DESENVOLVIMENTO DE INTERFACE AMIGÁVEL DE ROTINAS EM C++ PARA SEGMENTAÇÃO DE IMAGENS DE ESPERMATOZÓIDES OBTIDAS DE ESFREGAÇOS DE SÊMEN ALINE GUARATO DOS SANTOS 1, MARCELO EMÍLIO BELETTI 2 Resumo: O espermograma feito pela análise visual em microscopia de luz é hoje o método mais utilizado para avaliar a fertilidade do macho em medicina veterinária. No entanto, este é um exame subjetivo com grande variação entre examinadores. Tentando diminuir a subjetividade foram desenvolvidas rotinas em ambiente de programação Scilab para avaliação de espermatozóides. Visto que, no momento, estas rotinas são de uso complexo, exigindo do usuário grande conhecimento de informática e análise de imagem, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma interface amigável, que qualquer pessoa com um mínimo de conhecimento de informática possa utilizá-la, principalmente médicos veterinários. Foi desenvolvido um sistema de segmentação de imagens por limiar (thresholding), semiinterativo, isto é, o usuário fornece o arquivo (caminho) em que se encontra a imagem a ser trabalhada, e o limiar mais adequado para essa imagem. O limiar fornecido será usado para binarizar a imagem, ou seja, convertê-la para preto e branco. Depois de feito o thresholding, a imagem, salva em preto e branco, é segmentada e dividida em rótulos que são regiões específicas da imagem (espermatozóide ou fundo). Algumas regiões são descartadas, como a de fundo e nos casos em que houver aglomeração ou pedaços de espermatozóides, por não serem de interesse. Por fim, para cada rótulo, que represente uma região de espermatozóide, de interesse, é criado um arquivo de imagem, que será utilizado para futuros cálculos e avaliações. A interface demonstrou ser de fácil uso por pessoas sem grandes conhecimentos de informática. Palavras-chave: análise de imagem, espermatozóide, fertilidade, segmentação. 1 Faculdade de Computação - Universidade Federal de Uberlândia - Av. João Naves de Ávila, 2121 Uberlândia - CEP: 38.400-902 - aline_guarato@yahoo.com.br 2 Instituto de Ciências Biomédicas - Universidade Federal de Uberlândia - Av. Pará, 1720 Uberlândia - CEP: - mebeletti@ufu.br
2 Abstract: The espermograma made for the visual analysis in light microscopy is today the method more used to evaluate the fertility of the male in medicine veterinary medicine. However, this is a subjective examination with great variation between examiners. Trying to diminish the subjectivity routines in environment of Scilab programming had been developed for evaluation of spermatozoa. Since, at the moment, these routines are of complex use, demanding of the user great knowledge of computer science and analysis of image, the objective of this work was to mainly develop a friendly interface, that any person with a minimum of computer science knowledge can use it, doctors veterinarians. A system of segmentation of images for threshold (thresholding), half-interactive was developed, that is, the user supplies the archive (way) where if finds the image to be worked, and the adjusted threshold more for this image. The supplied threshold will be used to binarizar the image, that is, to convert it for black person and white. After made thresholding, the image, saved in black person and white, is segmented and divided in labels that are specific regions of the image (deep spermatozoon or). Some regions are discarded, as of deep and in the cases where it will have agglomeration or pieces of spermatozoa, for not being of interest. Finally, for each label, that represents an interest, spermatozoon region, is created an image archive, that will be used for future calculations and evaluations. The interface demonstrated to be of easy use for people without great knowledge of computer science. Keywords: analysis of image, spermatozoon, fertility, segmentation 1. INTRODUÇÃO O espermograma é o principal método de avaliação de fertilidade utilizado na rotina veterinária. Dentre várias características espermáticas avaliadas no espermograma de rotina, estão a avaliação da motilidade e da morfologia dos espermatozóides. Estas análises podem não ser suficientes, uma vez que não avaliam a estrutura da célula espermática como, por exemplo, a cromatina (DNA e proteínas específicas), que pode indicar melhor o status funcional dos espermatozóides, habilidade de fecundação e desenvolvimento embrionário (UNANIAN, 2000). Estudos mostram que a permanência de histonas somáticas ou ocorrência de anormalidades nas protaminas podem levar à formação de distúrbios de condensação da cromatina (complexo DNA - proteína) dos espermatozóides, a qual se torna frouxa com repercussões sobre a fertilidade (EVENSON et al., 1980; BELETTI e MELLO, 1996; BELETTI e MELLO
