significativos, porém o material genético pode ser estocado por períodos indefinidos de tempo e então utilizado na IA (HOLTb 2000).

1 1 INTRODUÇÃO GERAL Estudos arqueológicos recentes demonstram que o cão foi o primeiro animal domesticado pelo homem. Os mais antigos esqueletos de canídeos foram encontrados cerca de 30.000 anos após o aparecimento do Homo sapiens sapiens, sempre próximos aos acampamentos humanos, sendo denominados por este motivo de Canis familiaris (GRANDJEAN e VAISSAIRE 2001). Cada raça canina possui um padrão específico, constituída por um conjunto de características físicas e comportamentais que lhes permite desempenhar a função para a qual a raça foi desenvolvida. Neste sentido, o homem tenta constantemente promover o melhoramento genético na criação de cães, utilizando ferramentas melhoradoras, dentre elas, as biotécnicas reprodutivas (SILVA 2005). O interesse na reprodução de cães, tanto com o objetivo de melhoramento ou como modelo experimental para a preservação de outras espécies de canídeos, desponta como um vasto campo para os pesquisadores da atualidade (CUNHA 2002). Dentre as diferentes biotécnicas reprodutivas disponíveis, tem-se destacado a preservação de sêmen, que possibilita o melhor aproveitamento dos ejaculados de um mesmo reprodutor, facilitando a propagação deste material genético e sua utilização por meio da inseminação artificial (IA) (OLIVEIRA 2003). Os primeiros produtos obtidos por meio da IA ocorreram na Itália em 1780, quando estudos conduzidos pelo abade Lazzaro Spallanzani deram origem a três cães. Elias Ivanov, após estes trabalhos pioneiros, demonstrou que a fecundação era possível após a substituição dos líquidos produzidos pelas glândulas anexas masculinas por um soro artificial e, em pesquisas posteriores, esclareceu a importância do frio na conservação do sêmen extraorganismo (MIES FILHO 1982). De acordo com ENGLAND e PONZIO (1996) o sêmen pode ser preservado para estocagem por refrigeração ou congelação. Este último processo causa danos celulares

2 significativos, porém o material genético pode ser estocado por períodos indefinidos de tempo e então utilizado na IA (HOLTb 2000). A primeira ninhada gerada a partir de sêmen congelado nasceu apenas em 1969. Esta lacuna de cerca de 200 anos demonstra o pouco interesse até então, no desenvolvimento de técnicas reprodutivas nesta espécie (FARSTAD 2000b). Pesquisas realizadas com sêmen criopreservado demonstraram que, os espermatozóides não apresentavam a mesma motilidade e vigor do sêmen in natura ou refrigerado, reduzindo sua viabilidade no trato genital feminino (ROTA et al. 1995; ENGLAND e PONZIO 1996; PEÑA et al. 1998). De acordo com HOLT (2000a), já foram descritas diversas metodologias destinadas a criopreservação de sêmen, as quais variam de acordo com a composição do diluidor e do crioprotetor utilizado. A diferença na composição da membrana espermática entre indivíduos de espécies diferentes e dentro da mesma espécie faz com que um determinado diluidor possa conferir maior ou menor proteção aos espermatozóides (OLIVEIRA 2003). A utilização de substâncias crioprotetoras é essencial para a viabilidade das células espermáticas criopreservadas. Estas podem ser classificadas em dois grupos, de acordo com seu mecanismo de ação. O glicerol, metanol, etileno-glicol, dimetilsulfóxido e amidas pertencem à classe que penetra na célula. Grandes moléculas como as proteínas do leite e da gema de ovo, açúcares como a lactose, sacarose, rafinose e frutose, além de polímeros sintéticos como a metilcelulose são considerados crioprotetores não permeantes (HOLT 2000a). O glicerol é o crioprotetor mais utilizado na criopreservação de sêmen da grande maioria de espécies animais, inclusive a canina (VANUCCHI et al. 1999). Porém, os índices de fertilidade e viabilidade das células espermáticas desta espécie mostram-se variáveis e questionáveis, fazendo com que muitos pesquisadores busquem outros agentes crioprotetores (OLIVEIRA 2003).

3 As amidas têm sido utilizadas na criopreservação de sêmen de bovinos, suínos, coelhos, camundongos e garanhões e, surgem como uma alternativa promissora na congelação de sêmen canino (DALIMATA e GRAHAM 1997; SNOECK et al. 2001; SZTEIN et al. 2001, MEDEIROS et al. 2002; VIDAMENT et al. 2002; ALVARENGA et al. 2002; OLIVEIRA et al. 2003). A criopreservação de sêmen canino possui algumas dificuldades que devem ser elucidadas, para que a técnica possa ser padronizada, devido principalmente, às características particulares dos gametas desta espécie (SILVA 2005). O objetivo desta dissertação é estudar e avaliar o diluidor TRIS-gema associado a 5% de dimetilformamida (DF) sobre o sêmen canino em diferentes momentos do processo de criopreservação, avaliando-se a motilidade, motilidade progressiva, vigor, morfologia espermática, morfologia acrossomal, integridade da membrana plasmática e taxa de sobrevivência espermática, como diluidor alternativo ao TRIS-gema associado ao Glicerol.

4 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 O ejaculado canino As dimensões médias dos espermatozóides caninos são 68,0µm de comprimento total; 7,0 µm de comprimento e 5,0 µm de largura da cabeça; 11,0 µm de comprimento da peça intermediária e 50,0 µm de comprimento da cauda. A produção espermática diária no cão é estimada entre 369 a 594 x 10 6 por animal (CHRISTIANSEN 1988). O volume total de sêmen ejaculado é variável e depende da idade e tamanho do cão, freqüência das colheitas e quantidade de fluido prostático colhido. O volume varia de um a 30mL e ph normal está compreendido entre 6,3 e 6,7 (FELDMAN e NELSON 1996). Para o sêmen in natura a motilidade espermática progressiva não deve ser inferior a 70%. O número de espermatozóides com alterações morfológicas não devem ultrapassar 30-40% de uma amostra e o total de defeitos maiores não deve ser superior a 10%. A concentração espermática canina normal pode variar de 200 milhões até um bilhão de espermatozóides no ejaculado total (LINDE-FORSBERG 1995; HENRY e NEVES 1998; FELDMAN e NELSON 1996; STROM et al. 1997). 2.1.2 Avaliação seminal A mais eficiente avaliação que uma amostra de sêmen processado pode ser submetida é a avaliação in vivo da sua capacidade de fertilização, isto é, a taxa de nascimentos e o tamanho de ninhadas, após a IA. Porém, estes testes de fertilidade requerem um grande número de animais, são demorados, dispendiosos e dependem de uma grande variedade de fatores que não a qualidade do sêmen propriamente dito. Dentre esses fatores destacam-se a dose e o volume inseminante, número de inseminações realizadas, local de deposição do

