UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA DISCIPLINA: INORGÂNICA AVANÇADA II ESPECTROMETRIA DE MASSAS MALDI-TOF Prof. Fabio da Silva Miranda e-mail: miranda@vm.uff.br Sala GQI 308, Ramal 2170
MALDI-MS MALDI matrix-assisted laser desorption ionization. Nesta técnica a amostra é co-cristalizada com um composto orgânico (ex: ácido benzóico) para formar uma matriz. Um laser no UV que é absorvido fortemente por compostos orgânicos é focalizado sobre a matriz. Dessa forma íons gerados tanto pela matriz tanto provenientes da matriz quanto da amostra e são acelerados para o analisador de massas. A técnica pode ser usada para produzir íons de grandes proteínas com massa molecular relativa acima de 100.000,00.
Características do MALDI-TOF MS Ionização suave analisa sem destruir biomoléculas e polímeros sintéticos; Faixa de massa grande; Misturas simples são facilmente analisadas; Relativamente tolerante a tampões e sais; Aquisição de dados rápida; Fácil de usar e manter, não é necessário o uso de água ou gases; Alta sensibilidade e boa resolução.
Esquema de funcionamento do MALDI
Representação esquemática dos processos desorção e ionização no MALDI National High Magnetic Field Laboratory, FL, USA.
MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Prato da amostra Laser hn 1. Amostra (A) é misturada com o excesso da matriz (M) e seco sobre o prato de MALDI. 2. Laser ionizar a matriz molecular. AH + 3. Moléculas da amostra são ionizadas por transferência de prótons da matriz: MH + + A M + AH +. +20 kv Variable Ground Grid Grid
Prato praparação de amostras para MALDI
Analisador de massas por tempo de voo Time-of-flight mass analyzer detector Fonte Drift region (flight tube) + + + + V Íons são formados em pulsos Os íons pequenos chegam primeiro ao detector Mede-se o tempo que o íon chega ao detector
Calibração da escala de massas A razão massa/carga é proporcional ao quadrado do tempo de deslocamento (drift time) m z 2t 2 L 2 K t = Drift time L = Drift length m = Mass K = Kinetic energy of ion z = Number of charges on ion
Voyager-DE STR MALDI TOF Sample plate Extraction grids Prism Attenuator Laser Timed ion selector Reflector detector Reflector Linear detector Collision cell Pumping Camera Pumping
Laser, Attenuator and Prism MALDI TOF Hardware Nitrogen laser at 337 nm, 3 ns wide pulses, 20 Hz. Laser attenuator varies the intensity of the laser hitting the sample. Prism deflects the laser beam into the ion source. Sample Plate and Sample Stage An accelerating voltage is applied to the sample plate in the range 15-25 kv. Variable Voltage Grid A grid 1-2 mm above the sample plate with an additional voltage to fine- tune ion acceleration Ground Grid Grounded surface defines end of acceleration region Grounded Aperture Entrance to flight tube
MALDI TOF Hardware Vacuum System High vacuum is required to avoid ion collisions Flight tube A field free region where ions drift at a velocity inversely proportional to the square root of their mass/charge. Linear Detector Measures the ion abundance in linear mode (no reflector used) and sends a signal to the digitizer.
Microchannel Plate (MCP)
Exemplos de aplicação de MALDI-TOF Analysis of the effect of OCT on MALDI signals from rat liver. (A) Procedure where OCT is used to adhere the tissue to the sample stage but does not come into contact with the sliced tissue. The resulting spectrum shows many intense signals between m/z 4500 and 10 500. (B) The tissue was embedded in OCT and attached to the sample stage. The resulting spectrum contains only about half of the signals as that in part A. Reprinted with permission from ref 95. Copyright 2003 Wiley Interscience. Schwartz, S. A.; Reyzer, M. L.; Caprioli, R. M. J. Mass Spectrom. 2003, 38, 699.
Exemplos de aplicação de MALDI-TOF Analysis of matrix crystallization from solutions of different matrix concentration. Solutions of sinapinic acid in 50:50 acetonitrile/0.1% TFA in water at concentrations of (A) 10 mg/ml, (B) 20 mg/ml, and (C) saturated (>30 mg/ml). The spectra obtained from solutions spotted on mouse liver tissue sections showed that the greater the concentration of matrix, the greater the crystal coverage, and the better the resulting mass spectrum. Reprinted with permission from ref 95. Copyright 2003 Wiley Interscience.
Exemplos de aplicação de MALDI-TOF Analysis of matrix crystallization on tissue. Comparison of three different matrices, (A) SA, (B) DHB, and (C) HCCA, at the concentration 20 mg/ml (in 50:50 acetonitrile/0.1% TFA in water). SA and HCCA form dense crystals on the tissue, while DHB crystallizes on the rim of the spot. Reprinted with permission from ref 95. Copyright 2003 Wiley Interscience.