CENTRO UNIVERSITÁRIO DA GRANDE DOURADOS JAINE PRISCILA SOUSA SANTANA

CENTRO UNIVERSITÁRIO DA GRANDE DOURADOS JAINE PRISCILA SOUSA SANTANA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL CANINA UTILIZANDO SÊMEN FRESCO Dourados 2012

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ii CENTRO UNIVERSITÁRIO DA GRANDE DOURADOS JAINE PRISCILA SOUSA SANTANA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL CANINA UTILIZANDO SÊMEN FRESCO Trabalho apresentado na Disciplina de reprodução animal, Curso de Pós- Graduação em Clínica médica e cirúrgica de pequenos animais Professor(a): Msc. Marlon Ferrari. Dourados 2012

ii 619 S223i Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central - UNIGRAN Santana, Jaine Priscila Sousa Inseminação artificial canina utilizando sêmen fresco / Jaine Priscila Sousa Santana. Brasília : Qualittas, 2012. 33f. : il. Orientador: Prof. Ms. Marlon Ferrari Trabalho de Conclusão do Curso de Pós-Graduação Lato Sensu Clínica Médica e Cirúrgica em Pequenos Animais Qualittas. 1. Medicina Veterinária. 2. Inseminação artificial. 3. Sêmen fresco. I. Título.

iii CENTRO UNIVERSITÁRIO DA GRANDE DOURADOS CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU ESPECIALIZAÇÃO EM CLÍNICA E CIRÚRGICA DE PEQUENOS ANIMAIS JAINE PRISCILA SOUSA SANTANA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL CANINA UTILIZANDO SÊMEN FRESCO Aprovado em: / / Orientador: Prof, Msc Marlon Ferrari Parecerista: Profª Esp; ou Msc. Profª. M.Sc. Rosenilda Conceição Blanco Wilhelm Tenfen Coordenadora de Pós-Graduação Dourados MS 2010

iv DEDICATÓRIA Aos meus pais, Eni e Jaime, pela força e incentivo, ao meu namorado Douglas Rocha, pelo apoio dado a mim para a realização deste trabalho.

v AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, professor Marlon Ferrari, pelos ensinamentos recebidos. Aos professores e organizadores da Qualittas, colegas de curso e todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

vi "Quando o homem aprender a respeitar até o menor ser da criação, seja animal ou vegetal, ninguém precisará ensiná-lo a amar seu semelhante." Albert Schweitzer

vii RESUMO A inseminação artificial na espécie canina é utilizada como alternativa para animais impossibilitados de realizar a monta natural por problemas anatômicos, comportamentais ou animais que estão em localidades diferentes, bem como para prevenção de transmissão de agentes infecciosos, melhoramento animal, preservação do material genético e quando é conduzida corretamente por um profissional, ela poderá trazer várias vantagens, como aumento do número de descendentes de um reprodutor, cruzamentos que modificam características de produção, aceleramento da introdução de novos processos genéticos, aproveitamento do período fértil da fêmea, previsão e controle do momento do parto e redução do índice de doenças sexualmente transmissíveis. Assim, o presente estudo tem por objetivo apresentar os principais aspectos ligados a esta biotécnica. Dentre esses aspectos, pode-se destacar a utilização do sêmen fresco por ter uma facilidade maior na abordagem da técnica, nos procedimentos adotados na coleta, na diluição, e aumento na taxa de gestação. Acompanhamento do ciclo estral na cadela, bem como vias de inseminação artificial. O presente trabalho apresenta uma revisão geral acerca dos principais aspectos ligados à aplicação da IA utilizando sêmen fresco na espécie canina. Palavra-chave: Inseminação artificial, canina e sêmen fresco.

viii SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... ix LISTA DE FIGURAS... x 1. INTRODUÇÃO...01 2. ANATOMIA DO APARELHO REPRODUTOR DO CÃO...03 2.1 Espermatogênese...04 3. SELEÇÃO DOS REPRODUTORES...06 3.1 Coleta e Análise do Sêmen...06 3.2 Diluidores, Protetores e Crioprotetores de Resfriamento...11 4. SÊMEN FRESCO...12 5. ANATOMIA DO APARELHO REPRODUTOR DA CADELA...13 6. MONITORAMENTO DO CICLO ESTRAL...14 6.1 Citologia Vaginal...15 6.2 Dosagem Hormonal...16 6.3 Momento Ideal para Inseminar a Cadela...16 7. VIAS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL...18 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS...20 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...21

ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS IA FSH LH GnRH Ml Ng DMSO OEP MB TRIS SDS IAIV IAIU Inseminação Artificial Hormônio Folículo Estimulante Hormônio Luteinizante Hormônio liberador de Gonadotrofina Mililitros Nanograma Dimetil Sulfóxido Orvus Es Paste Membrana Plasmática Trishidroximetilaminometano Dodecil Sulfato Sódico Inseminação Artificial Intravaginal Inseminação Artificial Intrauterina

x LISTA DE FIGURAS Figura 01- Anatomia do Aparelho Reprodutor do Cão... 04 Figura 02 - Ejaculado Canino...07 Figura 03 - Técnica para Coleta de Sêmen...08 Figura 04 - Citologia Vaginal...16 Figura 05 Cadela com membros posteriores elevados...18

