Biologia 7 Microbiologia de Ambientes Especiais Pesquisador Prof.ª Dra. Mônica Marquezini Orientadora Resumo O suprimento de água potável requer desenvolvimento de novas técnicas para a reciclagem da água. O crescimento da população, a necessidade de quantidades maiores de água pela indústria e a expansão da irrigação agrícola demandam novas reservas de água. Mesmo perfeitamente límpida, inodora e insípida a água pode estar imprópria para consumo. O solo é constituído por uma população de microorganismos que excede todos os grupos, tanto em número como em variedades, incluindo microorganismos patogênicos que podem causar sérias infecções. Este trabalho focaliza os poluentes biológicos, os microorganismos, da água e do solo de escolas estaduais do município de Osasco. Seu objetivo primário foi introduzir na faculdade técnicas microbiológicas para análise de água e solo. Os estudos foram feitos com amostras de solo e de água de bebedouros das escolas. As amostras foram analisadas em agar simples e em membrana filtrante seguindo-se de cultivo em meio definido. Os resultados preliminares mostram que essas águas encontram-se dentro dos padrões de qualidade da CETESB e OMS. Palavras-chave: Água. Bactéria. Coliforme. Microorganismos indicadores. Microbiologia. Potável. Solo. Abstract The supply of drinking water requires the development of new methods of recycling. The constant growth of population, industrial and agricultural activities demand new water supply. The water may be not drinkable even when it is apparently clean. The ground is a complex mixture of microorganisms, including the pathogenic ones. The aim of the present work was to investigate the microorganisms present in the ground and water consumed in the public schools from Osasco city. We used ground and water from water trough. The samples were analyzed in agar and filter membranes followed by culture in defined medium. Our preliminary results showed these waters are in accord with CETESB and OMS standards for drinking water. Key words: Water. Bacteria. Indicator microorganisms. Micro biology. Drinkable. Ground.
8 Introdução Os microorganismos foram descritos inicialmente por Leeuwenhoek no século XVII, entretanto as técnicas para o seu isolamento foram introduzidas no século XIX, o que permitiu, então, o estudo do seu metabolismo e do seu papel na natureza. O conhecimento dos aspectos moleculares dos microorganismos proporcionou a conquista de sua manipulação e aplicação (MADEIRA, 1996). Atualmente cabe aos microrganismos o maior desenvolvimento de técnicas de DNA recombinante (TOBIN; DUSHECK, 1998). Nenhuma outra forma da diversidade biológica se mostra tão formidável quanto os microorganismos, seres que não podem ser diretamente observados a olho nu, sem o auxílio de instrumentos. As bactérias, na sua simplicidade estrutural, são seres complexos e diversificados do ponto de vista bioquímico e metabólico, o que permite sua adaptação aos habitats mais variados (PELCZAR, 2002; TOBIN; DUSHECK, 1998). A água potável da maioria das comunidades e municípios é proveniente de fontes superficiais, rios, ribeirões e lagos. Esses suprimentos de água natural, particularmente ribeirões e rios, são poluídos com dejetos domésticos, agrícolas e industriais. Muitos habitantes de cidades não estão cientes de que a água que vem para suas torneiras foi utilizada anteriormente, provavelmente várias vezes. Como parte do ciclo hidrológico, a reutilização de água tradicionalmente é um processo natural, mas as pressões crescentes em nosso suprimento de água requerem o desenvolvimento de novas técnicas para a reciclagem da água. O crescimento da população, a necessidade de quantidades maiores de água pela indústria e a expansão da irrigação agrícola exigem novas demandas de reservas de águas disponíveis. Esses fatores têm contribuído para uma nova dimensão na reutilização da água, fazendo-se necessário acelerar o processo natural de reciclagem da água e assegurar um suprimento seguro (PELCZAR, 2000). As origens profundas, poços e fontes, fornecem a maior parte da água para as residências individuais nas áreas rurais. As águas de chuvas captadas são armazenadas em cisternas e utilizadas, embora de modo limitado. As águas de superfície não devem ser usadas para a ingestão, a