Ciência Animal 1999, 9(1):37-42 ÁGUA DE COCO ESTABILIZADA SUPLEMENTADA COM ANTIBIÓTICOS E ÁCIDO 3-INDOL ACÉTICO NA CONSERVAÇÃO DE SÊMEN DE CAPRINOS MAROTA (Estabilized coconut water added of antibiotics and indole-3-acetic acid in the conservation of Marota goat semen) Danielle Maria Machado Ribeiro AZEVÊDO* & Ricardo TONIOLLI Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará RESUMO O sêmen de caprinos apresenta entraves à sua conservação, sendo a água de coco e suas frações ativas diluidores alternativos para o beneficiamento de sêmen desta espécie. Foi coletado o sêmen de seis caprinos Marota através de vagina artificial, duas vezes por semana, durante um mês, em presença de fêmea em estro induzido por estrógeno. O sêmen foi analisado qualitativamente e subdividido em três alíquotas, correspondentes aos diluidores a serem testados: leite desnatado adicionado de 100 ng/ml de ácido 3-indol-acético (IAA), água de coco estabilizada suplementada com antibióticos (ACA) e leite desnatado (LD controle). O sêmen diluído foi resfriado a 4 o C e conservado em tubos de ensaio identificados e fechados, que permaneceram em refrigeração por 1, 24 e 48 h. Em cada tempo de conservação, o sêmen foi reaquecido a 37 o C em banho maria e avaliado quanto ao vigor e motilidade espermática, aos 5 e 120 min de incubação. O diluidor leite desnatado adicionado de IAA apresentou melhor es resultados (P<0,05) que os outros dois diluidores, em relação aos dois parâmetros avaliados. O diluidor água de coco estabilizada adicionada de antibióticos não apresentou diferença estatística (P>0,05) em relação ao diluidor controle. PALAVRAS-CHAVE: água de coco, ácido 3-indol-acético, caprino, sêmen ABSTRACT Goat semen presents difficulties with regard to conservation, and coconut water and its active fractions provide possible alternatives to processing the semen of this species. The semen of six Marota bucks were collected using an artificial vagina twice weekly for one month, in the presence of a female in oestrus. The semen was evaluated qualitatively and divided into three aliquots, corresponding to the diluents to be tested: stabilized coconut water with added antibiotics, skimmed milk with added 3-indole-acetic acid (IAA), at concentration of 100 ng/ml, and skimmed milk alone (control). The diluted semen was cooled to 4 o C and evaluated for vigor and spermatic motility after 5 and 120 min of incubation at conservation periods of 1, 24 and 48 h. The extender skimmed milk with added IAA was significatively (P<0.05) better in relation to the other two diluants utilized for the two evaluated parameters at all conservation times. There was no statistical difference (P>0.05) between stabilized coconut water with added antibiotics and control diluent. KEY WORDS: coconut water, indole-3-acetic acid, goat, semen. *Autor para correspondência Av. Paranjana,1700, Fortaleza, Ceará 37
INTRODUÇÃO A inseminação artificial, apesar de sua potencialidade no incremento à produtividade, é ainda pouco aplicada à espécie caprina no Nordeste do Brasil (MACHADO & SIMPLÍCIO, 1995). Uma das principais razões para este fato é a presença no plasma seminal caprino de uma enzima tipo fosfolipase A, secretada pelas glândulas bulbouretrais, que ao interagir com os fosfolipídeos dos diluidores utilizados para a conservação do sêmen caprino, libera substâncias tóxicas aos espermatozóides (ROY, 1957). Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas em busca de diluidores alternativos para o sêmen desta espécie, destacando-se aquelas relacionadas à água de coco (NUNES et al., 1987; TONIOLLI, 1989; SALLES et al., 1990; NUNES, 1993), líquido rico em aminoácidos, ácidos orgânicos não voláteis, açúcares e fatores de crescimento (NUNES & COMBARNOUS, 1995). O isolamento de uma fração da água de coco, ativa sobre a motilidade espermática, abriu a perspectiva de aumento do tempo de manutenção da capacidade fecundante do espermatozóide, conservado sob refrigeração, por um período superior a 24 h (NUNES, 1993). Esta substância, o ácido 3-indol-acético (IAA) é uma auxina, que ao ser introduzida nos diluidores convencionais para o sêmen de diferentes espécies, confere aos espermatozóides um incremento da motilidade aumentando a taxa de