5 sêmen, momento da inseminação e fatores individuais da fêmea, além de produzirem filhotes não desejados (FARSTAD, 1996; HAY et al. 1997; STORNELLI et al. 2001). Dentre as técnicas disponíveis para avaliação in vitro de uma amostra de sêmen in natura ou pós-descongelação, a de mais fácil execução e mais comumente utilizada é a observação da motilidade espermática. Entretanto, uma análise mais criteriosa exige a aplicação de testes que permitam avaliar a morfologia, integridade e concentração de enzimas acrossomais, a integridade da membrana plasmática e a capacidade interação entre espermatozóides e oócitos (STRÖM et al. 1997). A morfologia acrossomal pode ser avaliada em microscopia de contraste de fase ou por meio de colorações específicas. A avaliação deste componente é de suma importância, pois é a estrutura celular mais sensível à criopreservação, e sua integridade é essencial para a fertilização (IVANOVA-KICHEVA et al. 1995; STRÖM et al. 1997). Os parâmetros usualmente utilizados para avaliar a fertilidade de machos (número total de espermatozóides, motilidade progressiva e morfologia) têm uma capacidade limitada para predizer o potencial de um ejaculado. A membrana plasmática é de fundamental importância para o processo de fertilização, por isso mais atenção tem sido dedicada a ela nos últimos anos. O teste hiposmótico (HO) tem sido utilizado com aparente sucesso para avaliar a integridade funcional da membrana. Este teste foi realizado em várias espécies, e seu uso tem sido indicado como método adicional de avaliação da fertilidade (NEILD et al. 1999). O teste hiposmótico tem como objetivo principal avaliar o quanto a membrana espermática intacta é funcional. Quando exposto a uma solução hiposmótica, espermatozóides funcionais irão inchar para estabilizar o equilíbrio osmótico, produzindo o inchaço típico da cauda. Uma vez que a integridade estrutural da membrana espermática, assim como, a preservação de sua atividade bioquímica, são condições indispensáveis para a ocorrência da fertilização, o HO oferece maior confiabilidade em comparação a outros métodos, como por exemplo, a coloração supra-vital e a motilidade progressiva. A acurácia e simplicidade

6 do HO demonstram que ele pode ser empregado rotineiramente na análise seminal. Há ainda vantagens adicionais por ser menos susceptível aos efeitos imediatos do choque térmico e avaliar as células individualmente e não a população, ao contrário do que ocorre com a motilidade progressiva (NEILD et al. 1999). O tempo de sobrevivência dos espermatozóides no trato reprodutivo das fêmeas difere entre espécies e depende de uma variedade de fatores, que são responsáveis por períodos de sobrevivência espermática característicos. O teste de termo resistência (TTR) avalia a longevidade dos espermatozóides in vitro, mantendo o espermatozóide à temperatura de 37ºC, próxima à temperatura corporal, mimetizando as condições que as células são submetidas quando no trato reprodutor feminino, aumentando seu metabolismo e causando uma depleção nos níveis de seus nutrientes. A taxa de sobrevivência espermática é avaliada em intervalos regulares de tempo (HOE et al. 2001). 2.2 Criopreservação e crioinjúria O espermatozóide é uma célula altamente polarizada e especializada, com uma estrutura tripartida em cabeça, peça intermediária e cauda, que perdeu sua capacidade de biossíntese, reparação, crescimento e divisão celular durante a fase final da espermatogênese (YOSHIDA 2000). A membrana plasmática das células espermáticas tem a estrutura organizada numa bicamada de duplo folheto com lipídios e proteínas associados. Ela atua como uma estrutura especializada, que possui um papel ativo na capacidade fertilizante, recebendo sinais e modificando-se durante os processos de espermatogênese, trânsito e armazenagem epididimários, ejaculação, deposição no trato genital, capacitação e fecundação. Fatores que atuem sobre as células espermáticas, tais como, alterações na composição, ph, temperatura e osmolaridade do meio que as circunda, podem provocar alterações irreversíveis em suas membranas (WATSON 1995; WATSON 2000; CUNHA 2002).

7 A redução de temperatura leva a célula a reduzir seu metabolismo, proporcionando uma diminuição nos gastos energéticos e na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo, assim, para a preservação celular. Da mesma forma que a congelação pode levar a célula a este estado de quiescência, reduzindo ou paralisando algumas reações bioquímicas celulares, ela pode, por outro lado, acelerar algumas outras, causando danos ou mesmo a morte desta célula. Esses efeitos podem surgir de maneira diferente nas diversas espécies animais, entre indivíduos de uma mesma espécie ou até mesmo, entre partes diferentes de um mesmo espermatozóide, como o acrossoma ou as mitocôndrias (HOLT 2000a). Quando o sêmen é submetido à refrigeração, a membrana celular sofre algumas mudanças relacionadas à sua estrutura, principalmente nos lipídios e, alterações funcionais que ainda não foram completamente entendidas e são parcialmente irreversíveis, sendo denominadas em conjunto de Choque Térmico (WATSON 2000). O termo Choque Térmico define um conjunto de alterações que ocorrem nos espermatozóides dos mamíferos quando estes são resfriados rapidamente da temperatura de 37ºC até temperaturas próximas a 5ºC. Tais alterações são caracterizadas por distúrbios como: decréscimo de fluidez, aumento da permeabilidade, desidratação, danos acrossômicos, liberação de enzimas e fosfolipídios, diminuição da taxa de glicólise, frutólise e respiração celular e aumento da degeneração do ácido desoxirribonucléico (DNA), que contribuem para redução da fertilidade (FARSTAD 1996; HOLT 2000a; WATSON 2000). A redução da temperatura a valores próximos a 5ºC pode levar ao rearranjo de alguns fosfolipídios semelhantes dentro da bicamada lipídica, que podem agrupar-se e assumir uma configuração na qual, cabeças polares e hidrofílicas se agrupam formando micelas, enquanto que suas caudas hidrofóbicas se voltam para o meio externo. Com este novo arranjo, as propriedades básicas da membrana plasmática, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas são alteradas, modificando também, a sua funcionalidade (HOLT 2000a; WATSON 2000).

