A Célula como Unidade de Vida Microscopia e Estudo da Célula

A Célula como Unidade de Vida Microscopia e Estudo da Célula Até ao início do séc. XVII o conhecimento dos seres vivos limitava-se, fundamentalmente, a organismos macroscópicos. A descoberta da célula só foi possível quando o avanço técnico permitiu o aperfeiçoamento das lentes e a construção do microscópio óptico composto (MOC). Numerosos investigadores interessaram-se, pelo estudo de diversos materiais vivos; os pequenos avanços de uns constituíam, para outros, pontos de partida para estudos mais alargados. Simultaneamente, as técnicas de observação foram sendo melhoradas o que, por sua vez, tornou possíveis observações mais minuciosas e rigorosas. Foi longo o caminho que conduziu a uma das mais importantes generalizações da Biologia a Teoria Celular. TEORIA CELULAR Princípio Unificador da Biologia A célula é a unidade básica de estrutura e função de todos os seres vivos. Todos os seres vivos, dos mais simples aos mais complexos, são constituídos por células, nas quais ocorre um conjunto de reacções químicas necessárias à manutenção da vida. Todas as células provêm de células preexistentes, pois qualquer célula se forma por divisão de uma outra. A célula é a unidade de reprodução e desenvolvimento dos seres vivos; numerosos seres vivos formam-se por divisões sucessivas a partir de uma única célula ovo. A célula é a unidade hereditária de todos os seres vivos. É na célula que está contida a informação genética que é transmitida de geração em geração, durante os processos de divisão celular, permitindo a continuidade das espécies. 1

Microscópio Óptico Constituição e Funcionamento O microscópio óptico é um instrumento indispensável aos trabalhos laboratoriais que envolvam o estudo da célula. Ao fornecer imagens ampliadas de grande precisão, torna possível a observação de estruturas invisíveis à vista desarmada. Para uma rentabilização das suas potencialidades torna-se absolutamente essencial conhecer a sua constituição e funcionamento. Parte Óptica Parte Mecânica Sistema de oculares Sistema de objectivas Sistema de iluminação Pé Coluna Tubo ou canhão Platina ou mesa do microscópio Parafusos Revólver Espelho duplo Condensador Diafragma Macrométrico ou Cremalheira Micrométrico Conjunto de lentes que permitem a ampliação do objecto. A ampliação dada pelo microscópio é igual ao produto da ampliação da objectiva pela ampliação da ocular. Ex.: Ampliação da ocular: 10 x Ampliação da objectiva: 15 x Ampliação do microscópio: 10 x 15 = 150 x A objectiva aumenta a imagem do objecto A ocular aumenta a imagem que recebe da objectiva. O espelho é duplo, pois tem uma face plana (para a luz natural) e uma face côncava (para a luz artificial). Destina-se a reflectir para a platina a luz que recebe da fonte luminosa. Distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz reflectida pelo espelho. Regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio. Suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade. Nos microscópios actuais é frequentemente articulada na zona junto à platina, o que permite inclinar o microscópio, tornando as observações mais cómodos. Cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com os objectivas. Placa onde se colocam as preparações a observar. Tem no centro uma abertura circular, a janela, por onde passam os raios luminosos que vão iluminar a preparação (depois de atravessarem o sistema de iluminação). Engrenagem que suporta o tubo e que permite a sua deslocação ou a da platina. É indispensável para fazer a focagem. Imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscópio. Disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta 2 a 4 objectivas de diferentes ampliações; por rotação, é possível trocar rápida e comodamente de objectiva 2

Microscópio óptico Composto (M.O.C.) Seguidamente apresenta-se a constituição de um M.O.C.: 1- Condensador 2- Revólver 3- Braço ou coluna 4- Objectivas 5- Pinças 6- Platina 7- Parafuso macrométrico 8- Diafragma 9- Parafuso micrométrico 10- Ocular 11- Espelho 12- Base ou pé 13- Tubo óptico do canhão ILUMINAÇÃO E FOCAGEM 1- Iluminar o campo do Microscópio óptico - captar uma quantidade de luz adequada para a observação do Material. a) Fonte luminosa incorporada - Ligá-la; - Regular a abertura do diafragma e a posição do Condensador b) espelho - Orientá-lo em busca de melhor captação de luz; usando a face plana para a luz natural e a face côncava para a luz artificial - Regular a abertura do diafragma e a posição do condensador. 3

