Pires & Gonçalves [7], para essas cepas bacterianas a concentração efetiva para inibição do crescimento microbiano foi de 4,5%. Assim, otimizou-se o estudo na segunda microdiluição realizada, avaliando-se o óleo nas concentrações de 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; e 4,8%. Foram também realizadas as subculturas dos microorganismos para confirmação dos resultados (Tabela 2). Neste caso, os resultados foram diferentes da primeira microdiluição realizada, pois o óleo essencial obtido também inibiu o crescimento de S. epidermidis e E. coli, na concentração de 4,6% para atividade bacterioestática e 4,7% e 4,6%, respectivamente, para atividade bactericida. Logo, observa-se que o óleo essencial de tomilho obtido experimentalmente apresentou resultados mais satisfatórios, tendo inibido o crescimento microbiano de todas as cepas de bactérias, com exceção da Pseudomonas aeruginosa. Assim, pode-se dizer que o óleo essencial de tomilho apresentou efeito antimicrobiano para as cepas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Escherichia coli. O extrato de gengibre apresentou resultados semelhantes, ou seja, inibiu o crescimento microbiano (Tabela 3). Inicialmente previu-se a utilização do extrato aquoso de rizomas de gengibre, porém, paralelamente ao presente trabalho foi conduzido um segundo trabalho e foram realizados estudos preliminaries (difusão em disco), no qual percebeu-se que o extrato obtido em propilenoglicol manteve-se mais estável. Por esta razão, passou-se a utilizar somente o extrato glicólico na presente pesquisa. Logo, o extrato glicólico de gengibre apresentou efeito antimicrobiano para todas as cepas, enquanto que o extrato aquoso não inibiu o crescimento microbiano de nenhuma dessas cepas. A avaliação da ação antimicrobiana da associação de óleo essencial de tomilho, obtido experimentalmente, e de extrato glicólico de gengibre foi realizada pelo método da microdiluição, sendo as microdiluições das cepas realizadas simultaneamente e os resultados obtidos, os mesmos (Tabela 4). Por este motivo, os resultados obtidos de todas as microdiluições foram apresentados em uma única tabela, representativa para todas as cepas. Logo, observou-se que para todas as cepas, em todas as concentrações avaliadas, a associação promoveu inibição do crescimento microbiano. Assim, não se pode afirmar que houve sinergismo entre o óleo essencial de tomilho e o extrato glicólico de gengibre, uma vez que ambos isoladamente, nas concentrações avaliadas, promoveram a inibição do crescimento microbiano. Para que seja possível afirmar que ocorreria um sinergismo, seria necessário realizar novas avaliações, reduzindo-se as concentrações de ambos, para verificar se a inibição do crescimento microbiano continuaria ocorrendo. Tabela 1. Resultados da avaliação da ação antimicrobiana do óleo essencial de tomilho, pelo método da microdiluição. % óleo essencial S.aureus* S.epidermidis** P.aeruginosa** E.coli** 4,0 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 4,1 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 4,2 (-) (-) (+) (-) (+) (+) (+) (+) 4,3 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 4,4 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 4,5 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 4,6 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 4,7 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 4,8 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) * óleo obtido experimentalmente;** óleo obtido comercialmente;(+) presença de crescimento microbiano; (-) ausência de crescimento microbiano.
Tabela 2. Avaliação da ação antimicrobiana do óleo essencial de tomilho, pelo método da microdiluição. % óleo essencial S. aureus S. epidermidis P. aeruginosa E.coli 4,4 (-)(-) (+)(+) (+)(+) (+)(+) 4,5 (-)(-) (+)(+) (+)(+) (+)(+) 4,6 (-)(-) (-)(-) (+)(+) (-)(-) 4,7 (-)(-) (-)(-) (+)(+) (-)(-) 4,8 (-)(-) (-)(-) (+)(+) (-)(-) (M) microdiluições; (S) subculturas.(+) presença de crescimento microbiano;(-) ausência de crescimento microbiano. Tabela 3. Avaliação da ação antimicrobiana do extrato glicólico de gengibre, pelo método da microdiluição. % extrato S.aureus S.epidermidis P.aeruginosa E.coli 20 (-) (-) (-) (-) 30 (-) (-) (-) (-) 40 (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) (-) (+) presença de crescimento microbiano;(-) ausência de crescimento microbiano. O extrato glicólico de Zingiber officinale demonstrou melhor atividade contra maior número de microorganismos ensaiados (todas as cepas avaliadas), enquanto que o óleo essencial de Thymus vulgaris não inibiu o crescimento de uma das cepas (Pseudomonas aeruginosa). Esta maior atividade do extrato glicólico de gengibre pode estar associada à grande variedade de constituintes (cerca de 63 substâncias) presentes no gengibre, dentre eles: zingibereno, geranial, sesquifelandreno, farneseno, cineol, geraniol e curcumeno, que tem sido utilizados farmacologicamente com sucesso nos tratamentos de certas doenças, incluindo inflamações crônicas [9]. 5. CONCLUSÕES Nas condições experimentais da presente pesquisa foi possível concluir que o extrato glicólico de gengibre apresentou efeito antimicrobiano para todas as cepas bacterianas avaliadas, enquanto que o óleo essencial de tomilho apenas não foi eficaz contra a Pseudomonas aeruginosa. Não foi possível atestar a ocorrência de sinergismo entre essas duas plantas medicinais, o que não exclui esta possibilidade, pois são necessários outros estudos com diluições diferentes de ambos os insumos avaliados. Finalizando, perante os resultados obtidos, é possível afirmar que tanto o óleo essencial de tomilho quanto o extrato glicólico de rizomas de gengibre são promissores para aplicação com finalidade antimicrobiana. AGRADECIMENTOS À Pontifícia Universidade Católica de Campinas pela bolsa de Iniciação Científica FAPIC/Reitoria. Tabela 4. Resultados da microdiluição de óleo essencial de tomilho, obtido experimentalmente, associado com extrato glicólico de gengibre, que foram os mesmos para as cepas: S.aureus, S.epidermidis, P.aeruginosa e E.coli. % extrato Concentração do óleo essencial de tomilho (%) 4,4 4,5 4,6 4,7 20 (-) (-) (-) (-) 30 (-) (-) (-) (-) 40 (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) (-) REFERÊNCIAS [1] NCCLS (2003), Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Approved Standard, NCCLS document M7-A6, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA. [2] Pozzo, et al. (2011), Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de condimentos frente a Staphylococcus spp isolados de mastite caprina, Ciência Rural, Santa Maria, v.41, n.4, p.667-672, abr, 2011. [3] Beltrame, J.M, et al. (2010), Estudo de obtenção de óleos essenciais e fatores de influência em sua composição, Anais do II ENDICT Encontro de Divulgação Científica e Tecnológica. Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR. [4] López e colaboradores (2007), Analysis of essential oils from chemotypes of Thymus vulgaris in Catalonia, Journal of the Science of Food and Agriculture, v.87, p.2327-2333, September 2007. [5] Jain e colaboradores (2008), Antibacterial activity of [10]-gingerol and [12]-gingerol isolated from ginger rhizome against periodontal bactéria, Phy-
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