fertilidade, além de permitir a conservação do sêmen por períodos mais longos (TONIOLLI et al., 1995, 1996; NUNES et al., 1996). O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da utilização de água de coco estabilizada suplementada com antibióticos e do leite desnatado suplementado com IAA, no processo de conservação do sêmen caprino in vitro, para diferentes períodos de refrigeração. MATERIAL E MÉTODOS Caracterização do local do experimento Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Reprodução Animal do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Piauí, Teresina, Estado do Piauí. O município de Teresina situa-se a 5 o 5 de latitude Sul e 42 o 49 de longitude Oeste, com altitude de 72 metros. O clima segundo KÖOPEN (1900) é AW, tropical chuvoso de savana, com inverno seco (junho novembro) e verão chuvoso (dezembro maio). A precipitação pluviométrica média anual é de 1.360,4 mm, a temperatura média anual é de 26,8 o C e a umidade relativa do ar é 70% (SUDENE, 1990). Animais experimentais Foram utilizados seis reprodutores caprinos do tipo racial Marota, com média de idade de dois anos e peso médio de 29,7 kg, selecionados mediante análise do vigor e da motilidade espermática (valores mínimos aceitáveis: vigor > 3,5 e motilidade espermática > 60%). Os reprodutores foram manejados de forma intensiva recebendo como volumoso o capim elefante (Pennisetun purpureum Schum. cv. Napier) no cocho e suplementação com ração concentrada (13% de PB e 70% de NDT) para atendimento das necessidades nutricionais de animais em reprodução. Os animais tinham livre acesso a água de boa qualidade e a sal mineral. Coletas de sêmen: Foram realizadas duas coletas de sêmen por semana através de vagina artificial, em presença de fêmea estrogenada pela aplicação semanal de 10 mg de estradiol por via intramuscular. Logo após a coleta, o sêmen foi avaliado para controle da qualidade seminal. No total foram realizadas 48 coletas (6 machos x 2 vezes/semana x 4 semanas). Tratamento do sêmen Após a análise inicial, o sêmen foi fracionado em três alíquotas, correspondendo aos diluidores a serem testados: água de coco estabilizada adicionada de antibióticos (ACA), leite desnatado adicionado de ácido 3-indolacético (IAA) a uma concentração de 100 ng/ ml (LDI) e leite desnatado (LD - controle). O sêmen foi diluído na proporção de 9:1 com os diferentes diluidores testados. Os tubos contendo o sêmen diluído em cada um dos três diluidores foram identificados com 38
o número do reprodutor, data da coleta e diluidor utilizado, fechados e colocados em um becker com água à temperatura ambiente (27 o C), durante 30 min. Em seguida, a temperatura do sêmen foi abaixada a 4 o C através de refrigeração, durante 60 min. Atingido os 4 o C, o sêmen foi conservado por 1, 24 e 48 h. O sêmen assim tratado foi reaquecido para análises de vigor e motilidade espermática após 5 e 120 min de incubação em banho maria a 37 o C, em cada período de conservação. A taxa de degradação média da motilidade foi calculada através da análise da motilidade entre os 5 e 120 min de incubação do sêmen. Subtrai-se o valor aos 5 do valor aos 120 min dividindo-se o resultado pelo primeiro e multiplicando-se por 100. O resultado é expresso em porcentagem. Análise estatística O experimento seguiu o delineamento de blocos ao acaso em esquema fatorial 3x3x2 (3 diluidores x 3 tempos de conservação x 2 tempos de incubação) arranjado em parcelas subdivididas, em que os diluidores eram as parcelas e o fatorial 3x2 (3 tempos de conservação x 2 tempos de incubação) estavam nas subparcelas, sendo cada bloco ou repetição representado por um animal. Os parâmetros significativos na análise da variância foram submetidas ao Teste de Duncan para comparação de médias. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Statistical Analysis System SAS, versão 6.11 (SAS, 1996). RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste experimento, o vigor e a motilidade das células espermáticas, conservadoas no diluidor leite desnatado adicionado de 100 ng/ ml de ácido 3-indol-acético, apresentaram diferenças significativas entre médias (P<0,05), quando comparadas àquelas dos outros dois diluidores testados (Tab. 1 e 2). O diluidor água de coco estabilizada adicionada de antibióticos e o leite desnatado foram semelhantes (P>0,05) em relação aos dois parâmetros avaliados, apesar do diluidor a base de água de coco apresentar médias superiores ao diluidor controle (Tab. 1 e 2). O incremento do vigor e da motilidade espermática observado neste experimento com a adição do ácido 3-indol-acético ao diluidor leite desnatado (Tab. 1 e 2), amplamente testado como diluidor de sêmen caprino (NUNES & SILVA, 1984; NUNES, 1988; TONIOLLI, 1989; MELO & NUNES, 1991), deve-se a melhor proteção que esta auxina confere aos espermatozóides, diminuindo o estresse provocado pelo beneficiamento do sêmen. Diversos autores relataram anteriormente a atividade estimuladora do ácido 3-indol-acético sobre a motilidade espermática (CRUZ, 1994; NUNES & COMBARNOUS, 1995; TONIOLLI et al., 1995; NUNES et al., 1996), abrindo a perspectiva de utilização desta molécula na conservação do sêmen caprino por um período superior a 24 h. Tabela 1. Vigor dos espermatozóides de caprinos Marota, no sêmen diluído em leite desnatado (LD), leite desnatado suplementado com IAA (LDI) e água de coco estabilizada adicionada de antibióticos (ACA), após conservação a 4 o C por 1, 24 e 48 h. Tempo de conservação Diluidores (h) LD LDI ACA 1 2,5± 0,15 ba 3,1± 0,09 aa 2,6± 0,18 ba 24 1,8± 0,16 bb 2,7± 0,10 bb 2,0± 0,17 bb 48 1,1± 0,14 bc 2,1± 0,14 ac 1,2± 0,14 bc Médias seguidas por letras diferentes, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, diferem estatisticamente (P<0,05). 39
Tabela 2. Motilidade espermática (%) de caprinos Marota em sêmen diluído em leite desnatado (LD), leite desnatado suplementado com IAA (LDI) e água de coco estabilizada adicionada de antibióticos (ACA), após conservação a 4 o C por 1, 24 e 48 h. Tempo de conservação Diluidores (h) LD LDI ACA 1 58,5± 3,3 ba 71,1± 2,4 aa 61,1± 3,9 ba 24 43,5± 3,3 bb 61,5± 2,5 bb 47,0± 3,5 bb 48 27,1± 3,5 bc 48,0± 2,9 ac 30,1± 3,5 bc Médias seguidas por letras diferentes, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, diferem estatisticamente (P<0,05). Considerando-se como valores mínimos aceitáveis para utilização de sêmen em inseminação artificial um vigor 3,0 e motilidade 30% (CORTEEL, 1981; FONSECA et al., 1992) apenas o diluidor leite desnatado adicionado de ácido 3-indol-acético poderia ser utilizado nesta biotécnica da reprodução, e ainda assim, somente no primeiro tempo de conservação (1 h). No entanto, MELO & NUNES (1991), citam que um vigor mínimo de 2,0 é ainda compatível com bons resultados de fertilidade, desta forma podería-se recomendar a utilização do diluidor ACA até 24 h após o resfriamento. Entretanto, os resultados de fertilidade devem ser confirmados, utilizando-se um ejaculado com tal valor de vigor espermático. Deve-se no entanto observar, que para que ocorram resultados de fertilidade satisfatórios, além dos diversos fatores relativos à fêmea, ao ambiente (GIRÃO & SIMPLÍCIO, 1988; HAMMES et al., 1996) e às características vigor e motilidade espermática elevados, segundo NUNES (1982), os espermatozóides adquirem uma melhor capacidade de fertilização, após sofrerem uma certa degradação de sua motilidade durante este período de conservação. O sêmen que apresentar uma taxa de degradação com valores entre 30 e 60% apresentará os melhores resultados de fertilidade (CORTEEL, 1976 e 1982). Para o diluidor água de coco adicionada de antibióticos, nos três tempos de conservação, os resultados deste trabalho mostraram uma taxa de degradação da motilidade dentro dos limites estabelecidos por CORTEEL (1976). Para o diluidor leite desnatado adicionado de ácido 3- indol acético, foi visto a mesma característica somente às 48 h após o resfriamento (Tab. 3). Estes resultados sugerem que a proteção oferecida pela auxina aos espermatozóides, não permitiu uma degradação da motilidade para se chegar aos valores citados por CORTEEL (1976) como ideais para o sêmen caprino, projetando melhores taxas de fertilidade com o uso de tal ejaculado. Este fato foi confirmado nos resultados obtidos por SALLES (1989), com Tabela 3. Taxa de degradação da motilidade (TDM) do sêmen de caprinos Marota, diluído em leite desnatado (LD), Leite desnatado suplementado com IAA (LDI) e água de coco estabilizada adicionada de antibióticos (ACA), incubado a 37 o C durante 120 min após conservação por 1, 24 e 48 h a 4 o C Tempo de conservação Diluidores (h) 1 24 48 LD (%) 29,9 40,0 54,3 LDI (%) 18,0 21,6 34,1 ACA (%) 36,3 41,3 54,4 40