2- Focar regular a distância entre as lentes e o objecto por forma a obter uma imagem o mais nítida possível. CARACTERÍSTICAS DA IMAGEM EM M.O. A imagem que se obtém no M.O. Composto é: o maior que o objecto (ampliada); o virtual; o invertida e simétrica. O microscópio óptico composto garante imagens adequadas quando as necessidades de ampliação não ultrapassam as 1500 a 2000 vezes. PODER DE RESOLUÇÃO E LIMITE DE RESOLUÇÃO Poder de resolução é a capacidade que o microscópio apresenta de fornecer imagens nítidas e minuciosas. Limite de resolução mínima distância entre dois pontos a partir da qual eles passam a ser confundidos como um único ponto. O Limite de resolução depende do comprimento de onda da luz utilizada. DIMENSÕES EM M.O. Uma das primeiras preocupações de quem estuda a célula é estabelecer uma relação de grandeza das estruturas celulares com as unidades de medida mais usuais, o milímetro e o metro: Metro (m) - 1 Milímetro (mm) 10-3 m Micrómetro (µm) 10-6 m Nanómetro (nm) 10-9 m Angstrom (Å) 10-10 m Picómetro (pm) 10-12 m 4

OUTROS TIPOS DE MICROSCÓPIOS ÓPTICOS Microscópio óptico de fluorescência Muito usado em Citologia. Permite a observação de estruturas celulares marcadas com substâncias químicas que fluorescem ou emitem luz visível ao serem iluminadas pela luz ultravioleta. Microscópio de contraste de fase tem a vantagem de permitir o exame de células vivas, não coradas. Microscópio de fundo escuro é normalmente utilizado na observação de estruturas de dimensões muito pequenas e transparentes. Microscópio confocal é um microscópio bastante recente. O nome «confocal» significa «ter o mesmo foco», o que, neste caso, corresponde a ter duas lentes alinhadas cujos focos se situam num único ponto do espaço. Assim, há formação de um cone de luz que faz um seccionamento óptico; isto tem a vantagem de permitir observar organismos vivos, sem ser necessário fazer cortes. Preparações Preparações temporárias ou extemporâneas são realizadas quando o objecto se destina a ser observado no momento e depois é desaproveitado. Meios de Montagem utilizados: - Água doce; - Água destilada; - Água salgada; - Soro fisiológico artificial ou soluto de Ringer ou plasma sanguíneo. Estes meios de montagem não alteram as condições do material a observar Líquidos indiferentes. Preparações Definitivas Realizam-se quando o objecto se destina a ser guardado para posteriormente poder voltar a ser observado. 5

TÉCNICAS PARA OBSERVAÇÃO DE CÉLULAS AO MICROSCÓPIO ÓPTICO A microscopia inclui vários tipos de instrumentos e técnicas. De acordo com a constituição e funcionamento do microscópio óptico, o material biológico, para ser observado, tem de ser sujeito a uma série de manipulações físicas e químicas. No microscópio óptico a luz é transmitida através do objecto, de modo que o material tem de ser atravessado pela luz, a fim de se produzir a imagem. Este aspecto impõe que, na observação de tecidos animais ou vegetais em que as células estão justapostas, seja necessário fazer finos cortes de modo a que se apresentem translúcidos. Com esse objectivo, utilizam-se normalmente as seguintes técnicas: 1- Técnica do esfregaço; 2- Técnica do esmagamento; 3- Técnica de cortes finos. TÉCNICA DO ESFREGAÇO 6