1 1. INTRODUÇÃO Dentro do contexto social, os animais de companhia tornaram se componentes importantes, os quais se encontram mais próximo ao ser humano. Devido a este fato, criadores vêm se esforçando para obter animais de alto valor genético adequados a padrões de cada raça. Assim têm se encontrado soluções nas biotecnologias de reprodução (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A Inseminação artificial (IA) é a técnica singular mais importante desenvolvida para o melhoramento genético dos animais e consiste em, após a obtenção do sêmen, depositá lo no trato genital da fêmea a ser inseminada (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A primeira Inseminação artificial notificada cientificamente foi realizada no século XVIII no ano de 1780 pelo fisiologista Lázzaro Spallanzani, na espécie canina, ele utilizou o sêmen fresco obtido de um cão e depositou-o na vagina de uma cadela no cio com auxílio de uma seringa. Dessa técnica foram obtidos três filhotes vivos e normais (MIES FILHO, 1987). No século XX, ano 1954, foi descrito por Harrop a primeira inseminação artificial utilizando sêmen canino, refrigerado a 4ºC. Após 15 anos, Seager (1969) obteve a primeira gestação canina de sucesso, resultante de uma IA com sêmen congelado, tendo obtido o nascimento de dois filhotes saudáveis. Desde essa época, inúmeros desenvolvimentos nas técnicas e princípios da criobiologia vêm sendo realizados (GONSALVEZ & FIGUEIREDO 2003). Devido ao interesse cada vez maior sobre os animais de companhia, a utilização da IA está aumentando significativamente nos últimos anos. Com a utilização do sêmen canino fresco (in natura), tem se obtido resultados semelhantes ao da monta natural (LINDE FORSBERG & FORSBERG, 1989). A Inseminação artificial utilizando sêmen in natura pode vir a tornar-se uma arma de grande eficácia nas mãos de médicos veterinários e criadores que praticam o melhoramento genético em cães. Essa biotécnica pode ser utilizada como meio alternativo quando há impossibilidade da monta natural, devido a problemas anatômicos e comportamentais (FELDMAN & NELSON, 1996). O desenvolvimento dessa técnica resguarda os animais do estresse causado pelo transporte para fins de acasalamento, previne de eventuais doenças transmitidas durante a cópula, garantindo a preservação do material genético, o que possibilita a manutenção da capacidade

2 fecundante em animais de alto interesse zootécnico por um espaço indeterminado de tempo (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Assim, o presente trabalho tem por objetivo apresentar uma revisão geral acerca dos principais aspectos ligados à aplicação dessa biotécnica. Dentre esses aspectos, pode se destacar a utilização do sêmen in natura, seleção de reprodutores monitoramento do ciclo estral, bem como as vias de inseminação.

3 2. ANATOMIA DO APARELHO REPRODUTOR DO CÃO O trato reprodutivo do cão é composto por uma bolsa escrotal coberta por pêlos, de pele fina e frequentemente pigmentada. A bolsa escrotal exerce o papel fundamental na proteção da termorregulação testicular (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Os testículos são de forma arredondada a oval e estão situados no interior da bolsa escrotal. A estrutura testicular apresenta os túbulos seminíferos, de onde se originam os espermatozóides. O testículo atua na produção de hormônios masculinos, produção e maturação dos espermatozóides (SORRIBAS, 2006). Os espermatozóides são sintetizados nos testículos. Esta síntese tem uma duração aproximada de dois meses nos cães. Posteriormente os espermatozóides sofrem uma maturação em um ducto que esta situado ao longo de cada testículo: o epidídimo (FONTBONNE, 2006). O epidídimo é um tubo longo enrolado entre si que armazena e transporta os espermatozóides, no momento da ejaculação os espermatozóides oriundos do epidídimo são misturados com secreção da próstata, que serve para diluir e carregar o sêmen. É fácil compreender que qualquer afecção deste órgão pode ter repercussão na fertilidade dos animais (FONTBONNE, 2006). O epidídimo é um órgão composto por três partes: cabeça, corpo e cauda. A cauda do epidídimo se transforma gradualmente em ducto deferente, este ducto conduz os espermatozóides do epidídimo à uretra, seguindo cranialmente e adentrando no abdômen, passando pelo ureter e desembocando na uretra, próstata cranial (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A próstata circunda o colo da bexiga e o ínicio da uretra, seu tamanho varia de acordo com a raça. É um órgão achatado dorsalmente e arredondado central e lateralmente (SORRIBAS, 2006). É a única glândula sexual acessória do cão. Sua principal função é ser responsável pela produção de líquido prostático sob a influência da testosterona, que é uma secreção clara, expelida na uretra, consistindo na primeira e terceira fração do ejaculado (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A uretra origina-se no trígono da bexiga e caminha caudalmente no assoalho da pelve através da próstata, dividindo-se em uretra pélvica, na pelve e esponjosa, no pênis. Tem a função de carrear urina e sêmen à extremidade do pênis (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O pênis por sua vez é o órgão da cópula, sendo caracterizado pela presença de um osso peniano que ajuda a manter a rigidez na hora da cópula (Figura 01). O osso

4 peniano situa-se desde o bulbo da glande até quase toda extremidade da glande. A glande inicia-se na região aderida internamente ao prepúcio e é composta pelo bulbo da glande, consistindo em um tecido erétil que envolve completamente o pênis. O bulbo é dificilmente discernível no estado relaxado. Quando o pênis fica ereto, o bulbo cavernoso torna-se uma estrutura espessa, responsável de travar o pênis dentro da vagina da cadela durante a cópula. No estado de flacidez, o pênis encontra-se totalmente dentro do prepúcio (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O prepúcio forma uma bainha que recobre completamente o pênis não ereto. Externamente é revestido pela pele e internamente por uma mucosa lisa. Tem a função de cobrir e proteger o pênis (SORRIBAS, 2006). Figura 01: Aparelho reprodutor do cão. Fonte: FONTEBONNE, 2006. 2.1 Espermatogênese A espermatogênese, ou seja, a produção de espermatozóides, esta sob o controle do hormônio Folículo Estimulante (FSH) e do hormônio Luteinizante (LH). A regulação desses é, por sua vez, controlada pelos esteróides gonadais peptídeos como a inibina e, finalmente pelo hormônio liberador de gonadotrofina GNRH. A produção de espermatozóides e de andrógenos estão intimamente ligadas (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O sistema reprodutor do macho é dependente de hormônios para regular sua função. A hipófise produz as gonadotropinas hormônio folículo-estimulante (FSH) e hormônio luteinizante (LH) sob o controle do hipotálamo. O FSH é requerido para a