8 De acordo com WATSON (2000) a regulação do influxo de cálcio é afetada pela redução da temperatura, sendo esta, uma das mais graves alterações em termo de função espermática e, em alguns casos, esta modificação pode tornar a célula inviável. A entrada de cálcio na célula durante a refrigeração, mimetiza o que ocorre durante a capacitação fisiológica, contribuindo para iniciar as reações fusogênicas entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal externa. Há uma grande similaridade entre os danos celulares que ocorrem durante a congelação e as alterações próprias da reação acrossomal, podendo-se considerar esta, uma versão desorganizada da primeira, sendo este processo denominado de criocapacitação. Quando se congela células espermáticas, estas são submetidas ao estresse resultante de interações água-soluto, alterando a osmolaridade do meio que as circunda. A congelação da água presente no meio extracelular expõe o espermatozóide a uma solução hiperosmótica, o que provoca desidratação desta célula, numa tentativa de alcançar um equilíbrio osmótico, alterações na membrana e influxo de íons para o espermatozóide. Este efeito é conhecido como efeito solução e é considerado um dos pontos críticos da criopreservação, pois a desidratação severa e a exposição a um meio extremamente saturado podem causar danos irreversíveis à célula (HOLT 2000a). Espermatozóides que são congelados em taxas rápidas de decréscimo de temperatura podem ter suas membranas rompidas devido à formação de cristais de gelo intracelulares, principalmente durante a descongelação. Como não há tempo suficiente para que ocorra um grande efluxo de água durante a criopreservação, no momento em que começa a haver uma elevação da temperatura, a água intracelular se descongela quando ainda há uma temperatura baixa o suficiente para permitir uma recristalização, possibilitando o surgimento de grandes cristais de gelo, advindos desta recristalização, expondo a célula a riscos de perfurações na sua membrana (HOLT 2000a). Quando se utiliza taxas lentas de congelação, as células espermáticas perdem uma grande quantidade de água para o meio extracelular, numa tentativa de reverter o efeito solução. Quando isto ocorre, é necessário que a descongelação seja realizada também de maneira

9 lenta, para que o volume de água seja reequilibrado antes da descongelação total, evitando que grandes mudanças no volume celular provoquem danos à membrana (HOLT 2000a). HOLT (2000b) notou que espermatozóides de diferentes indivíduos podem exibir repostas significativamente diferentes a um mesmo protocolo de congelação. Foi observado também que células espermáticas de algumas espécies suportam de maneira mais eficaz a crioinjúria, fato este que pode ser verificado nos canídeos (YU et al. 2002). 2.3 Diluidores e sua interação com a célula espermática Para que um protocolo de criopreservação possa ser utilizado com eficiência, as células espermáticas devem ter seu potencial fertilizante mantido, sendo capazes de atingir o local onde se dá a fertilização e concluir os processos de capacitação e reação acrossômica (ROTA 1998; STRÖM e HOLST 1999; PEÑA 2000). De acordo com SCHÄFER-SOMI et al. (2005), os protocolos de criopreservação disponíveis variam quanto ao uso de fatores estabilizantes de membrana, concentração do crioprotetor, concentração espermática por dose, número de diluições e curvas de congelação e descongelação. A substituição do plasma seminal por meios diluidores contendo sistema tampão, substrato energético, antibióticos, fosfolipídios e crioprotetores é uma técnica normalmente indicada quando o intuito é a preservação das células espermáticas (HOE et al. 2001). A utilização de meios diluidores para a criopreservação de espermatozóides caninos ocorreu de forma empírica, baseando-se na utilização de meios empregados na congelação de sêmen de outras espécies (FARSTAD 1996). De acordo com WATSON (2000), a busca por um bom diluidor capaz de criopreservar com eficiência o sêmen, é uma das grandes metas dos criobiologistas que desenvolvem estudos

10 na área de biotecnologia da reprodução, uma vez que a composição do diluidor é um dos fatores que mais afeta a proporção de espermatozóides vivos após a congelaçãodescongelação. Diversos diluidores já foram empregados na preservação de sêmen canino, dentre eles o leite desnatado (CUNHA e LOPES 1997), o glicina-gema (CUNHA e LOPES 1997; CUNHA e LOPES 2001), o lactose-gema (IVANOVA-KICHEVA et al. 1997), TRISfrutose-ácido cítrico (ROTA et al. 1999; SILVA et al. 2001) e, desenvolvido no Brasil, um diluidor à base de água de coco (CARDOSO 2000). Algumas empresas desenvolveram diluidores específicos para sêmen canino, tais como o Laiciphos 478 e Biociphos W482 (IMV França) (SILVA e VERSTEGEN 1995). STRÖM et al. (1997) utilizaram o diluidor CLONE (Cryogenic Laboratories of New England Inc.), obtendo bons resultados após a descongelação. Porém, a grande desvantagem destes diluidores é que a sua composição não é conhecida (FARSTAD 1996). Entretanto, em um estudo realizado por LINDE-FORSBERG et al. (1995), foi descrito que o diluidor mais utilizado na criopreservação do sêmen canino é o TRIS-citrato com 20% de gema de ovo. 2.3.1 Composição do meio diluidor 2.3.1.1 Gema de ovo A adição de protetores de refrigeração é necessária para evitar danos aos espermatozóides durante a redução da temperatura nos processos de refrigeração e congelação. A gema de ovo de galinha é o componente de origem biológica mais largamente utilizado na composição dos diluidores para o sêmen de cães, por conter lecitina (fosfatidilcolina), a qual se acredita proteger a membrana espermática por restaurar os lipídios perdidos durante o choque térmico (WATSON 1995; FARSTAD 1996), além de prevenir a rotação da cauda do espermatozóide, favorecendo a manutenção da sua motilidade (HOLT 2000b).