sêmen caprino diluído em água de coco estabilizada e CRUZ (1994), com sêmen ovino diluído em leite desnatado adicionado de IAA, que obtiveram 87,5% e 11,1% de taxa de parição, respectivamente. CONCLUSÃO Os resultados obtidos para o sêmen diluído em leite desnatado adicionado de IAA, colocam em evidência o papel desta auxina como constituinte de diluidores de sêmen caprino, favorecendo sua conservação por mais tempo. Outras pesquisas utilizando esta substância são necessárias objetivando não somente a conservação do sêmen caprino por período superior a 48 h, sob refrigeração, mas também a utilização do ácido 3-indol-acético na congelação de sêmen nesta espécie, e a obtenção de resultados de fertilidade in vivo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CORTEEL, J. M. 1976. Variations de la motilité et de la fecondance de spermatozoïdes de bouc. Ann. Zootech., 25:567-571. CORTEEL, J. M. 1981. Collection, processing and artificial insemination of goat semen. In: GALL, C. (ed.) Goat production. London: Academic Press, p. 171-191. CORTEEL, J. M. 1982. La mise en place de la semence dans les voies genitales de la chevre: source de variation possible de la fertilité aprés insemination artificielle caprine. Bull. Tech. Insem. Artif., 27:9-15. CRUZ, J. F. 1994. Conservação e fertilidade do sêmen ovino mantido a temperatura de 4 o C por um período de 48 horas diluído em frações ativas da água de coco. Fortaleza. Faculdade de Veterinária da UECE, 78p. (Dissertação de Mestrado). FONSECA, V. O., VALE FILHO, V. R., ABREU, J. J. & MIES FILHO, A. 1992. Procedimentos para exame andrológico e avaliação de sêmen animal. Belo Horizonte: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, 79p. GIRÃO, R. N. & SIMPLÍCIO, A. A. 1988. Eficiência reprodutiva de ovinos deslanados no nordeste do Brasil. In: VII Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, Belo Horizonte, 1987, p. 80-95. HAMMES, A. M., PIMENTEL, C. A. & FERNANDES, C. E. 1996. Fertilidade em garanhões avaliada através do exame andrológico. Ciênc. Rur., 26:277-283. KÖOPEN, W. 1900. Versuch einer klassifikation der klimate, vorzugsweise nachihren Beziehungen zur Pflanzenweld. Geographif che Zeitsckrift., 6:593-611. MACHADO, R. & SIMPLÍCIO, A. A. 1995. Inseminação artificial em caprinos no Brasil: estágio atual. Rev. Bras. Reprod. Anim., 19:61-72. MELO, A. C. M. & NUNES, J. F. 1991. Utilização da água de coco e do leite glicosado como diluente para a congelação do sêmen caprino. Ciênc. Anim., 1:33-38. NUNES, J. F. 1982. Étude des effects du plasma seminal sur la survie in vitro des spermatozoïdes de bouc. Paris. Université Pierre et Marie Curie, 76p. (Tese de Doutorado). NUNES, J. F. 1988. A inseminação artificial em caprinos no nordeste do Brasil. Rev. Bras. Reprod. Anim., 12:85-91. NUNES, J. F. 1993. El agua de coco como dilutor del semen caprino. Rev. Cient., 3:45-51. NUNES, J. F. & COMBARNOUS, Y. 1995. Utilização da água de coco e suas frações ativas como diluidor de sêmen dos mamíferos domésticos. I Simpósio Nacional de Biotecnologia da Reprodução de Mamíferos Domésticos, Fortaleza, 1995, p. 57-63. NUNES, J. F., LIMA, S. A. & OLIVEIRA, F. J. 1987. Coconut water as diluent for goat semen.in IV International Conference on Goats, Brasília, 1987, EMBRAPA/DDT, p. 1518. NUNES, J. F. & SILVA, A. E. D. F. 1984. Tecnologia de sêmen resfriado de caprinos. In: XVIII Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, Belém, 1984, p. 87. NUNES, J. F., COMBARNOUS, Y., OLIVEIRA, L. F. & TEIXEIRA, M. D. 1996. Utilização da água de coco e suas frações ativas na conservação in vitro do sêmen na espécie caprina. Ciênc. Anim., 2:32-43. ROY, A. 1957. Egg-yolk coagulation in the semen and Cowper s gland of the goat. Nature, 179:318-319. SALLES, M. G. F. 1989. Água de coco (Cocus nucifera L.) in natura e sob a forma de gel e estabilizada como diluidor do sêmen caprino. Porto Alegre. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 54p. (Dissertação de Mestrado). 41
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