5 espermatogênese, e o LH estimula a produção de andrógenos testiculares pela célula de Leydig. O processo da espermatogênese é dependente da testosterona testicular para se manter, e os órgãos sexuais são ligados ao andrógeno para desenvolver suas atividades fisiológicas (Zirkin, 1995). A secreção de LH é regulada pelo mecanismo de feedback em função da concentração plasmática de testosterona circulante, que controla a secreção endócrina da hipófise e do hipotálamo. A secreção de FSH é regulada pela testosterona plasmática e também pela inibina, um hormônio peptídico produzido pelas células de Sertoli. Esta alça endócrina é conhecida como eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular. Além do controle hormonal, os órgãos reprodutivos são também sujeitos ao controle nervoso simpático e parassimpático. Isto é particularmente verdade para a função erétil do pênis, que está sob o controle parassimpático, e para a ejaculação, que está sob o controle simpático (Zirkin, 1995). A espermatogênese é um processo seqüencial de proliferação, divisão e transformação celular, onde as células primordiais dão origem aos espermatozóides. Esse processo é desencadeado nos túbulos seminíferos a partir do início da puberdade do macho (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Segundo Allen (1992), a espermatogênese inicia-se aos 4 meses de idade na espécie canina, embora ejaculados contendo espermatozóides só sejam verificados a partir dos 10 12 meses de idade.

6 3. SELEÇÃO DE REPRODUTORES A seleção de cães reprodutores deve ser feita de forma detalhada. A alimentação balanceada tem-se mostrado uma grande aliada no desenvolvimento sexual dos cães, em todos os animais domésticos as deficiências de nutrientes, como as proteínas, podem provocar infertilidade, no entanto uma alimentação excessiva e mal balanceada torna os reprodutores obesos e preguiçosos (SORRIBAS, 2006). Deve ser feita a anamnese do animal, verificando-se através desta o desempenho reprodutivo anterior do macho e problemas de saúde atuais ou prévios. Deve ainda ser procedido um cuidadoso exame clínico geral e andrológico, que deve incluir a inspeção e palpação dos órgãos reprodutivos, observando principalmente o tamanho e a consistência testicular, visto que cães com espermatogênese anormal frequentemente têm testículos de consistência inferior à normal. Assim, procede-se a coleta, avaliação do sêmen e inspeção do comportamento de monta (libido), podendo ter continuidade com testes hormonais e análises cromossômicas. O sêmen deve ser coletado e analisado em um laboratório, para que se avalie a viabilidade do sêmen para a inseminação artificial (GONÇALVES & FIGUEIREDO,2003). 3.1 Coleta e análise do sêmen A coleta e a análise do sêmen são de extrema importância para a realização da IA, uma escolha errada do método de coleta pode prejudicar a qualidade do sêmen, alterando os resultados esperados (GONÇALVES & FIGUEIREDO, 2003). Os cães possuem relativamente baixa produção de espermatozóides quando comparados a animais de outras espécies (AMANN, 1981). Quando os cães ejaculam diariamente, sua produção espermática vai decrescendo. Portanto, recomenda-se a freqüência de apenas 1 a 2 coletas semanais, com intervalo de 4 a 5 dias (GONÇALVES & FIGUEIREDO, 2003). O ejaculado canino é naturalmente dividido em três frações distintas como mostra a figura 02 (SORRIBAS, 2006). A primeira fração ou pré-espermática consiste em um fluido claro originado na próstata, sendo responsável pela limpeza e estabilização do ph no canal uretral (GONÇALVES & FIGUEIREDO, 2003). A segunda fração ou espermática, rica em espermatozóides, é de origem testicular e apresenta volume variável conforme o tamanho testicular, além da variação individual, possuindo aspecto turvo, leitoso e opalescente (GONSALVES & FIGUEIREDO,

7 2003). A terceira fração é um fluido prostático que deve ser claro e facilmente distinguível da fração espermática. Apresenta um grande volume e serve como meio diluidor natural proporcionando o transporte dos espermatozóides no trato genital da cadela (ENGLAND, 1992). Figura 02- Ejaculado canino, (1) fração pré-espermática, (2) espermática e (3) prostática. Fonte: SORRIBAS, 2006. O sêmen é facilmente coletado de cães, em especial daqueles com experiência de acasalamento. A presença de uma cadela em estro pode melhorar a qualidade do ejaculado, particularmente no caso de cães inexperientes ou tímidos. Pode-se ainda congelar algodões impregnados de secreções vaginais de cadelas em estro ou impregnados ainda com feromônio sintético metil-p-benzoato, que podem ser passados na região perianal de uma cadela no momento da coleta de sêmen. Assim, o cão irá reagir como se estivesse diante de uma cadela em cio. O local da coleta deve ser tranqüilo e livre de distrações, com piso seguro para os animais (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Existem diversos métodos de coleta de sêmen em cães. A técnica de coleta deve ser escolhida de acordo com a habilidade do profissional, materiais disponíveis e características do macho (SORRIBAS, 2006). Métodos como massagem digital, uso de vagina artificial, coleta da cauda na epidídimo, vibrador elétrico e eletro ejaculação foram reportados (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O uso de vagina artificial e eletro ejaculação, são métodos menos utilizados por necessitarem de mais equipamentos e por apresentarem piores resultados quanto a motilidade espermática. A vagina artificial é feita de látex, acoplada a um tubo que se

8 simula a penetração do pênis do cão na vagina da cadela, sendo que deve ser lavada cuidadosamente entre a coleta de um animal e outro, para evitar contaminação, esses métodos dificultam ainda a separação das frações do sêmen (SORRIBAS, 2006). Boucher et al (1958) relatou que a manipulação digital é superior à vagina artificial, e que esse método mostrou-se especialmente confiável mesmo para cães não condicionados. A exposição do sêmen às luvas de látex ou vinil causa um imediato decréscimo na motilidade espermática, devendo-se evitar qualquer contato durante a manipulação para a coleta do sêmen do cão (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A técnica de manipulação digital consiste em massagear o prepúcio do cão na altura do bulbo cavernoso (figura 03). A ereção tem lugar com a protusão do pênis. O prepúcio é então retraído para trás do bulbo, com uma ação escorregadia da mão de quem está coletando. O pênis é apertado com moderada pressão entre o dedo indicador e o polegar, posteriormente ao bulbo (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Os movimentos pélvicos de monta são coincidentes com a ejaculação da fração préespermática e persistem por cerca de 1 a 2 minutos. O cão se torna imóvel enquanto a fração espermática é ejaculada pelos próximos 30 a 60 segundos. A última fração tem duração entre 10 e 45 minutos, é quando o cão gira a perna durante a ejaculação(gonsalves & FIGUEIREDO, 2003). Figura 03- (A) Pênis no início da ereção, o prepúcio é retraído para trás do bulbo; (B e C) o pênis está totalmente ereto, pressão feita com a mão, simulando a vagina da cadela; (D) o cão passa a pata traseira, sobre o braço do operador, fazendo com que ocorra a terceira fração finalizando a coleta. Fonte: SORRIBAS, 2006 Fonte: SORRIBAS, 2006.