11 A concentração de gema de ovo nos diluidores disponíveis para preservação de sêmen canino varia com a composição dos mesmos, visto que também possui poder de tampão. Sua concentração no meio varia de acordo com a capacidade tamponante dos outros componentes do diluidor (FARSTAD 1996). Nesse contexto, a maioria dos autores tem utilizado concentrações em torno de 20% no diluidor (SILVA et al. 2000; SILVA et al. 2001). 2.3.1.2 Crioprotetor Os crioprotetores atuam protegendo as células espermáticas do choque térmico que ocorre durante o processo de congelação e descongelação (CAVALCANTI et al. 2002). Crioprotetores intracelulares ou extracelulares provocam a desidratação do espermatozóide, necessária para o sucesso da criopreservação, embora possam acarretar danos às células (SZTEIN et al. 2001). Os efeitos tóxicos que impedem que 100% das células sobrevivam, dependem, em grande parte, da concentração do crioprotetor utilizado e do tempo de exposição da célula ao mesmo (OLIVEIRA 2003). De acordo com DALIMATA e GRAHAM (1997) e HOLT (2000b) os crioprotetores extracelulares são proteínas, açúcares de alto peso molecular, polivinilpirrolidona, entre outros. Estes agentes atuam por meio de um mecanismo osmótico, criando um meio hipertônico, que promove a desidratação celular durante o processo de congelação e impede a formação de grandes cristais de gelo intracelulares. Existe um grande número de compostos de ação crioprotetora intracelular, dentre os quais podemos citar o glicerol, o dimetilsulfóxido (DMSO), etileno-glicol, propanodiol, butanol, metanol e as amidas. A ação protetora destas substâncias é conferida às suas propriedades coligativas e ligantes com a água, diminuindo o ponto de congelação intracelular e, aumentando a quantidade de água que permanece no estado líquido em baixas temperaturas, reduzindo a concentração intracelular de solutos e abrandando os danos do

12 efeito soluto (DALIMATA e GRAHAM 1997; PEÑA 1997; HOLT 2000a; WATSON 2000). O glicerol, um álcool polihídrico altamente permeável, é o crioprotetor mais amplamente utilizado para congelar sêmen de animais domésticos (FARSTAD 1996). Sua concentração no meio diluidor pode variar de acordo com a curva de refrigeração e os protocolos de congelação e descongelação empregados. Porém, o fator determinante diz respeito à espécie animal. Para cães, os melhores resultados são alcançados com uma concentração variando entre 2% e 8% (PEÑA et al. 1998; ROTA et al. 1998). Em um esforço para minimizar os danos osmóticos nos espermatozóides, têm sido avaliados crioprotetores alternativos, com menor peso molecular e maior permeabilidade membranar que glicerol (SQUIRES et al. 2004). As amidas, entre elas a formamida, acetamida e lactamida, são agentes crioprotetores permeantes que promovem bons resultados na criopreservação de sêmen bovino, eqüino, suíno, e de coelhos. (DALIMATA e GRAHAM 1997; SNOECK et al. 2001; ALVARENGA et al. 2002; MEDEIROS et al. 2002; VIDAMENT et al. 2002). VIDAMENT et al. (2002), verificaram que a DF a 2% pode ser usada com sucesso como crioprotetor para espermatozóides eqüinos, com resultados semelhantes aos do glicerol. Resultados semelhantes foram obtidos por MEDEIROS et al. (2002) quando compararam uma concentração de 5% de DF ao glicerol também a 5%. Estes autores observaram que a utilização da DF resultou em melhor motilidade, vigor e viabilidade dos espermatozóides eqüinos pós-descongelação. Corroborando estes resultados, ALVARENGA et al. (2002), obtiveram melhores resultados para sêmen eqüino criopreservado com DF, principalmente para garanhões cujos espermatozóides apresentavam sensibilidade conhecida ao glicerol.

13 SZTEIN et al. (2001) verificaram que a avaliação pós-descongelação de sêmen de camundongos criopreservados com formamidas apresentou valores de motilidade, motilidade progressiva e integridade de membrana semelhantes aos resultados encontrados quando se utilizou glicerol. Devido aos conhecidos efeitos tóxicos e contraceptivos do glicerol, novos estudos com crioprotetores foram desenvolvidos por OLIVEIRA (2003), que obteve resultados superiores quando utilizou a DF associada ao diluidor lactose-gema para espermatozóides caninos criopreservados, quando comparado ao TRIS-gema com etileno-glicol (EG). Conforme descrito anteriormente, LINDE-FORSBERG et al. (1995), afirmou que o diluidor TRIS-Gema é o meio mais utilizado na criopreservação de sêmen canino, entretanto, não foi encontrado na literatura consultada nenhuma referência à utilização do TRIS juntamente com a DF para a congelação do sêmen desta espécie. 2.3.1.3 Açúcares Os efeitos benéficos da suplementação de açúcares nos meios diluidores, sobre a viabilidade pós-descongelação dos espermatozóides caninos foram descritos por YILDIZ et al. (2000). Os açúcares que são adicionados ao diluidor, agem como substrato energético para os espermatozóides durante a incubação, além de manterem a pressão osmótica do meio e, ainda, possuírem uma ação crioprotetora, atuando no aumento da porcentagem de água extracelular em estado líquido e reduzindo o teor de sais nestas soluções aquosas (YILDIZ et al. 2000 e HOLT 2000b). A combinação de dois ou mais açúcares em concentrações apropriadas no meio diluidor promove uma maior proteção às células, quando comparada ao uso de um único. Monossacarídeos como a glicose e a frutose e dissacarídeos como a lactose, são amplamente utilizados (YILDIZ et al. 2000).

14 Espermatozóides caninos mantidos em meio com frutose apresentam motilidade superior quando comparados àqueles incubados em presença de glicose (YILDIZ et al. 2000; RIGAU et al. 2001). 2.3.1.4 Tampões O metabolismo espermático resulta numa grande quantidade de metabólitos tóxicos, acarretando o aumento da concentração de íon de hidrogênio e ácido lático no meio extracelular. Este acúmulo pode causar a morte das células espermáticas devido à drástica diminuição do ph no meio. (FARSTAD 1996; HOLT 2000b). Diversas substâncias com poder tampão, dentre elas o citrato de sódio, TRIS (trishidroximetilaminometano) e TES (N-tris(hidroximetil)metil2-aminoetanosulfônico) têm sido utilizadas com sucesso na criopreservação de sêmen canino. Os tampões devem ser utilizados para manter o balanço iônico e o ph do diluidor (FARSTAD 1996; ROTA 1998; HOLT 2000a; PEÑA 2000). O citrato de sódio aumenta a diluição da gema de ovo no meio líquido, favorecendo sua ação sobre os espermatozóides e, atua ainda, como quelante de cálcio, diminuindo a quantidade que atravessa a membrana espermática (HOLT 2000a). De acordo com FARSTAD (1996), muitos pesquisadores continuam a utilizar o tampão TRIS-frutose original, enquanto outros preferem aperfeiçoar este tampão substituindo a frutose pela glicose ou pelos dissacarídeos não penetrantes sacarose e lactose, que podem ainda agir como crioprotetores extracelulares.