Técnica utilizada com frequência em bacteriologia. Esta técnica permite a separação de células em meio líquido. Consiste em espalhar um fragmento de tecido ou uma colónia sobre uma lâmina de vidro, o que provoca a dissociação de alguns elementos celulares e a sua aderência ao vidro. Desta maneira forma-se uma camada fina de células, facilitando a observação. Método usado para: - Observação de sangue e outros líquidos orgânicos. (Coloca-se uma gota do líquido sobre uma lâmina e com outra lâmina ou lamela, espalha-se bem (esfregaço). - Após estar seco, o material, pode ser fixado e corado. TÉCNICA DO ESMAGAMENTO Técnica utilizada nos casos em que existe uma aderência fraca entre as células do tecido a observar. Para visualizar as células, basta colocar um pequeno fragmento do tecido entre a lâmina e a lamela e fazer uma pequena pressão com o polegar. Provoca-se, desta forma, um esmagamento do tecido, o que faz com que as células se espalhem, formando uma fina camada, que é facilmente atravessada pela luz. 7

TÉCNICA DOS CORTES FINOS Esta técnica é mais complexa e frequentemente utilizada em Histologia. Quando o material a ser estudado apresenta uma consistência mole, é necessário proceder à sua inclusão prévia, embebendo-o, por exemplo, em parafina líquida que, após solidificar, garante uma consistência adequada ao corte. Este corte poderá ser feito com um micrótomo que permite obter fatias muito finas, com cerca de 3 a 6 µm de espessura. O material é banhado por um solvente e mergulhado em parafina derretida pelo calor. A parafina penetra nas células e endurece; forma-se um bloco de parafina que envolve o tecido a observar. Com a ajuda do micrótomo, este bloco é seccionado em fatias finas (espessura 5 µm ). O corte é então colocado sobre uma lâmina de vidro e a parafina é dissolvida por um solvente (xilol), ficando o fino corte de células sobre a lâmina. O material é, em seguida, 8

corado e desidratado, procedendo-se à sua montagem, para a qual se utiliza o bálsamo do Canadá (meio de montagem), que, ao solidificar, faz aderir a lamela à lâmina. Outra forma de dar consistência necessária ao material biológico para possibilitar o corte é empregando a congelação; ou seja, congelando o material antes de o cortar. No caso dos tecidos vegetais, que já apresentam uma certa rigidez, é possível fazer cortes sem inclusão, ou então com uma simples inclusão entre dois pedaços de medula de sabugueiro. Quando não é necessário obter cortes extremamente finos, podemos efectuá-los com: - Uma lâmina bem afiada (ex. plo : lâmina de barbear) - Um bisturi Coloração e Fixação Todas as técnicas citológicas implicam frequentemente a coloração de material biológico; a maioria das estruturas celulares só são observáveis ao microscópio óptico composto se a célula for previamente tratada por corantes. Cada corante reage apenas com certos elementos celulares, que ficam contrastados em relação aos outros, o que facilita a observação. Para observarmos células vivas deve-se ter o cuidado de usar corantes que não alterem nem destruam o material biológico. Tais corantes os corantes vitais como é o caso do azul de metileno, do vermelho neutro e da eosina, são utilizados normalmente nas preparações extemporâneas ou preparações temporárias preparações feitas para exames de ocasião. Quando se pretende fazer um grande número de observações ou exames demorados são geralmente utilizadas preparações definitivas. Neste caso, além da coloração, há necessidade de preservar, da maneira mais perfeita possível, a estrutura original das células. Tal efeito consegue-se com a utilização de fixadores substâncias químicas como o formol, o éter, o ácido acético e o álcool que matam rapidamente a célula, mantendo as suas estruturas com a menor alteração possível, sendo assim conservado o material biológico para futuras observações. 9