9 O ejaculado é colhido com o auxilio de um funil de vidro ou plástico que desemboca em tubos graduados, devendo-se evitar contato direto entre o pênis do cão e o material da coleta, o qual deve ser mantido a aproximadamente 38ºC (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Em 1993, Oettlé demonstrou que a morfologia espermática normal em cães estaria melhor correlacionada com a fertilidade após IA, do que a simples observação da motilidade espermática, sendo que haveria um decréscimo nessa fertilidade caso fossem utilizadas amostras de sêmen apresentando morfologia espermática normal inferior a 60%. Diversos outros métodos foram descritos para a avaliação da qualidade seminal. Dentre estes, podem ser destacados o teste de termo-resistência (STRÖM et al., 1997), o teste hipo-osmótico (ENGLAND e PLUMMER, 1993), o teste de capacitação e reação acrossômica in vitro (HEWITT e ENGLAND, 1998), a análise ultra-estrutural (RODRIGUES-MARTINEZ et al., 1993) e os testes de incubação com oócitos homólogos ou heterólogos (MAYENCO-AGUIRRE e PEREZ-CORTÉZ, 1998; METCALF, 1999; LARSSON E RODRIGUES-MARTINEZ, 2000; MASTRO- MONACO et al., 2002). A análise do sêmen é mais utilizada para avaliar a qualidade espermática canina e é realizada através da avaliação da fração espermática do ejaculado. O sêmen deve ser avaliado em suas características macroscópicas e microscópicas (SORRIBAS, 2006). A avaliação macroscópica inclui a observação do volume, da coloração e da viscosidade do ejaculado. O volume pode variar de acordo com a raça, idade, clima e freqüências de coletas, a avaliação do volume é importante para se fazer o cálculo do número total de espermatozóides no ejaculado. A coloração varia do translúcido ao branco opalescente, sendo que pode variar de acordo com a concentração espermática (SORRIBAS, 2006). A observação da cor do ejaculado é muito importante, já que pode permitir o diagnóstico inicial de algumas patologias do aparelho reprodutor, visto que a presença de urina, de pus ou sangue, dificulta a visualização dos espermatozóides e compromete a viabilidade do ejaculado (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Nas características microscópicas inclui a avaliação do ph, concentração, motilidade, vigor e morfologia espermática. O ph normal do sêmen canino varia de 6,3 a 6,7. A concentração espermática corresponde ao número de espermatozóides por

10 mililitro de ejaculado, onde a concentração normal é de no mínimo 200 milhões de espermatozóides por mililitro, pode se determinar a concentração através de diversos métodos, desde que sejam baseados nos princípios da contagem celular através da câmara de Neubauer (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A motilidade, que é a porcentagem de espermatozóides móveis na amostra, e o vigor que é a qualidade da motilidade exibida pelos espermatozóides móveis, devem ser avaliados logo após a coleta, com auxilio da microscopia óptica. Uma gota de sêmen deve ser colocada sobre a lâmina aquecida e levada até o microscópio óptico para ser microscopicamente examinada. Uma amostra normal de sêmen deve exibir uma motilidade mínima de 70% (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Embora a relação entre a motilidade e a capacidade fecundante do espermatozóide canino não esteja totalmente elucidada, a maioria dos pesquisadores ainda utiliza a motilidade como o principal parâmetro para a avaliação do sêmen canino (IVANOVA-KICHEVA et al., 1997). PLATZ e SEAGER (1977) sugerem uma avaliação do vigor espermático, que é a qualidade da motilidade exibida pelos espermatozóides móveis, observada em escala, onde: 0: Todos os espermatozóides encontrados estão sem movimento; 1: Movimentos lentos, sem progressão; 2: Rápidos movimentos látero-laterais, sem progressão; 3: Rápidos movimentos látero-laterais, com ocasional progressão; 4: Lentos movimentos e continua progressão; 5: Rápidos movimentos e continua progressão Na morfologia se analisa as alterações estruturais dos espermatozóides. O espermatozóide quando com sua morfologia normal, é altamente especializado a cumprir com seu objetivo, fecundar o óvulo (HAFEZ et al, 1995). As alterações morfológicas localizam-se com maior frequência na cabeça e na cauda do espermatozóide e podem ser classificadas como primárias, quando as alterações são oriundas de problemas na espermatogênese, ou secundárias, quando se originam durante o processo de maturação espermática, ou no decorrer dos problemas de manipulação do sêmen. Para a avaliação da morfologia, faz-se um esfregaço do sêmen, podendo ser empregados diversos corantes, sendo mais comum o uso da eosina e a nigrosina. (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003).

11 3.2 Diluidores, protetores e crioprotetores de resfriamento A adição de diluidores como o Tris (UCHOA et al., 2001), água de coco (PEREIRA et al., 2001), solução salina fisiológica (Silva et al., 2002) e o leite desnatado (BETINI et al., 2001), ajudam a aumentar o volume do ejaculado, os protetores de resfriamento, como a gema de ovo, e de crioprotetores, como o glicerol ou dimetil sulfóxido (DMSO), açúcares como a lactose ou sacarose, polímeros macromoleculares ou detergentes como o polivinil pirrolidona, Orvus ES-Paste (OEP), são necessários para proteção dos espermatozóides durante o resfriamento, congelamento e descongelamento (GONSALVEZ & FIGUEIREDO, 2003). As técnicas de preservação de sêmen em baixas temperaturas causam diminuição da fertilidade, devido principalmente as lesões estruturais e funcionais dos espermatozóides advindas do estresse térmico (MORTON & BRUCE, 1989). O termo estresse térmico ou choque térmico define um conjunto de alterações ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos quando resfriados rapidamente da temperatura corpórea até temperaturas a 5ºC, que tem como conseqüência o decréscimo irreversível da motilidade espermática, mudanças na bioquímica e no funcionamento das células espermáticas. Para o congelamento do sêmen são utilizados crioprotetores com intuito de proteger os espermatozóides de todos os efeitos críticos do processo de congelação (JASCO, 1994).