15 2.4 Colheita e processamento do sêmen para criopreservação 2.4.1 Colheita O método de colheita seminal mais amplamente utilizado é a manipulação digital do pênis do cão, na altura do bulbo cavernoso, estrutura anatômica própria desta espécie, relacionada com a ejaculação natural. A ereção ocorre juntamente com a exposição do pênis e o prepúcio é retraído para trás do bulbo. O pênis é levemente pressionado caudalmente ao bulbo e a ejaculação da primeira fração coincide com movimentos pélvicos do cão. Para este método de colheita, não é necessário condicionamento do animal nem presença de fêmea em estro (SILVA et al. 2002). O cão apresenta um padrão de ejaculação fracionado, sendo a primeira fração, préespermática, composta por algumas gotas de um líquido claro, originado na próstata cuja função é limpeza e estabilização do ph do canal uretral. Seu ph varia de 6,2 a 6,5, enquanto seu volume varia de 0,5 a 2,5mL A segunda fração é de origem testicular e epididimária, sendo chamada de fração espermática. É rica em espermatozóides, de aspecto turvo, leitoso e opalescente, seu volume varia individualmente, de 0,5 a 3,5mL e seu ph situa-se normalmente entre 6,3 e 6,6. A terceira fração, também de origem prostática é a de maior volume e serve como diluidor natural. É mais clara e facilmente distinguível da fração espermática. Seu ph normal oscila entre 5,6 e 7,0 e seu volume pode chegar a 30mL (SILVA et al. 2002). Cada animal apresenta um padrão individual de ejaculação, repetindo esse tipo de comportamento com regularidade. Essa informação pode colaborar com o sucesso de futuras colheitas (SEAGER 1986) 2.4.2 Centrifugação Embora o plasma seminal atue como um meio de transporte para o espermatozóide durante o processo de monta natural, este não é considerado um bom diluidor para o sêmen que será criopreservado e a célula espermática morre mais rapidamente quando mantida in natura.

16 Estudos conduzidos por HOE et al. (2001) demonstram a necessidade de centrifugação do sêmen canino para que haja substituição do plasma seminal por diluidores capazes de promover uma melhor preservação das células espermáticas. Avaliando o efeito prejudicial do plasma seminal sobre a integridade da membrana espermática bovina, ROTA et al. (1995), concluíram que a adição de extensores aumentaria o número de células espermáticas caninas com membrana plasmática íntegra após a congelação / descongelação. Com o objetivo de verificar o efeito do plasma seminal sobre a congelabilidade do sêmen canino, PEÑA (1997) utilizou ejaculados compostos pelas três frações e ejaculados compostos apenas pela fração rica em espermatozóides, concluindo que a criopreservação apenas desta fração, produz um melhor aproveitamento pós-descongelação. De acordo com CUNHA e LOPES (1999), o ejaculado canino apresenta grande oscilação de volume e concentração espermática, devido às significativas variações de peso e tamanho entre as diferentes raças. Torna-se, então, necessária a adoção de uma técnica capaz de amenizar essas diferenças e manter constantes estas características, objetivando a padronização do processo de congelação do sêmen nesta espécie. Assim, inúmeros estudos sugerem a centrifugação como um método capaz de eliminar o plasma seminal e padronizar o volume do ejaculado canino destinado à criopreservação, (ROTA 1998; STROM HOLST 1999; CUNHA 2002). CUNHA (2002) concluiu que a centrifugação de sêmen canino em meio à base de leite desnatado e glicose apresentou melhor vigor, não afetou a qualidade do movimento espermático e a integridade das membranas espermáticas, além de conferir maior manutenção da motilidade, durante incubação a 37 C, quando comparado com centrifugação com plasma seminal autólogo, Percoll (SIGMA) ou sêmen não centrifugado. RIJSSELAERE et al. (2002) verificaram que a centrifugação do sêmen canino com valores próximos a 720g, por cinco minutos, é a melhor estratégia para remoção do fluido

17 prostático, pois a perda celular no sobrenadante é aceitável e os parâmetros funcionais dos espermatozóides são mantidos. Utilizando os mesmos argumentos relacionados aos objetivos da centrifugação CUNHA e LOPES (2001); CUNHA (2002) e OLIVEIRA (2003), trabalharam com uma força de centrifugação de 800g durante cinco minutos. 2.4.3 Diluição e período de equilíbrio A célula espermática necessita de um tempo para se estabilizar no meio diluidor. Este tempo depende dos componentes do meio, do protocolo utilizado e, de características inerentes aos espermatozóides de determinada espécie ou indivíduo (ROTA 1997; HOLT 2000b). O período de equilíbrio é um importante passo na criopreservação do sêmen canino, pois também permite que a célula espermática se adapte a temperaturas decrescentes (de 37 C a 4-5 C) antes do contato com temperaturas extremas durante o processo de congelação (CUNHA e LOPES 2001). O tempo gasto e a curva imposta para os espermatozóides durante a refrigeração são fatores importantes, pois aparentemente, se este período for controlado, os espermatozóides apresentariam modificações graduais na membrana plasmática e de fluxos iônicos que renderiam à célula maior resistência durante a etapa seguinte a congelação (ENGLAND 1993; WATSON 1995). A refrigeração do sêmen canino pode ser realizada em caixa de isopor ou geladeira. A refrigeração e o período de equilíbrio em geladeira têm sido descritos com sucesso por diversos autores (ROTA et al. 1995; CUNHA 2002; CUNHA et al. 2003). De acordo com CUNHA (2002), a congelação precisa ser um processo rápido, buscando-se um tempo de equilíbrio que garanta às células todos os benefícios advindos deste