menos que possam ser submetidas a processos de purificação, já que há perigo constante de contaminação e, conseqüentemente de transmissão de doenças (JAWETZ, 1987; BERMUDEZ; HAZEN, 1988). A água distribuída em sistemas públicos de canalizações segue certas condições impostas que objetivam exclusivamente preservar a qualidade da água produzida; além de tais condições, o próprio sistema de canalização constitui uma forma de embalagem (PARLATORE; BEM-HUR, 1993). Os sistemas de canalizações requerem manutenção constante em relação à concentração de cloro residual para evitar a deterioração bacteriológica da água. Esta manutenção é mínima e de forma permanente nos sistemas. A manutenção de certos valores para ph, concentração de CO e prevenção de corrosão para evitar a ocorrência de concentrações indesejáveis de ferro na água também são itens importantes para preservar a qualidade da água (AGUDO, 1987). Quando se pensa em qualidade da água para consumo humano, surge a necessidade de conhecer, estabelecer, estudar ou controlar o conjunto de características que fazem ou não com que ela seja considerada adequada ao consumo humano (PARLATORE; BEM-HUR, 1993; WATER QUALITY CRITERIA, 1973). O controle da qualidade industrial aplicada ao consumo humano é representado por um conjunto de características. É necessário conhecer essas características com o objetivo de saber quais são e por que representam as condições pretendidas; estabelecer as condições adequadas para evidenciar a opção por determinada qualidade; estudá-las a fim de aperfeiçoar seu conhecimento e controlá-las,
Microbiologia de Ambientes Especiais 9 visando garantir sua adequação ao consumo humano (AGUDO, 1987; PARLATORE; BEM-HUR, 1993). A água no seu estado de pureza total não existe; deve-se imaginá-la como uma substância que se manifesta sob a forma de numerosas dispersões aquosas, de composição muito variável, que lhe conferem, em conseqüência, características que nem sempre são aquelas que representam a condição desejada (AGUDO, 1987; PARLATORE; BEM-HUR, 1993). Os agentes patogênicos mais comuns transmitidos pela água são aqueles que causam infecções no trato intestinal. Os microorganismos responsáveis por estas doenças estão presentes nas fezes ou urina de pessoas infectadas e, quando eliminadas, podem contaminar uma excreção hídrica, poluindo uma possível fonte de água potável (GELDREICH; KENNER, 1969; SYKES; SKINNER, 1971). A análise microbiológica da água de rotina, para determinar a sua potabilidade, não é e não deve ser baseada no isolamento e identificação de microorganismos patogênicos, pelas seguintes razões: 1) os agentes patogênicos têm acesso esporádico ao ambiente hídrico e não demonstram sobrevivência durante um longo período de tempo, portanto, poderiam ser perdidos em uma amostra submetida à análise laboratorial; 2) estando em pequeno número, os microorganismos patogênicos podem não ser detectados pelos procedimentos laboratoriais; 3) é necessário um período de pelo menos 24 h para a obtenção de resultados laboratoriais para microorganismos patogênicos. Detectada a presença desses microorganismos durante esse período, muitas pessoas teriam consumido a água e estariam expostas a esses microorganismos patogênicos, antes de uma ação para a situação (PARLATORE; BEM-HUR, 1993; ERIKSEN; DUFOUR, 1986). Por estas razões, os microbiologistas têm desenvolvido métodos para analisar a água que não dependem de isolamento e identificação dos microorganismos patogênicos. Em vez disso, os testes são baseados na detecção de microorganismos cuja presença na água indica a possibilidade da presença de microorganismos patogênicos. Os organismos indicadores servem como um sistema de alarme, cuja presença na água é a evidência de que ela está poluída com material fecal de origem humana ou de outros animais de sangue quente. Esse tipo de poluição indica que qualquer microorganismo patogênico que ocorre no trato intestinal desses animais pode também estar presente (POUCHER, 1991; PELCZAR, 1993). Algumas das características importantes de um organismo indicador são: estar presente em águas poluídas e ausentes em águas não poluídas (potável); estar presente na água quando os microorganismos patogênicos estão presentes; o número de microorganismos indicadores