12 4. SÊMEN FRESCO A inseminação artificial utilizando sêmen fresco é a mais utilizada além de ser muito simples. Esta técnica é a que oferece as melhores taxas de concepção similares às obtidas com a monta natural (PEREIRA et al., 2001). Se o sêmen não sofrer danos durante o processo e se o momento e o local forem apropriados a taxa de prenhez poderá chegar de 85% a 90% (FERNANDES, 2006). Porém, é a que apresenta menor flexibilidade quanto à sua utilização, devendo o sêmen ser utilizado em um curto período após sua coleta, pois ao longo do tempo os espermatozóides morrem, por esgotamento de nutrientes que lhes fornecem energia (SORRIBAS, 2006). Este tipo de sêmen pode ser utilizado em diferentes vias de inseminação, sendo a principal a intravaginal, nessa técnica podemos adicionar um meio denominado de diluente, geralmente realizada adicionando-se o líquido prostático autólogo até ser atingido o volume mínimo desejado (NOTHLING e VOLKMANN, 1993; UCHOA et al., 2001). Entretanto, pode-se também fazer uso de diluidores, como água de coco, tris e solução salina fisiológica (SILVA et al., 2002).

13 5. ANATOMIA DO APARELHO REPRODUTOR DA CADELA O trato reprodutor da cadela é composto por dois ovários, um direito e outro esquerdo, possuem uma forma oval e são achatados, é circundado pela bolsa ovariana, proveniente do peritônio. Localizam-se a 1ou 2 cm do pólo caudal do rim e apostamente à terceira ou quarta vértebra lombar. Seu tamanho varia de acordo com a raça, e o aspecto de sua superfície muda segundo o estado do ciclo estral. Os ovários encontram-se unidos ao útero pelo ligamento próprio do ovário, é responsável pela produção de óvulos e secreção de hormônios femininos, estrógeno e progesterona (SORRIBAS, 2006). As trompas uterinas percorrem pela parede da bolsa, é tortuosa e tem a função de transportar os óvulos até os cornos uterinos. O útero é um órgão tubular que se divide em dois cornos, corpo e colo. Os cornos são longos e localizam-se junto à parede abdominal, são neles que os fetos são alojados durante a gestação (SORRIBAS, 2006). Os cornos divergem do corpo na forma de um V no sentido de cada rim (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Os ligamentos largos intercornual une ambos os cornos próximo ao corpo do útero. O corpo do útero é curto e limitado cranialmente pela bifurcação dos cornos e caudalmente pela cérvix (SORRIBAS, 2006). A vagina é o órgão copulatório feminino, está situada na cavidade pélvica entre o reto dorsalmente, a bexiga e a uretra ventralmente. A vagina é relativamente longa, mas o seu comprimento varia de acordo com a raça (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A vulva é o orifício urogenital externo da cadela, possui dois lábios que se fundem acima e abaixo da fenda vulvar, constituindo as comissuras dorsal e ventral da vulva (SORRIBAS, 2006). O clitóris é homólogo ao pênis na fêmea, localiza-se no assoalho do vestíbulo vaginal, próximo à vulva, e possui um corpo curto e uma glande, o seu tamanho pode variar de acordo com a raça. Exerce função na estimulação sexual (SORRIBAS, 2006).

14 6. MONITORAMENTO DO CICLO ESTRAL NA CADELA A cadela é uma espécie monoéstrica estacional, possuindo uma fase folicular, também denominada de progesterônica. A fase estrogênica dura em torno de 2 a 3 meses (BELL & CHRISTIE, 1971). O intervalo entre dois estros pode variar de 5 a 12 meses (CANCANNON et al, 1989). O ciclo estral é dividido em quatro fases: proestro, estro (corresponde à fase folicular), diestro (corresponde a fase progesterônica) e anestro (fase de repouso sexual). A cadela é a única espécie de mamífero doméstico que passa obrigatoriamente por todas as fases do ciclo (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O proestro caracteriza-se por um rápido desenvolvimento dos folículos, um aumento seguido de um pico de estrógenos, o surgimento do LH e início do aumento da secreção de progesterona, fato esse observado exclusivamente nos canídeos que apresentam uma luteinização precoce das células da teca, antecedendo a ovulação (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). As principais características clínicas e comportamentais observadas nesta fase são o aumento do tamanho da vulva, a presença de descargas sero-sanguinolentas e a atração do macho, no entanto a cadela não é receptiva, a duração do proestro é de 7 a 10 dias. (SORRIBAS, 2006). No exame citológico, o esfregaço vaginal mostra uma grande quantidade de células sanguíneas, numerosas células parabasais e algumas células intermediárias, no início do proestro. Por volta da metade desta fase, os neutrófilos desaparecem e começam a surgir às células superficiais. No final do proestro, a presença de células sanguíneas é variável, a maioria das células se tornam superficiais, exibindo núcleo vesiculado (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O estro, por sua vez, apresenta o pico de LH, ovulação, redução na produção de estrógenos, desenvolvimento do corpo lúteo e aumento da secreção de progesterona (CONCANNON, 1986). As características clínicas e comportamentais desta fase é a vulva aumentada e macia, diminuição das descargas hemorrágicas vaginais, atração pelos machos e aceitação da cópula. A duração desta fase é de 5 a 10 dias (SORRIBAS, 2006). Citologicamente, as células superficiais são predominantes no esfregaço, representando um total de 80 a 100% das células visualizadas, as células sanguíneas podem estar ausentes ou presentes (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003).