3 2004; BELETTI et al., 2004). Estas alterações cromatínicas podem ser identificadas por cito fotometria de fluxo com sêmen corado com alaranjado de acridina, contudo o alto custo desta metodologia inviabiliza seu uso na rotina veterinária brasileira. Métodos alternativos utilizando esfregaços corados com azul de toluidina (BELETTI e MELLO, 1997; BELETTI e MELLO, 2004) ou alaranjado de acridina (TEJADA, 1984) foram desenvolvidos e são utilizados principalmente em bovinos e humanos. Estas técnicas, assim como a avaliação de motilidade e da morfologia dos espermatozóides, por serem realizadas através de análise visual do examinador, possuem certo grau de subjetividade e mesmo tendenciosidade. Ao contrário da motilidade, a morfologia normal dos espermatozóides, e mesmo as anomalias, variam para cada espécie e se faz necessário uma padronização da técnica para cada uma. A maioria das técnicas até agora padronizadas para determinar alterações morfológicas de espermatozóides é restrita à análise morfométrica da cabeça de espermatozóides humanos, sendo mensuradas apenas a área, perímetro, comprimento, largura e razão largura/altura (KATZ et al., 1986; JAGOE et al., 1986; SCHRADER et al., 1990; DAVIS et al., 1992; DAVIS e GRAVANCE, 1993; MACLEOD e IRVINE, 1995). Para que a análise de imagem seja realmente otimizada, é necessário que novos parâmetros sejam avaliados, tais como: regularidade da superfície, largura da base, centralização da implantação da cauda, presença de vacúolos na cabeça, regularidade da cauda (peça intermediária e principal), textura (condensação) do acrossoma e compactação da cromatina. O uso de análise de imagem por computador para a avaliação da motilidade e morfologia dos espermatozóides vem sendo proposto. (GARRETT e BAKER, 1995, BELETTI e COSTA, 2003) Recentemente o grupo de pesquisa "Cybernetic Vision" do Instituto de Física de São Carlos - USP em colaboração com Instituto de Ciências Biomédicas da UFU criaram programas em ambiente "Scilab", para análise morfológica de espermatozóides, independente da espécie (BELETTI e COSTA, 2003; BELETTI et al., 2004, BELETTI et al., 2005a, b). Estes programas avaliam detalhadamente a morfologia da cabeça e a estabilidade da cromatina, utilizando esfregaços corados com azul de toluidina. Já está demonstrado que estes programas identificam alterações morfológicas e de cromatina não percebidas pela análise visual do espermograma de rotina (BELETTI e COSTA, 2003, BELETTI et al., 2004, BELETTI et al., 2005a). Entretanto, não se
4 sabe a verdadeira influência destas pequenas alterações na fertilidade. As rotinas desenvolvidas para avaliação da morfologia de espermatozóides de touro são de uso complexo, exigindo do usuário grande conhecimento de informática e análise de imagem. Este trabalho teve como objetivo principal desenvolver uma interface amigável, usando a análise de imagem por computador, para a avaliação da morfologia dos espermatozóides de touro (GARRETT e BAKER, 1995, BELETTI e COSTA, 2003), permitindo que qualquer pessoa, com um mínimo de conhecimento de informática, possa utilizá-la, principalmente médicos veterinários. Essa interface foi desenvolvida na tentativa de aumentar a precisão e rapidez da avaliação do sêmen, diminuindo a subjetividade, tendenciosidade e falhas do técnico/examinador. E importante deixar claro que a analise de imagem por computador não substituirá o médico veterinário, mas servira como mais uma ferramenta para esse profissional. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Confecção dos esfregaços Foram coletadas amostras de sêmen de 8 reprodutores suínos e 5 bovinos, independente de idade e raça. Três gotas de cada amostra de sêmen foram armazenadas em 1 ml de solução 2,94% de citrato de sódio, formolada a 4% (WEITZE, 1977). Desta solução foram feitos cinco esfregaços de sêmen de cada amostra. Para testar a segmentação automática foram utilizadas variações da coloração com azul de toluidina (BELETTI e MELLO, 1996) e rosa de Bengala (SILVA et al., 1993) (Figura 1). Figura 1: Diferença de contrastes (a) Imagem preparada com coloração Azul de Toluidina. (b) Imagem preparada com coloração Rosa de Bengala.