18 procedimento, concluindo que os períodos de equilíbrio de 40 e 60 minutos a 5 C, foram eficazes e proporcionaram eficiência ao processo de congelação. Diversos trabalhos testaram a temperatura ideal para que se proceda à adição do crioprotetor ao sêmen a ser congelado. CUNHA (2002), SILVA et al. (2003) e SILVA (2005) verificaram que a glicerolização a 37 C apresentou-se vantajosa frente a glicerolização pós-equilíbrio, tanto pela maior praticidade quanto pelos resultados obtidos. PEÑA et al. (1998) observaram que a motilidade, vigor e sobrevivência espermática foram superiores quando o crioprotetor foi adicionado à amostra seminal a 37 C, do que quando adicionado a 5 C. Possivelmente, àquela temperatura, ocorreu uma maior penetrabilidade do crioprotetor na célula espermática. 2.4.4 Congelação De acordo com WATSON (1995), cada tipo celular possui uma taxa de congelação ótima para sobreviver à criopreservação. No que se refere ao sêmen canino, existe uma grande variedade de protocolos de congelação e descongelação, sendo a utilização de um determinado protocolo dependente do tipo de envase, diluidor e crioprotetor utilizado (FARSTAD 1996). NIZANSKI e DUBIEL (2003) verificaram melhor motilidade, vigor, integridade acrossomal e longevidade de espermatozóides congelados em palhetas de 0,5mL, quando comparado com minitubos de 0,25 ml ou pellets. De acordo com IVANOVA-KICHEVA et al. (1997), inúmeros experimentos bem sucedidos têm sido desenvolvidos utilizando palhetas de 0,5 ml. O método de congelação mais utilizado consiste na exposição das palhetas ao vapor de nitrogênio, seguindo-se o acondicionamento em botijões criobiológicos. O tempo de

19 exposição e a quantidade de nitrogênio utilizada variam entre pesquisadores (SILVA et al. 2001; PAPA et al. 2003). STRÖM et al. (1997) encontraram melhor motilidade para o sêmen submetido à taxa de congelação moderada. Partindo de 4ºC até alcançar 15ºC, utilizaram uma curva que reduzia a temperatura a uma taxa de 5ºC/min. De 15 a 35 C, a taxa foi elevada para uma velocidade de 20ºC/min e a partir de 65 até 100ºC, a uma taxa que atingiu os 34 C/min, mergulhando posteriormente no N 2 líquido. Uma curva moderada na congelação de sêmen de cães, é obtida através da exposição das palhetas aos vapores de N 2 por 20 minutos, a uma altura de 6 cm. HAY et al. (1997) citam que a congelação espermática com taxas rápidas ou lentas reduz a motilidade espermática e causa um aumento dos danos acrossomais, sugerindo que a curva ideal para a congelação das células espermáticas caninas estaria em torno de 30 C/minuto. No entanto, ROTA et al. (1998) verificaram motilidade espermática superior após a descongelação, quando o sêmen foi congelado rapidamente (3 C/min de 4 C a 6 C; 50 C/min de 6 C a 140 C). 2.4.5 Descongelação De maneira análoga ao processo de congelação, existem vários protocolos, preconizando diferentes temperaturas e velocidades de descongelação para o sêmen canino (SILVA et al. 2001; OLIVEIRA 2003). STRÖM et al. (1997) e ROTA et al. (1998) afirmam que há uma importante relação entre os métodos de descongelação e as várias técnicas de congelação. FARSTAD (1996) relata que a congelação rápida requer uma descongelação igualmente rápida, para reverter o balanço osmótico, reidratar e restaurar a configuração lipídioprotéico da membrana, de maneira similar aos eventos ocorridos durante a congelação. Assim como a congelação, a descongelação causa diversos danos ao espermatozóide. Entre outras injúrias, a recristalização de microcristais de gelo intracelular, que acontece quando a descongelação de uma amostra congelada rapidamente, foi realizada utilizando-se uma

20 curva lenta. Uma situação contrária a esta anteriormente descrita, tende a provocar injúrias osmóticas, devido a alterações severas do volume celular e alterações na estrutura e funções da membrana plasmática (WATSON 1995; HOLT 2000a). PEÑA (2000) verificou que a temperatura de 70ºC por 8 segundos melhorou significativamente a fertilidade do sêmen canino, quando comparada à descongelação a 37ºC por 30 segundos. Corroborando este resultado OLIVEIRA (2003) observou que a descongelação a 75ºC por 7 segundos é mais favorável às células espermáticas do que a 37ºC por um minuto. No entanto, LINDE-FORSBERG et al. (1995), SILVA et al. (2000) e SILVA (2001) alcançaram melhores resultados, quando o sêmen foi descongelado lentamente, a 37 C por um tempo que variou de 15 a 60 segundos. Para a realização de IA, o número de espermatozóides por dose inseminante varia de acordo com diversos autores e protocolos de congelação. SILVA e VERSTEGEN (1995) e ROTA et al. (1999) preconizam a utilização de doses inseminantes com 200x10 6 espermatozóides totais, com no mínimo 50% de espermatozóides viáveis. No entanto CONCANNON e BATTISTA (1989), citam que é aceitável amostras que exibem entre 30 e 50% de espermatozóides móveis. A capacidade fecundante de um ejaculado é dependente de diversos fatores, tais como: fertilidade e variabilidade do ciclo estral da fêmea, método de IA, predição do momento da IA, número de inseminações realizadas e concentração espermática por dose inseminante (EILTS 2005). ROTA et al. (1999) verificaram taxas de prenhez variando de 60% a 100% quando utilizaram a via intra-vaginal ou a via intra-uterina, respectivamente, para a realização das IA com sêmen criopreservado.

21 3 ARTIGO CIENTÍFICO Uso da dimetil-formamida como crioprotetor alternativo para a criopreservação do sêmen canino (Use of dimethyl-formamide to alternative cryoprotectant from canine semen) QUINTELA, A.T. 1 ; GUSMÃO, A.L. 2 ; SILVA,J.C. 3 ; LOPES,M.D 4 ; ALVARENGA,M.A 4. 1 Aluna de pós-graduação (Mestrado em Medicina Veterinária Tropical - Universidade Federal da Bahia); 2 Prof. Dr. da Escola de Medicina Veterinária Universidade Federal da Bahia, Departamento de Patologia e Clínicas; 3 Prof. da Universidade Metropolitana UNIME; 4 Prof. Dr. da Universidade do Estado de São Paulo Campus Botucatu e-mail: quintela_aline@yahoo.com.br RESUMO No presente estudo, foram colhidos 25 ejaculados provenientes de 12 cães, objetivando avaliar o efeito do crioprotetor sobre as células espermáticas desta espécie em diferentes momentos da criopreservação. A segunda fração, ou fração espermática, dos ejaculados foi dividida em duas alíquotas de mesmo volume, sendo o grupo 1 (G1) diluído em meio à base de TRIS-gema contendo 5% de glicerol e o grupo 2 (G2) diluído em meio TRIS-gema contendo 5% de dimetilformamida (G2). Nos dois grupos, procedeu-se a manipulação das amostras de maneira idêntica. Avaliou-se a motilidade total e progressiva, o vigor, a morfologia espermática e acrossomal, a integridade da membrana espermática e a taxa de sobrevivência espermática em diferentes momentos da criopreservação: análise 1 (A1) sêmen in natura, análise 2 (A2) sêmen resfriado com glicerol, análise 3 (A3) sêmen resfriado com DF, análise 4 (A4) sêmen congelado/descongelado com glicerol e análise 5 (A5) sêmen congelado/ descongelado com DF. Diferenças significativas foram observadas na motilidade, motilidade progressiva, vigor, porcentagem de patologias de cauda e porcentagem de espermatozóides reativos ao HO quando se comparou o sêmen in natura com o sêmen resfriado, independentemente do crioprotetor utilizado. Após a