15 O diestro corresponde à fase de atividade do corpo lúteo. As cadelas nesta fase apresentam mucosa vaginal pálida, sem secreções e não atrai o macho. Esta fase termina com a parturição entre 70 a 120 dias após o pico de LH, pela regressão progressiva do corpo lúteo na cadela não gestante (CONCANNON, 1980). O diestro tem duração aproximada de 60 a 90 dias. No final do estro, o esfregaço vaginal apresenta um número de células superficiais reduzidas, e uma maioria de células parabasais e intermediárias caracterizando o diestro (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O anestro é um período que compreende o final da fase luteal e o início da fase folicular. Clinicamente, é um período de inatividade reprodutiva. Durante esta fase, o útero atinge sua involução completa, havendo um reparo endométrial. A duração do anestro é em média de 4 a 5 meses, pode variar de acordo com a raça, idade, estado sanitário e diversos outros fatores (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). 6.1. Citologia vaginal A citologia vaginal é um método bastante utilizado no acompanhamento do ciclo estral da cadela, este é bastante útil no caso de cadelas com ou sem desvio de comportamento sexual (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). O método de escolha da coleta é com o swab vaginal, onde o mesmo deve ser introduzido na comissura dorsal da vagina da cadela figura 04, deslizando sobre a mucosa, após o material ser coletado, o swab é rotacionado sobre a lâmina de vidro limpa, com sentido único, e faz-se a fixação e coloração do material (SORRIBAS, 2006). No esfregaço vaginal são encontrados células, como as basais, parabasais, células de defesa, intermediárias, superficiais, eritrócitos, e os neutrófilos que fornecem informações necessárias para o momento ideal para se inseminar (SORRIBAS, 2006). No entanto, uma limitação da citologia vaginal é que esse método não permite determinar o dia exato da ovulação (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003).

16 Figura 04 - método de coleta para citologia vaginal, utilizando swab de algodão para coleta do material. Fonte: SORRIBAS, 2006 6.2. Dosagem hormonal Para determinar o momento ideal se faz a dosagem de progesterona sérica (SORRIBAS, 2006). Nas cadelas, os ovários começam a produzir progesterona no pico de LH, isto é, 48 horas antes de ocorrer a ovulação. O teor no sangue de progesterona (progesteronemia), que era basal no proestro, torna se assim detectada antes da ovulação (FONTBONNE, 2006). O nível de progesterona no momento da ovulação situa-se entre 4 e 9 ng/ml, dependendo da cadela e do laboratório (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Na prática para se beneficiar das vantagens dessa técnica, é conveniente realizar as dosagens logo no início do ciclo estral, a partir do momento em que as outras técnicas como as observações dos esfregaços vaginais e do comportamento da cadela demonstram que o período ótimo está próximo, e repeti-las a cada dois ou três dias. Normalmente de 2 a 5 dosagens são o suficiente para uma monitorização normal (FONTBONNE, 2006). 6.3 Momento ideal para inseminar a cadela Vários métodos e exames foram citados para identificação do momento ideal para inseminar uma cadela, geralmente a IA deve ser realizada quando a fêmea esta receptiva ao macho e apresenta uma citologia com pelo menos 70% de células superficiais (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003).

17 Na dosagem hormonal, a progesterona deverá está em torno de 7,5 ng/ml, que corresponde a aproximadamente 2 dias após a ovulação (CONCANNON et al, 1989). Após a maturação, os óvulos tem uma média de vida curta. Segundo a FONTBONNE, 2006, a maioria das cadelas permanecem férteis, por cerca de 48 horas, é um período muito curto durante o cio. Resumindo, o período ótimo de fertilidade nas cadelas situa-se entre 2 e 4 dias após o pico de LH, fase em que o óvulo entra em maturação, este é o momento ideal para fazer a inseminação artificial.

18 7. VIAS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL Para a realização da inseminação artificial na cadela, já foram descritas diversas técnicas. A Inseminação artificial intravaginal (IAIV) consiste na deposição do sêmen na vagina da cadela e apresenta-se como a via de escolha na maioria dos casos, por ser de fácil execução e por oferecer bons resultados de um modo geral (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Para a IAIV utiliza-se uma sonda rígida, com a deposição do sêmen ao longo da vagina da cadela ou a sonda de Osíris, que é uma sonda flexível provida de um pequeno balão inflável na sua extremidade cranial, imitando o papel do bulbo cavernoso do pênis do cão, a qual faz a deposição do sêmen diretamente na porção cranial da vagina. Com ambas as sondas, faz-se necessária a manutenção da fêmea com os seus membros posteriores elevados figura 05 durante cerca de 5 a 15 minutos, visando prevenir o refluxo do sêmen (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Figura 05 - Cadela com os membros posteriores elevados, após ter sido inseminada. Fonte: SANTANA, 2007. A técnica de IA intrauterina (IAIU) consiste na deposição do sêmen dentro do útero da cadela por via transcervical, utilizando-se um catéter norueguês, endoscópio com fibra ótica ou por via intra-uterina realizada por laparotomia. A IAIU via cirúrgica têm o conveniente de ser um procedimento cirúrgico, sendo necessários todos os cuidados clássicos no pré-, trans- e pós-operatório (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). Segundo Johnston et al (2001), a IAIU pode ser utilizada como

19 alternativa para melhorar as taxas de fertilidade de machos oligospérmicos, ou seja, com um baixo número de espermatozóides no ejaculado. Vários trabalhos têm sido realizados com o intuito de se desenvolver técnicas para a IAIU, na qual a deposição de sêmen é realizada diretamente dentro do útero da fêmea por via transcervical ou através de procedimentos cirúrgicos trans-abdominais como a laparotomia e laparoscopia (GONSALVES & FIGUEIREDO, 2003). A via transcervical é uma técnica difícil de ser executada devido a anatomia particular da cérvix e a presença da prega médio-dorsal da vagina da cadela, requerendo muita prática do inseminador, bem como colaboração por parte da cadela (SILVA, 1995). A IAIU por laparotomia foi desenvolvida no intuito de transpor as dificuldades do cateterismo cervical. No entanto, essa técnica comporta uma intervenção cirúrgica com todos os riscos implícitos. Além disso, uma anestesia profunda poderia interferir na motilidade uterina e na migração oocitária (TSUTSUI et al, 1989). A IAIU por laparoscopia, apesar de ser considerada uma técnica semicirúrgica, tem caráter pouco invasivo e é de rápida execução, uma vez que o sêmen pode ser depositado em apenas um corno uterino, haja vista que os espermatozóides rapidamente migram para o outro corno (TSUTSUI et al, 1989). Os resultados obtidos após a IAIU por laparoscopia, têm sido satisfatórios (SILVA, 1995).