relacionados com o índice de poluição sobrevive melhor e por mais tempo na água do que os microorganismos patogênicos; apresentar propriedades uniformes e estáveis; geralmente é inofensivo ao homem e a outros animais; estar presente em maior número do que os patogênicos sendo facilmente evidenciados por técnicas laboratoriais padronizadas (PELCZAR, 2000). Segundo o Manual for Evaluating Public Drinking Water Supplies (USA, 1969), hoje em dia tem sido atentamente focalizado o suprimento de água como um aspecto do meio ambiente do homem. Este suprimento pode ser um recurso natural muito benéfico ou um veículo pelo qual organismos causadores de doenças ou substâncias químicas tóxicas podem ser largamente distribuídos. A população não tem meios de proteger diretamente seu próprio suprimento de água. A constante vigilância por funcionários de serviços de saúde e de água é necessária para que se tenha produção e distribuição contínua e segura. Estes profissionais precisam exercitar a vigilância pela avaliação rotineira dos serviços públicos de água existentes e pelo estudo de instalações propostas. Quando da avaliação dos sistemas de abastecimento para produzir constantemente água
1 0 segura e satisfatória, devem ser considerados os seguintes fatores: 1) a qualidade da água produzida em horas de tensões anormais, como durante fortes escoamentos superficiais, períodos de seca, ou períodos de excessiva demanda, como mostrado nos registros; 2) a qualidade das águas brutas e tratadas, como determinada pelos dados de laboratório e de inspeção sanitárias, bem como qualquer tendência à melhoria ou deterioração; 3) os processos de purificação, incluindo as instalações usadas para aplicar desinfetantes em vários pontos no processo de tratamento, e suas capacidades comparadas com aquelas consideradas necessárias para se satisfazer antecipadamente às especificações; 4) os processos de tratamento usados e sua confiabilidade em transformar as características de água bruta para produzir uma água tratada que permanentemente satisfaça os padrões de qualidade de água para consumo humano; 5) o mínimo de concentração de cloro residual no efluente da água da estação, quando o cloro é usado, durante o tempo em que essa ou maiores concentrações de cloro forem mantidas; 6) a qualidade dos operadores e pessoal de laboratório, como indicada pelo treinamento apropriado, ou certificação, ou ambos; 7) as instalações de laboratório e processos analíticos, freqüência e extensão de seu uso, e aplicação de dados para controle operacional (PARLATORE; BEM-HUR, 1993). A possibilidade de se atribuir uma marca de conformidade à água para consumo humano, muito embora a consciência do consumidor para o problema seja importante, cabe às autoridades sanitárias do país representar a atitude do consumidor (PARLATORE; BEM-HUR, 1993). Alguns requisitos de qualidade bacteriológica são seguidos para que se obtenha uma água de qualidade para o consumo da população. O Standard Methods for the Examination of Water define o grupo coliforme como: todas as bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas, gram-negativas, não esporuladas e na forma de bastonete, as quais fermentam com formação de gás dentro de 48 h a 35º C (APHA, 1987). O grupo coliforme inclui organismos que diferem nas características bioquímicas ou sorológicas e no seu habitat. Podem ser classificadas em dois gêneros: Escherichia e Aerobacter. Mais freqüentemente, referem-se às espécies Escherichia coli, E. freundi, E. intermedium, A. aerogenes e A. clocae. O gênero aerobacter foi denominado enterobacter. Pertencem, ainda, ao grupo coliforme certas bactérias que são patogênicas para os vegetais e outros subgrupos denominados de intermediários em relação às características bioquímicas da Escherichia coli e do gênero enterobacter (USA, 1969). Todos os subgrupos, embora tenham habitats diferentes, podem ser encontrados nos esgotos e águas poluídas. Os Escherichia coli são denominados coli-fecais e os subgrupos intermediários A. aerogenese A. c!ocae (grupo I.A.C.) como não fecais. É amplamente conhecido que as fezes dos homens e animais de sangue quente são ricas em coliformes e que estas bactérias existam em águas não poluídas em número reduzido. Uma das vantagens do coliforme como índice de