22 criopreservação, observou-se diferença significativa (p<0,001) entre os crioprotetores para a motilidade (G1-36,00% ± 9,57; G2 44,40% ± 10,83), motilidade progressiva (G1 25,20% ± 9,18; G2 34,80% ± 11,94); vigor (G1 2,16 ± 0,47; G2 2,68 ± 0,48) e taxa de sobrevivência espermática ao teste de termorresistência em todos os intervalos de tempo analisados. Estes resultados sugerem que a DF associada ao TRIS-gema pode ser utilizada como crioprotetor na congelação do sêmen canino, oferecendo resultados médios superiores aos obtidos com TRIS-gema associado ao glicerol. PALAVRAS-CHAVE: criopreservação, sêmen, canino, dimetil-formamida, glicerol.

23 SUMMARY In the present study, 25 ejaculates from 12 study dogs, with the aim of evaluated the effect of cryoprotectant in canine spermatozoa at different moments of cryopreservation. The second fraction or rich fraction were further divided into two aliquots with same volumes, the 1 group (G1) was diluted in TRIS-egg yolk with 5% glycerol and two group (G2) was diluted in TRIS-egg yolk with 5% dymetil-formamide (DF). The both groups. Motility, progressive motility, vigor, sperm morphology, acrossomal morphology, sperm membrane integrity and sperm longevity were evaluated in different moments: time 1 (T1) in natura sperm, time 2 (T2) cooled sperm with glycerol, time 3 (T3) cooled sperm with DF, time 4 (T4) frozen/thawed sperm with glycerol and time 5 (T5) frozen / thawed sperm with DF. Significant differences were observed on motility, progressive motility, vigor, caudal abnormalities and reactive cells to Hypo Osmotic Swelling Test (HOST) when compared in natura semen with cooled semen, furthermore of the cryoprotectant. The samples of frozen / thawed semen were significant differences between cryoprotectants in the motility (G1-36,00% ± 9,57; G2 44,40% ± 10,83), progressive motility (G1 25,20% ± 9,18; G2 34,80% ± 11,94); vigor (G1 2,16 ± 0,47; G2 2,68 ± 0,48) and thermoresistense test in all times of evaluation. In conclusion, these results suggest the DF with TRIS-egg yolk can be used to cryoprotect canine sperm cells, with better results when compared to glycerol with TRIS-egg yolk. KEY-WORDS: cryopreservation; canine; semen; dimethyl-formamide, glicerol.

24 INTRODUÇÃO A congelação e o transporte de gametas desempenham um importante papel na transposição de barreiras de espaço e tempo, viabilizando o trânsito de sêmen de machos melhoradores ou mesmo de raças exóticas, reduzindo despesas e riscos, para proprietários e animais. Soma-se a estes fatos, a possibilidade da utilização do cão como modelo experimental para aperfeiçoamento de biotecnologias destinadas à preservação de canídeos silvestres e selvagens (GOODROWE et al. 2000; CUNHA 2002). Sabe-se que quando o sêmen é submetido à refrigeração, a membrana celular sofre algumas mudanças relacionadas à sua estrutura, principalmente aos lipídios e, alterações funcionais que ainda não foram completamente entendidas e são parcialmente irreversíveis, sendo denominadas em conjunto de choque térmico.a adição de meios diluidores e utilização de curvas de refrigeração adequadas, podem reduzir as lesões causadas pelo choque térmico à membrana espermática. O grande desafio atual da biotecnologia da reprodução é obter um diluidor capaz de preservar com qualidade o sêmen, e que seja capaz de manter a proporção de espermatozóides vivos após a congelação e descongelação em níveis aceitáveis (WATSON 2000; FÜRST 2002). O glicerol é o crioprotetor mais amplamente utilizado para congelar sêmen de animais domésticos, contudo, devido aos seus conhecidos efeitos tóxicos e contraceptivos, inúmeros estudos foram desenvolvidos com diferentes crioprotetores. As amidas, entre elas a formamida, acetamida e lactamida, são agentes crioprotetores permeantes que promovem bons resultados na criopreservação de sêmen bovino, eqüino, suíno e de coelhos (FARSTAD 1996; DALIMATA e GRAHAM 1997; SNOECK et al. 2001; ALVARENGA et al. 2002; MEDEIROS et al. 2002; VIDAMENT et al. 2002; OLIVEIRA 2003). A dimetilformamida (DF) foi utilizada por MEDEIROS et al. (2002), em uma concentração a 5%, e obtiveram melhor motilidade, vigor e viabilidade dos espermatozóides eqüinos pós-

25 descongelação, quando comparada ao glicerol na mesma concentração. Corroborando estes resultados, ALVARENGA et al. (2002), alcançaram melhores resultados para sêmen eqüino criopreservado com DF, principalmente para garanhões cujos espermatozóides apresentavam sensibilidade conhecida ao glicerol. A avaliação pós-descongelação de sêmen de camundongos criopreservados com formamidas apresentou valores de motilidade, motilidade progressiva (MP) e integridade de membrana semelhantes aos resultados encontrados quando se utilizou glicerol. Em cães a MP, vigor e os testes de termo - resistência (TTR) sugerem que a DF é um crioprotetor bastante promissor para a espécie, necessitando entretanto de mais estudos para comprovar sua eficácia (OLIVEIRA et al. 2003). O objetivo deste experimento foi estudar e avaliar o efeito dos diluidores TRIS-gema associado a 5% de glicerol ou 5% de DF sobre o sêmen canino em diferentes momentos do processo de criopreservação, avaliando-se a motilidade total, motilidade progressiva, vigor, morfologia espermática, morfologia acrossomal, integridade da membrana plasmática e taxa de sobrevivência espermática.