20 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS A inseminação artificial na espécie canina é uma técnica que está tornando uma grande arma tecnológica nas mãos dos médicos veterinários e criadores, já que é uma forma de preservar o material genético e ainda um método alternativo em casos onde não se pode ocorrer a monta natural, com a utilização do sêmen fresco na IA, são evitados o estresse dos animais e custos elevados com banco de sêmen. Deve se fazer exames clínicos e laboratoriais, para atestar a saúde dos animais e identificar o momento ideal para inseminar a fêmea e a viabilidade do sêmen do machos. A coleta deve ser realizada por um profissional treinado, os equipamentos utilizados na coleta devem estar devidamente apropriados para coleta, pois uma má manipulação do ejaculado diminui a eficiência do mesmo. Muitos estudos devem ser realizados para aprimorar as técnicas de coleta e conservação e da inseminação artificial, contribuindo assim para um melhor desempenho reprodutivo em cães. Baseando-se nos estudos realizados para confecção deste, conclui-se que a inseminação artificial canina utilizando sêmen fresco é satisfatória para que se tenha um melhoramento genético canino, com menos estresse para os reprodutores, maiores taxas de gestação, redução do índice de doenças sexualmente transmissíveis, facilidade na execução da técnica e um excelente custo benefício por parte dos criadores.

21 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALLEN, W. E. Reproductive Physiology of the dog. In: Fertility and Obstetrics in the Dog. Blackmell Scientific Publications. Oxford, 1992. AMANN, R. P. Critical review of methods for evaluation of spermatogenesis from seminal characteristics. Journal of Andrology, V.2, 1981. BELL, E. T.; CHRISTIE, D. W. Duration of proestrus, oestrus, and vulval bleeding in the Beagle bitch. Brazilian Veterinary Journal, v.127, 1971. Betini, C.M., Moraes, G.V., Rigolon, L.P. (2001). Inseminação artificial de cadelas com sêmen fresco diluído em meios formulados com água de coco e leite em pó desnatado. Revista Brasileira de Reprodução Animal, 25 (3), 373-375. BICUDO, S.D.; PAPA, F.O.; TAVARES, C.V.N.; et al. Glicina-Gema: proposta de um novo diluidor para congelação de sêmen bovino. Simpósio Internacional de Reprodução Animal, Portugal. Anais. Portugal, 1993. BOUCHER, J.; FOOTE, R. H.; KIRK, R. W. The evaluation of semen quality in the dog and the effects of frequency of ejaculation upon semen quality, libido and depletion of sperm reserves. Cornell Veterinary, v.48, 1958. BUENO, R.; COSTA E.P.; GUIMARÃES J.D.; VALENTIM F.M. Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães. Universidade Católica de Minas Gerais, Betim MG, 2001. CHRISTIANSEN, I. J. Reprodução no cão e no gato. São Paulo: Manole, 1988. CONCANNON, P. W. Effects of Hypophysenctomy and of LH administration on luteal phase plasma progesterone levels in the Beagle birtch. Journal of Reproduction and Fertility, v.58, 1980.

22 CONCANNON, P. W.; DIGREGORIO, G. B. Canine vaginal cytology. In: BURKE, T. J. Small Animal Reproduction and Infertility: A Clinical Approach to Diagnosis and Treatment, Philadelphia: Lea & Febiger, 1986. CONCANNON, P. W.; McCANN, J. P.; TEMPLE, M. Biology and endocrinology of ovulation, pregnancy and parturition in the dog. Journal of Reproduction and Fertility, v. 39, 1989. CUNHA, I. C. N. Estudo da viabilidade do processo de refrigeração do sêmen canino utilizando-se diluidores à base de leite e glicinagema. Dissertação (Mestrado em Reprodução Animal) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista. Botucatu, 1997. 124p. ENGLAND, G.C.W. The criopreservation of dog semen. Thesis sumitted for Felloship of royal College of Veterinary Surgeons, London, 1992. ENGLAND, G.C.W. Cryopreservation of dog semen: a review. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47, 1993. England, G.C.W. (1999). Semen quality in dogs and the influence of a short-interval second ejaculation. Theriogenology, 52, 981-986. FARSTAD, W. Semen criopreservation in dogs and foxes. Sci., 1996. 251p. FERNANDES, W. R Medicina interna de pequenos animais; 3 edição; 2006; Elsevier, Rio de Janeiro. p. 909. FELDMAN, E.C.; NELSON, R.W. Canine and feline endocrinology and reproduction. Philadelphia: W.B. Saunders, 1996. 487p. FONTBONNE, A.; BADINAND, F. Canine artificial insemination with frozen semen: comparison of intravaginal and intrauterine deposition of semen. Suppl, 2003. 325p.