5 2.2. Captura das imagens Após definir-se a coloração rosa de Bengala como sendo a de melhor contraste, como mostra a Figura 1, foram feitos preparados de todas as amostras de sêmen e posteriormente, capturadas 10 imagens digitalizadas de cada esfregaço através de microscópio trinocular Olympus BX40 acoplado a câmera Olympus OLY- 200, ligada a um computador PC através de placa digitalizadora Data Translation 3153. As imagens dos esfregaços foram obtidas utilizando-se objetiva de 40x e 100x em microscopia de luz comum (transiluminação). Seta 2 Seta 3 Seta 1 Figura 2: Interface Tela Inicial. (Seta 1) Informar o arquivo de imagem a ser trabalhada. (Seta 2) Informar o valor de limiar. (Seta 3) Informar o valor de limiar.
Figura 3: Exemplos de binarização conforme variação no valor do limiar (a) Imagem de referência com coloração azul de toluidina. (b) Limiar igual a 200. (c) Limiar igual a 205. (d) Limiar igual a 215. (e) Limiar igual a 218. (f) Limiar igual a 222. 6
Figura 4: Exemplos de binarização conforme variação no valor do limiar (a) Imagem de referência com coloração rosa de Bengala. (b) Limiar igual a 180. (c) Limiar igual a 190. (d) Limiar igual a 200. (e) Limiar igual a 210. (f) Limiar igual a 220. 7
8 2.3. Desenvolvimento do sistema de entrada e segmentação de imagens Foi desenvolvido um sistema, com uma interface simples (Figura 2), de segmentação de imagens por limiar (thresholding) (BELETTI et al., 2004; BELETTI et al., 2005a), semi-interativo, isto é, o usuário fornece, no local indicado pela Seta 1 na Figura 2, o arquivo (caminho) em que se encontra a imagem a ser trabalhada e, então, informa o limiar mais adequado para essa imagem, no local indicado pela seta 2, na mesma figura. O limiar fornecido é usado para binarizar a imagem desejada, ou seja, convertê-la para preto e branco. Essa técnica é conhecida como thresholding. Outra opção para informar o limiar é por utilizar a barra, numerada de 1 à 255, mostrada pela seta 3 na Figura 2. Seta 3 Seta 2 Seta 1 Figura 5: Interface exibindo imagem fornecida (Seta 1) e aguardando um valor de limiar (Seta 2 ou 3).
9 A Figura 3 mostra exemplos de binarização conforme o valor do limiar, de uma imagem preparada com coloração azul de toluidina. A Figura 4, de uma, preparada com coloração rosa de Bengala. Nesta, observamos que a binarização apresenta melhores resultados pela questão do contraste, resultante do tipo de corante usado para o preparo da imagem. Consideraremos a imagem da Figura 4 (a) como exemplo. Para isso, é preciso informá-la na interface, como podemos observar na Figura 5, bem como o limiar mais adequado que, como observamos na Figura 4, para a imagem em questão é 200. Ao clicar no botão indicado na Figura 6, pela Seta 2, será feito o thresholding com o valor de limiar confirmado e a imagem binarizada será exibida na interface, conforme a Figura 6. Porém, a imagem resultante ainda não está salva, pois a função dessa visualização é Seta 1 Seta 2 Seta 3 Seta 4 Figura 6: Interface (Seta 1) Valor de limiar informado. (Seta 2) Botão para confirmação de limiar. (Seta 3) Imagem binarizada conforme o valor de limiar confirmado. (Seta 4) Botão para salvar imagem binarizada e suas respectivas segmentações.