poluição fecal da água é o fato bem conhecido do seu número na água estar correlacionado no tempo com o decréscimo das bactérias patogênicas intestinais. Por outro lado, o seu representante mais importante e freqüente, a Escherichia coli, é unicamente de origem fecal (GERBA, 1987). O coeficiente de mortalidade da Escherichia coli é, pois, igual ao das bactérias patogênicas intestinais. Os outros do grupo coliforme, como o Aerobacter aerogenes, têm resistência um pouco maior. Esta característica dos coliformes é importante, pois não seriam bons indicadores de poluição fecal se morressem mais rapidamente do que o agente patogênico. Contrariamente, se demorassem a morrer, mesmo uma água que não provocasse danos à saúde poderia ser considerada perigosa (POUCHER, 1991 e GERBA, 1987). A presença de um número significativo de alguns dos membros do grupo coliforme na água de
Microbiologia de Ambientes Especiais 1 1 consumo humano indica que o tratamento foi inadequado ou há existência de acesso de material indesejável no sistema de distribuição. Os métodos para exame dos coliformes, tanto pela técnica de tubos múltiplos como da membrana filtrante, estão incluídos no Standard Methods (APHA, 1987). A determinação da concentração dos coliformes assume importância como parâmetro indicador da possibilidade da existência de microorganismos patogênicos e que transmitem doenças tais como: febre tifóide, febre paratifóide, disenteria bacilar e cólera. Assim, a presença de qualquer uma dessas espécies bacterianas na água torna-se evidência de poluição fecal, de origem humana ou animal (PARLATORE; BEM-HUR, 1993). A Agência de Proteção do Meio Ambiente dos Estados Unidos (EPA) considera que a maior limitação para o índice de coliformes totais está na sua correlação incerta com a ocorrência de microorganismos patogênicos, e que a presença de coliformes fecais na água reflete muito melhor a probabilidade da ocorrência de patogênicos. Quanto à medida de coliformes totais, esta pode ser usada como uma alternativa para a medida de coliformes fecais. Contudo, estes dados devem ser encarados com reservas, devido ao seu significado duvidoso (WATER QUALITY CRITERIA, 1973). Os padrões de qualidade bacteriológica para água para consumo humano são determinados por algumas entidades como: Organização Mundial de Saúde (OMS, 1974), Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos USPHS (Manual for Evaluating Public Drinking Water Supplies USA, 1969) e Padrões Provisórios de Água de Consumo Humano, da Agência de Proteção do Meio Ambiente dos Estados Unidos (NATIONAL INTERIN PRIMARY DRINKING WATER REGULATION, 1976). Uma legislação federal abrangente tem sido desenvolvida para impor regulamentos severos destinados a reduzir a poluição e melhorar a qualidade da água, como a Resolução CONAMA no 20, de 18/ 06/1986, o Decreto n 79.367, de 09/03/1977, a Portaria no 56-BSB, de 14/03/1977, a NTA 60 - Decreto n 12.486, de 20/10/1978 e a Resolução no 25, de 1976 (AGUDO, 1987). 1 Objetivo Introduzir no Centro Universitário técnicas microbiológicas para análise de água e solo através da aprendizagem dos métodos de membrana filtrante e cultivo em meio seletivo. Para o desenvolvimento da metodologia de análise de água e solo será importante apreender manuseios básicos laboratoriais como: esterilização de meio de cultura, semeadura de bactérias e filtração com sistemas de membrana. Desta maneira, estaremos desenvolvendo, por meio da pesquisa, apoio à comunidade. 2 Materiais e Métodos Para que pudéssemos colher amostras de água e de solo nas escolas públicas de Osasco, foi solicitada autorização ao Sr. João Batista Grosso, Dirigente Regional de Ensino da Diretoria Regional de Ensino de Osasco. 2.1 Coleta do Material 2.1.1 Amostra de Água Foram coletadas amostras de água de bebedouros das escolas públicas estaduais do Município de Osasco, E. E. José Geraldo Vieira, E.E. Prof.º José Maria Rodrigues Leite e E.E. Profº João Baptista Rodrigues de Brito. As amostras foram colhidas em tubos de 50 ml, NUNC esterilizados. Após a coleta, as amostras foram levadas ao laboratório para análise, acondicionadas em caixa de isopor com gelo a uma temperatura inferior a 10 C. Para uma análise mais eficiente, recomenda-se não exceder 30 h desde a coleta até o processamento.