Os agentes susceptíveis de exercerem acção fixadora também podem ser de natureza física; como o frio e o calor. Consoante a estrutura celular que se pretende observar, deve-se ter o cuidado de escolher o fixador mais adequado, pois estes actuam de diferente forma. Corantes Específicos CORANTES ESTRUTURAS Orceína acética Cromossoma Água iodada Núcleo, grãos de amido Eosina Citoplasma Soluto de lugol Parede celulósica, grãos de amido Vermelho neutro Vacúolos Azul de metileno Núcleo Montagem Consiste na colocação do material num meio, entre a lâmina e a lamela, que o isola do exterior, protegendo-o da acção de fungos e bactérias. Usam-se por exemplo a gelatina glicerada e o bálsamo do canadá. A montagem poderá ser completada com a colocação de um verniz ou lacre que recobre as extremidades da lamela utilizada, reforçando o isolamento do exterior. Microscópio Electrónico de Transmissão (MET) Considerações gerais O nosso conhecimento sobre a complexa organização celular é relativamente recente. Até à década de 40 apenas se conhecia da estrutura celular o que era possível observar em função do poder de resolução do microscópio óptico. Olhando ao longe uma floresta, ela surge como uma mancha verde; mas ao perto constatamos ser constituída por árvores e arbustos de espécies e 10

tamanhos diferentes. Do mesmo modo, também só depois do aperfeiçoamento das técnicas microscópicas e do aparecimento do microscópio electrónico a célula pôde ser «olhada de perto» e observadas, detalhadamente, as suas ultra-estruturas, até aí «escondidas» na massa semifluida do citoplasma. Com um poder de resolução e de ampliação muito superior ao do microscópio óptico, o microscópio electrónico permitiu penetrar no mundo microscópico da célula. Embora se apresente com uma construção física bastante mais complexa e robusta, o microscópio electrónico de transmissão (M.E.T.) tem, na globalidade, uma estrutura muito semelhante à do microscópio óptico. A diferença fundamental entre estes dois instrumentos de observação reside no facto de o microscópio electrónico não utilizar a luz para dar a imagem do objecto, mas sim um feixe de electrões acelerados, o que faz com que as lentes usadas não sejam de vidro ou cristal, como no microscópio óptico, mas «lentes» electromagnéticas. O comprimento de onda do feixe de electrões pode ser muito reduzido; obtendo-se assim um elevado poder de resolução. No microscópio electrónico de transmissão o feixe de electrões atravessa o material a observar, de modo que a imagem resulta da maior ou menor absorção dos electrões por parte das diferentes estruturas celulares. A imagem é visualizada através de um ecrã fluorescente ou é registada numa película fotográfica. Microscópio Electrónico de Transmissão (MET) Constituição e funcionamento O Microscópio electrónico de transmissão tem basicamente duas partes: 1 Parte electrónica 2 Parte do vácuo 11

1 PARTE ELECTRÓNICA O tipos de radiação são feixes de electrões. Existe um filamento de tungsténio em forma de V que está ligado a alta voltagem (40 KV a 120 KV). Esse filamento é levado à incandescência através do aquecimento, o que conduz à emissão de electrões. No MET não existem lentes de vidro ou cristal, mas sim lentes electrónicas (electrostáticas e electromagnéticas). Lentes electrónicas: Lente electrostática é esta lente que proporciona a formação do feixe de electrões canhão de electrões. Lentes electromagnéticas São cilindros ocos, metálicos, percorridos por uma corrente eléctrica que cria um campo magnético permitindo a deflexão do feixe electrónico. A focagem do feixe é conseguida através da variação da corrente que passa nas lentes. 2 PARTE DO VÁCUO Bombas rotativas e bombas de difusão; Pontos na coluna onde o ar é aspirado ; Aparelhos de medida; Reservatórios; Válvulas; Existência, na zona da preparação, de um sistema de isolamento que permite mudar a preparação sem que seja preciso pôr ar no vácuo de toda a coluna. 12