26 MATERIAL E MÉTODOS Os animais Foram utilizados doze cães clinicamente sadios e sexualmente maduros, com idade compreendida entre dois e sete anos de idade, pertencentes a criadores particulares, sendo 4 labradores retrievers, 4 filas brasileiros e 4 american pit bull terriers. Os cães foram selecionados por suas características seminais. Estes animais eram alimentados com ração comercial duas vezes ao dia com livre acesso à água fresca. Colheita de sêmen Foram colhidos vinte e cinco ejaculados, por meio de massagem peniana em tubos plásticos graduados, estéreis e pré-aquecidos, conectados a um funil. Este conjunto foi mantido a 37ºC num recipiente de isopor. As três frações seminais foram colhidas separadamente e seu volume foi mensurado, embora apenas a fração espermática tenha sido utilizada. O intervalo entre colheitas em cada cão foi de, no mínimo, uma semana. As colheitas foram realizadas sempre pela mesma pessoa no canil onde se encontravam os cães e os ejaculados foram transportados imediatamente ao laboratório, em temperatura ambiente, diluído em meio à base de glicose e leite desnatado, ou na área anexa ao Laboratório do setor de Reprodução Animal da Universidade Federal da Bahia. A fração espermática de cada ejaculado foi analisada individualmente e dividida em duas alíquotas, uma para cada tratamento. Avaliação do sêmen Após a colheita, os ejaculados foram imediatamente levados a banho-maria a 37 C para avaliação. As características macroscópicas (volume, aspecto, cor e odor) e o ph foram

27 avaliados no sêmen não diluído. O volume foi aferido por meio do tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto foram avaliados através de análise subjetiva. O ph foi determinado utilizando-se fitas colorimétricas apropriadas. A motilidade e o vigor espermático foram estimados subjetivamente por exame de uma gota de 10µL colocada sobre uma lâmina pré-aquecida (38-40ºC) e recoberta com lamínula, visualizada em microscopia ótica com aumento de 400 vezes e o resultado expresso em porcentagem (0-100) para motilidade e em uma escala de zero (ausência total de movimento) a cinco (movimento forte e vigoroso) para vigor. A concentração de espermatozóides foi determinada por meio de contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:100 em formol salino e expresso em número de espermatozóides por mililitro (ml). A morfologia espermática foi avaliada por meio da contagem de 200 células em cada lâmina, em microscopia de contraste de fase, sob aumento de 400 vezes. Os resultados foram expressos em porcentagem e registrados individualmente. A avaliação da integridade acrossomal foi realizada por meio de preparação úmida, onde a amostra seminal foi conservada em solução de formol salino tamponado, em microscopia de contraste de fase sob aumento de 1000 vezes, avaliando-se 200 células. As células foram classificadas quanto à integridade ou não do acrossoma. Os resultados foram expressos em porcentagem. A integridade da membrana plasmática foi avaliada por meio do teste hiposmótico (HO), utilizando-se 1,0mL de solução com frutose na osmolaridade de 50mOsm/Kg acrescida de 0,1mL de sêmen. Esta solução foi incubada a 37ºC em banho-maria por 45 minutos, quando foi então realizada a contagem de 200 células em microscopia de contraste de fase em aumento de 200 vezes. Os espermatozóides foram classificados em normais ou anormais de acordo com a presença ou não de cauda enrolada. O resultado foi expresso em porcentagem, após a diferença entre a porcentagem de espermatozóides reativos ao HO e

28 porcentagem de espermatozóides que apresentaram patologias de cauda, durante o exame de morfologia espermática. Tratamentos A fração espermática de vinte e cinco ejaculados, foi dividida em duas partes de mesmo volume e distribuídas em dois tratamentos baseados na utilização de diferentes crioprotetores em diluidor à base de Trishidroximetilaminometano (TRIS). As alíquotas pertencentes ao grupo 1 (G1-Glicerol) foram diluídas, após a centrifugação em diluente TRIS com Glicerol a 5% como crioprotetor. As alíquotas espermáticas destinadas ao grupo 2 (G2-DF) foram diluídas em diluente TRIS cujo crioprotetor foi a DF a 5%. O protocolo de congelação foi exatamente o mesmo para ambos os grupos. Centrifugação, diluição, envase, equilíbrio e congelação Após a avaliação in natura (A1), os ejaculados foram divididos em duas alíquotas e estas foram diluídas na proporção de 1:1 em diluente à base de leite desnatado e glicose (KENNEY et al. 1975) para serem centrifugadas a 800g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido nos diluidores apropriados (G1-TRIS+5%Glicerol; G2- TRIS+5%DF). A concentração espermática foi calculada e as amostras foram rediluídas para alcançarem a concentração final de 80x10 6 espermatozóides/ml. O sêmen foi então envasado em palhetas de 0,5mL e levado à geladeira sob temperatura de 5ºC. O sêmen permaneceu sob esta temperatura por 60 minutos, sendo este período denominado período de equilíbrio (PE). Ao final do PE foi retirada uma palheta de cada grupo experimental, para avaliação de motilidade, vigor, morfologia espermática e integridade da membrana plasmática (A2 sêmen equilibrado com TRIS+5%Glicerol e A3 sêmen equilibrado com TRIS+5%DF).

29 Após o PE as palhetas foram levadas a uma caixa de isopor contendo 5cm de nitrogênio líquido (N 2 ) e mantidas a 6cm deste por 20 minutos, quando foram então mergulhadas em N 2 e raqueadas (PAPA et al. 2003). As palhetas foram mantidas em botijão criogênico por, pelo menos, sete dias. Análise pós-descongelação As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 37ºC por 30 segundos e avaliadas quanto à motilidade, vigor, morfologia espemática, integridade das membranas espermáticas (HO) e longevidade espermática (A4 sêmen congelado/descongelado com TRIS+5%Glicerol e A5 sêmen congelado/descongelado com TRIS+5%DF). A avaliação da longevidade espermática foi realizada por meio do TTR. Uma amostra de 0,2mL de sêmen foi colocada em um frasco eppendorf de 1,0mL e recoberta por uma pequena quantidade de óleo mineral, para evitar evaporação. Estas amostras foram incubadas a 37ºC por duas horas e foram então avaliadas quanto à motilidade e vigor espermáticos a cada 30 minutos (0; 30; 60; 90 e 120 minutos). Procedimentos Estatísticos As variáveis estudadas neste experimento foram: a) motilidade espermática b) motilidade espermática progressiva c) vigor espermático d) porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais e) porcentagem de defeitos de cauda f) porcentagem de defeitos de acrossoma g) porcentagem de defeitos menores h) porcentagem de defeitos maiores i) porcentagem de espermatozóides reagentes ao HO j) taxa de sobrevivência espermática ao TTR.