23 FONTBONNE, A,; VERSTEGEN, J. Manual do criador Reprodução canina. Royal Canin, Paris França, 2006. GONSALVES, O. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; V. J. F. Biotécnicas aplicadas a reprodução animal. São Paulo: Varela, 2003. 340p. HAFEZ, E. S. E.; HAFEZ, B. Reprodução animal. 7º ed. São Paulo: Monde 2004. 513p. HARROP, A. E. Artificial Insemination in dogs. Br. Vet. J., 1954. 338p. HOLT, W. V. Membrana heterogeneity in mammalian spermatozoon. Int. Rev. Cytol., 1984. IVANOVA-KICHEVA, M.G., BOBADOV, N.D., SOMLEV, B. (1997). Cryopreservation of canine semen in pellets and in 5-mL aluminum tubes using three extenders. Theriogenology, 48, 1343-1349. JASKO, D. J. Procedures for cooling and freezing of equine semen. Ars Vet., 1994. 156p. JOHNSTON, S. D.; KAMOLPATANA, K.; ROOT- KUSTRITZ, M. V.; JOHNSTON, G. R. Prostatic disorders in the dog. Anim. Reprod. Sci. 2000. 405p. JOHNSTON, S. D.; KUSTRITZ, M. R. V.; OLSON, P. N. S. Canine and feline theriogenology. Philadelphia: Saunders, 2001. 592p. LARSSON, B., RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H. (2000). Can we use in vitro fertilization to predict semen fertility? Animal Reproduction Sience, 60-61, 327-336. LEÃO, K. M. Técnicas de Inseminação Artificial. Tese de Doutorado Faculdade de Zootecnia e Medicina Veterinária de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, São Paulo, 2003.

24 LINDE-FORSBERG, C.; FORSBERG, M. Fertility in dogs in relation to semen quality and the time and site of insemination with fresh and frozen semen. Reprod. Fertil, v.39, 1989. LINDE-FORSBERG, C.; STROM HOLST, B.; GOVETTE, G. Comparison of fertility data from vaginal vs intrauterine insemination of frozenthawed dog semen: a retrospective study. Theriogenology. 1999. 23p. MASTROMONACO, G.F., HAY, M.A., GOODROWE, K.L. (2002). The effect of oocyte storage and Cummulus cell presence on canine zone penetration by domestic dog spermatozoa. Theriogenology, 57, 1123-1134. MAYENCO-AGUIRRE, A.M., PÉREZ-CORTÉS, A.B. (1998). Preliminary results of hemizona assay (HZA) as a fertility test for canine spermatozoa. Theriogenology, 50 (2), 195-204. METCALF, S. (1999). Assisted reproduction in the bitch. Thesis (Master of Sciences). Institute of Reproduction and Development Faculty of Science, Monash University, Australia, 161p. MIES FILHO, A. Reprodução dos animais e inseminação artificial de cães. 6 ed. Porto Alegre: Sulina, 1987. 750p. MORTON, D. B.; BRUCE, S. G. Semen evalution, criopreservation and factors relevant to the use of frozen semen in dogs. J. Reprod. Fertil., 1989. 311p. NÖTHLING, J.O., VOLKMANN, D.H. (1993). Effects of addition of autologous prostatic fluid on the fertility of frozen-thawed dog semen after intravaginal insemination. Journal of Reproduction and Fertility Supplement, 47, 335-341. OETTLE, E.E. (1993). Sperm morphology and fertility in the dog. Journal of Reproduction and Fertility Supplement, 47, 257-26

25 PAPA, F. O.; TAVARES, C. V. N.; MEIRA, C.; BICUDO, S. D.; ALVARENGA, M. A. Glicina-Gema: Proposta de um novo diluidor para congelação de sêmen eqüino. In: Simpósio Internacional de Reprodução animal. Anais... Portugal, 1993. PARKS, E. J.; GRAHAM, J. K. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology. V.38, 1992. PEÑA, A. L. Flow cytometry in the assessment of fresh and frozenthawed dog semen, and the effects of different criopreservation methods on post-thaw sperm survival and longevity. Doctoral thesis, Uppsala, 2000. PEREIRA, B.S., SILVA, A.R., UCHOA, D.C., CARDOSO, R.C.S., SILVA, L.D.M. (2001). Comparação da monta natural e inseminação artificial com sêmen diluído em água de coco em cadelas da raça Boxer. Ciência Animal, 11 (2), 97-100. RODRIGUES-MARTINEZ, H., EKWALL, H., LINDE-FORSBERG, C. (1993). Fine estructure and elemental composition of fresh and frozen dog spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility Supplement, 47, 279-285. STRÖM, B., ROTA, A., LINDE-FORSBERG, C. (1997). In vitro characteristics of canine spermatozoa subjected to two methods of cryopreservation. Theriogenology. 48, 247-256 SEAGER, S. W. J. Successful pregnancies utilizing frozen dog semen. A. I. Digest. V.17., 1969. SEAGER, S. W. J.; PLATZ, C. C. Artificial insemination and frozen semen in the dog, Veterinary Clinics os North America. 1977. SILVA, L. D. M.; VERSTEGEN, J. P. Comparisons between three differents extenders for canine intrauterine insemination with frozen-thawed spermatozoa. Theriogenology. V44, 1995.

26 SILVA, L. D. M. da.; SILVA. A. R.; CARDOSO, R. de C. S. Em: GONSALVES, P. B. D.; FIGUEREDO. J. R. de.; FREITAS, V. J. de. F. (Eds). Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Varela, 2002. SORRIBAS, C. S. Atlas de reprodução canina. São Paulo: interboock, 2006. 348p. TSUTSUI, T.; KAWAKAMI, E.; MURAO, I.; OGASA, A. Transport of spermatozoa in the reproductive tract of the bitch: Observations through uterine fistula. Japanese Journal of Veterinary Science, 1989. UCHOA, D.C., SILVA, A.R., SILVA, T.F.P., SILVA, L.D.M. (2001). Inseminação artificial com sêmen a fresco em cadelas da raça Bassethound utilizando a Sonda de Osíris. Revista Brasileira de Reprodução Animal. 25 (3), 371-373. UCHOA, D. C.; SILVA, A. R.; CARDOSO, R.C. S.; et al. CONSERVAÇÃO DO SÊMEN CANINO A 37 o C EM DILUENTES À BASE DE ÁGUA DE COCO. Universidade Federal de Santa Maria, Rio Grande do Sul, 2002. p.91-95. ZIRKIN, B.R. What is the relationship between the various endocrine components of the male reproductive system? In: Robaire, B.; Pryor, J.L. & Trasler, J.M. (eds.) Handbook of andrology. São Francisco: American Society of Andrology, 1995.