A IMPORTÂNCIA DO VÁCUO É importante que exista vácuo pela simples razão de que se existisse ar na coluna do microscópio, a colisão dos electrões com as partículas do ar iria fazer com que os electrões se deslocassem, somente, escassos milímetros, quando, na realidade, têm de percorrer cerca de 2 metros. ECRAN Os nossos olhos não são capazes de observar, directamente, imagens produzidas por electrões. Devido a isso recorre-se a um écran que está pintado com uma substância fluorescente, ou ao uso de uma câmara fotográfica. CÂMARA FOTOGRÁFICA A utilização da câmara fotográfica está relacionada com o facto do feixe de electrões destruir o material biológico. Assim sendo, a imagem é recebida num écran fluorescente que permite uma observação directa, ou então, numa chapa fotográfica que em seguida é revelada. VANTAGENS E INCONVENIENTES DO USO DO MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO EM CITOLOGIA Como os electrões só se propagam a distâncias consideráveis no vazio, toda a parte essencial do microscópio electrónico está encerrada numa coluna hermética, mantida sob vácuo; logo, as células não podem ser observadas vivas nem com as suas cores naturais. Além disso, o objecto tem de ser extremamente fino, de modo a permitir que um número suficiente de electrões o atravesse e forme uma imagem. 13

Outro aspecto que devemos ter presente é que a grande ampliação dada pelo microscópio electrónico, e o seu correspondente poder de resolução, por vezes possibilita apenas a observação de uma parte de um organito celular, pois a área do objecto que é visualizado varia inversamente à ampliação utilizada. A utilização do microscópio electrónico requer pessoal especializado; o seu preço é elevado, comparativamente ao do microscópio óptico, a par das dificuldades inerentes à preparação de material biológico para observação, faz com que este precioso auxiliar de investigação seja apenas privilégio de alguns laboratórios. Comparação entre o MOC e o MET CARACTERÍSTICAS M.ELECTRÓNICO M. ÓPTICO COMPOSTO TRANSMISSÂO Tipo de radiação Feixe de electrões Luz (fotões) Lentes Condensador Electromagnéticas e electrostáticas Várias lentes electromagnéticas Vidro ou cristal Ampliação 500 000 vezes 2000 vezes Poder de resolução máximo Focagem Local de formação da imagem Uma ou algumas lentes 0,5 0,1 nm 150-200 nm Variação da corrente eléctrica que passa através das lentes electromagnéticas A imagem é projectada num ecrã ou registada em película fotográfica As lentes têm um foco fixo e o focagem efectua-se fazendo variar o distância em relação ao objecto Retina do observador Imagem Preto e branco Geralmente colorida Material a observar Não vivo, desidratado, muito fino. É colocado numa grelha de cobre no vácuo. Vivo e não vivo, sendo normalmente colocado numa lâmina de vidro. 14

MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO DE VARRIMENTO (MEV) Há cerca de 30 anos começou também a ser utilizado um outro tipo de microscópio electrónico o microscópico electrónico de varrimento (M.E.V.). Com uma construção e operação totalmente diferentes do microscópio electrónico de transmissão (M.E.T.). O M.E.V. permite obter imagens da superfície externa de partículas muito pequenas e a três dimensões. TÉCNICAS PARA OBSERVAÇÃO DE CÉLULAS AO MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO Como foi referido, dadas as características de funcionamento do M. E. não é possível a observação de células vivas. O material a examinar é sujeito a um tratamento físico e químico. Este tratamento tem o objectivo de tornar o material suficientemente fino e seco a fim de permitir a passagem de electrões e haver formação de imagem. Tal como acontece no microscópio óptico, o material é primeiramente fixado e depois desidratado, sofrendo, de seguida, uma inclusão em resinas para adquirir a rigidez necessária ao seu seccionamento, com o auxílio de um ultramicrótomo. Uma das técnicas utilizadas é a técnica dos cortes seriados, que permite reconstituir tridimensionalmente as estruturas celulares, pois a célula não é plana e o que observamos em cada preparação não é mais do que uma imagem parcial de um plano de corte que foi realizado na célula. Resumo: Técnicas citológicas usadas em M. Electrónica: - fixação (com Tetróxido de Ósmio); - desidratação; - inclusão em resinas artificiais; - corte (ultramicrótomos); - contraste (utilizam-se substâncias contrastantes como o ósmio, o urânio ou o chumbo, que se ligam de forma diferente às várias estruturas celulares, fazendo variar o grau de penetração dos electrões nesses locais). 15