10 permitir uma análise do limiar fornecido e possíveis correções. Depois de feito o thresholding, a imagem, salva em preto e branco, é segmentada e dividida em rótulos, que são regiões específicas da imagem (espermatozóide ou fundo). Por fim, para cada rótulo, que represente uma região de espermatozóide, é criado um arquivo, que será utilizado para futuros cálculos e avaliações. Na Figura 7, (a) apresenta um exemplo didático de uma imagem binarizada e (b) essa imagem depois de rotulada. Nesse exemplo, o rótulo de valor zero será descartado e para os outros rótulos (1, 2, 3, 4 e 5), que representam regiões de interesse (espermatozóides), formaremos cinco imagens que serão salvas em cinco arquivos diferentes. Figura 7: Exemplo didático (a) Imagem binarizada. (b) Imagem rotulada (5 rótulos de interesse) Voltemos para o exemplo da imagem mostrada na Figura 4 (a). Depois de fornecido o valor do limiar mais adequado e feito o thresholding, a rotulação nos dá um resultado de quatro rótulos. Porém, serão selecionados apenas dois rótulos de interesse, para os quais serão criadas duas imagens como mostradas na Figura 8, que serão salvas em arquivos distintos. Tendo como visão geral, o sistema desenvolvido, até então, faz a segmentação de uma imagem fornecida, separando suas regiões de interesse. Essas regiões são salvas, como imagem, em arquivos separados para análises futuras.
11 Figura 8: Rótulos extraídos e salvos como imagens. A interface desenvolvida foi utilizada por quatro usuários (alunos de graduação e pós-graduação da Faculdade de Medicina Veterinária) sem grande conhecimento de informática para testar sua interatividade e facilidade de uso. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A coloração com rosa de Bengala, por ser mais intensa quando comparada com o azul de toluidina, permitiu estabelecer o limiar de segmentação com maior facilidade. Assim, a segmentação em esfregaços realizados com ros de Bengala foi realizada rapidamente e aproveitando quase todos os espermatozóides contidos nas imagens. Já na coloração com azul de toluidina, os espermatozóides apresentaram pouco contraste com o fundo da imagem, dificultando a definição do limiar de segmentação. Porém, apesar da maior dificuldade, foi possível definir-se o limiar de segmentação e aproveitar quase todos os espermatozóides das imagens. A interface desenvolvida foi facilmente utilizada pelos usuários sem grandes conhecimentos de informática e sem experiência em análise de imagem, desde que fosse dada uma explicação anterior do funcionamento do software. A linguagem C++ mostrou-se adequada para o desenvolvimento deste tipo de interface. Ainda se faz necessário interligar esta interface com as rotinas de análise das imagens já segmentadas. 4. CONCLUSÃO Conclui-se que a interface desenvolvida facilita a segmentação de imagens de espermatozóides obtidas de esfregaços de sêmen, mesmo quando o usuário não possui grandes conhecimentos de informática ou análise de imagem.
12 5. AGRADECIMENTOS Este trabalho foi apoiado pela FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais e pelo Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). BELETTI, M. E.; MELLO, M. L. S. Comparison between the toluidine blue stain and the feulgen reaction for evaluation of rabbit sperm chromatin condensation and their relationship with sperm morphology. Theriogenology v. 62, n. 3-4, p. 398-402, 2004. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BELETTI, M. E.; COSTA, L. F. A systematic approach to multi-species sperm morphometrical characterization. Analytical and Quantitative Cytology and Histology v. 25, n. 2, p. 97-107, 2003. BELETTI, M. E.; MELLO, M. L. S. Methodological variants contributing to detection of abnormal DNA-protein complexes in bull spermatozoa. Brazilian Journal of Genetic v. 19, n. 1, p. 97-103, 1996. BELETTI, M. E.; MELLO, M. L. S. Testicular and semen alteration after three days of experimental cryptorchidism in rabbit. Brazilian Journal of Morphological Science v. 14, p. 88-88, 1997. BELETTI, M. E.; COSTA, L. F.; VIANA, M. P. A computational approach to the characterization of bovine sperm chromatin alterations. Biotechnic & Histochemistry v. 79, n. 1, p. 17-23, 2004. BELETTI, M. E.; COSTA, L. F.; VIANA, M. P. A comparison of morphometric characteristics of sperm from fertile Bos Taurus and Bos indicus bulls in Brazil. Animal Reproduction Science v. 85, n. 1-2, p. 105-116, 2005a. BELETTI, M. E.; COSTA, L. F.; VIANA, M. P. A spectral framework for sperm shape characterization. Computers in Biology and Medicine v. 35, n. 6, p. 463-473, 2005b. DAVIS, R.O.; BAIN, D.E.; SIEMERS, R.J.; THAL, D.M.; ANDREW, J.B.; GRAVANCE, C.G. Accuracy and precision of the CellForm-Human automated sperm morphometry instrument. Fertility and Sterility v.58, n.4, p.763-769, 1992.
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