TÉCNICAS ESPECIAIS PARA OBSERVAÇÃO DE ESTRUTURAS CELULARES Nos últimos anos têm sido desenvolvidas técnicas especiais no sentido de permitir o isolamento das diferentes estruturas celulares e, consequentemente, uma observação mais minuciosa desses constituintes da célula: Uso de marcadores radioactivos com este método é possível detectar em que local da célula estão a ser sintetizadas determinadas substâncias e acompanhar o seu percurso. É uma técnica sofisticada em que se utilizam substâncias radioactivas que têm a propriedade de impressionar chapas fotográficas auto-radiografia. Criofractura esta técnica tem contribuído grandemente para o estudo da estrutura interna das biomembranas, pois permite a clivagem da bicamada lipídica, deixando observar o seu interior. Centrifugação diferencial permite isolar os diferentes organitos celulares em função da sua massa. Com este método foi possível estudar detalhadamente vários organitos celulares, nomeadamente mitocôndrias, cloroplastos, núcleos e ribossomas. 16

ORGANIZAÇÃO CELULAR De acordo com a Teoria Celular, a célula é a unidade básica estrutural e funcional de todos os seres vivos, comportando-se como unidade independente, mesmo nos organismos multicelulares. Apesar desta universalidade de estrutura e função, há diversidade no tamanho, forma e grau de complexidade. Algumas células possuem uma estrutura muito simples, mas a maioria apresenta uma maior complexidade. As células mais simples possuem um número muito reduzido de organitos e não têm sequer um núcleo organizado, individualizado do citoplasma por um invólucro são as células procarióticas. As células mais complexas possuem núcleo organizado e individualizado do citoplasma por um invólucro e numerosos organitos são as células eucarióticas. Os seres constituídos por células procarióticas chamam-se procariontes; incluem bactérias e algumas algas primitivas (algas azuis). Os seres constituídos por células eucarióticas chamam-se eucariontes e incluem os restantes seres vivos. Aspectos comparativos entre Células Procarióticas e Células Eucarióticas Características Células eucarióticas Células procarióticas Tamanho da célula Parede Celular Material genético Organelos Estruturas respiratórias Fotossíntese Flagelos Cerca de 40 µm de diâmetro; em regra 1000 a 10 000 vezes o volume da célula procariótica. Presente nas plantas e fungos. É rígida e formada por celulose nas plantas e por quitina nos fungos. Possuem verdadeiro núcleo que contém um ou mais nucléolos. Muitos organelos membranares como mitocôndrias, retículo, complexo de Golgi. Hialoplasma e mitocôndrias. Ocorre em cloroplastos com uma estrutura membranar complexa. Organelos locomotores complexos, rodeados por membrana plasmática Diâmetro médio 0,5 5 µm Rígida constituída por polissacarídeos com aminoácidos. Não existe invólucro nuclear, nem nucléolo. O material nuclear está em contacto directo com o citoplasma e constitui o nucleóide. Ausência de organelos com membranas. Contêm muitos ribossomas que têm menores dimensões que os das células eucarióticas. Hialoplasma e membrana plasmática. Sem cloroplastos. Tem lugar, por exemplo, em lamelas fotossintéticas. Organelos locomotores simples, não incluídos na membrana plasmática. 17

Aspectos comparativos entre Células Eucarióticas Animais e Células Eucarióticas Vegetais Apesar de em todas as células eucarióticas existir uma estrutura básica semelhante, há algumas diferenças entre a célula animal e a célula vegetal. No quadro seguinte estão evidentes algumas dessas diferenças. Estrutura Célula animal Célula vegetal Parede Celular Ausente Presente Centríolos Presentes (em regra) Ausentes (nas plantas superiores) Plastos Ausentes Presentes Vacúolos Presentes, são pequenos e temporários Presentes, as dimensões aumentam com a idade da célula e o número diminui. 18