1 2 2.2.2 Cultivo Bacteriano Foram utilizadas quantidades de 1,0 e 0,1ml de água e de solo de cada amostra e em seguida crescida por 24 h a 35 C. As placas foram preparadas com Agar 15,0 g; peptona 5,0 g e extrato de carne 3,0 g diluído em 1,0 L de água e esterilizado a 100 por 30 minutos. O ph após esterilização precisa ser em torno de 6.8. Todas as análises foram feitas em triplicata. 2.2.3 Contagem Padrão em Placa Após o crescimento bacteriano, as colônias foram contadas utilizando a contagem padrão em placa para análise de água. As colônias identificadas foram coradas por Gram: solução de Gram foi feita com 2g de cristal violeta em 2Oml de etanol 95% e 0,8g de cristal de oxalato de amônia (NH 4 ) 2 C 2 O 4. H 2 O em 80 ml de água destilada. As duas soluções foram misturadas e filtradas e utilizadas após 24 h. As bactérias que retêm o cristal violeta são consideradas Gram positivo. membranas foram colocadas em meio de cultura definido Endoagar Les (Millipore). Normalmente, as placas de Petri utilizadas são especiais com tamanho suficiente para acomodar os discos de filtração. Essas placas foram incubadas por 24h a 350 C. Após o crescimento bacteriano, as colônias foram contadas. Este método é específico para coliformes. 3 Resultado As amostras de água cultivadas em agar sólido apresentaram crescimento bacteriano generalizado, após coloração não foi possível identificar coliformes fecais. As membranas após a filtração apresentaram crescimento bacteriano. Durante o período de incubação (350 C por 24h) as colônias se desenvolvem nos locais em que as bactérias ficaram retidas pelo processo de filtração. Através da análise das membranas não foi encontrada nenhuma colônia de coliformes fecais, o que confere à água sua potabilidade. Apenas duas escolas apresentaram em uma das suas amostras crescimento de coliformes totais (tabela l). 2.3 Técnica da Membrana Filtrante As amostras de água (100ml) foram filtradas em membrana de nitrocelulose com porosidade 0,45 em sistema tipo Millipore 47mm de diâmetro. Após, as Tabela 1: Dados das análises microbiológicas das amostras de água das escolas: 1) EE José Geraldo Vieira, 2) EE Prof. José Maria Rodrigues Leite, e 3) EE Prof. João Baptista Rodrigues de Brito. ESCOLA Coliformes fecais Coliformes totais Água (amostras) em 100 ml em 100 ml 1 Ausente 1 colônia Potável 2 Ausente Ausente Potável 3 Ausente 1 colônia Potável
Microbiologia de Ambientes Especiais 1 3 O crescimento bacteriano do solo apresentou várias colônias com diferentes microorganismos, entretanto não foi possível analisá-los, pois o laboratório não dispunha de meios seletivos, impossibilitando o aprendizado da técnica. 4 Discussão O crescimento bacteriano em Agar sem conter meios seletivos propiciou o aparecimento de muitos microorganismos. Em relação às análises feitas seria necessário o uso de testes bioquímicos para diferenciar as espécies. As análises após o crescimento dos microrganismos em membrana filtrante são seletivas para coliformes fecais. Os sistemas de filtração em membrana Millipore 0,45 µ permite com que as E coli fiquem retidas nas membranas. A utilização de meio enriquecido permite com que coliformes fecais cresçam tornando possível sua detecção. A E. coli tem capacidade de produzir indol a partir de triptofano enquanto E aerogenes não tem. Os coliformes têm várias características em comum com espécies do gênero Salmonella e Shigella, as quais todas são patogênicas. Entretanto, a principal diferença bioquímica característica é que os coliformes fermentam a lactose com a produção de ácido e gás. Salmoneila e Shigella não fermentam a lactose. Portanto, a fermentação da lactose é a reação-chave no procedimento laboratorial para determinar a potabilidade da água (PELCZAR, 2000). As quantidades de ácidos produzidos num caldo glicosado especial são detectadas pela presença do indicador de ph vermelho de metila. Os dois microorganismos produzem ácidos a partir da glicose. Entretanto, E. coli produz um ph mais baixo, que muda a cor do meio contendo vermelho de metila, enquanto E. aerogenes não produz a alteração de cor do meio, na presença do indicador. Outro aspecto a se observar é a capacidade de produzir o composto acetilmetilcarbinol em meio com glicose e peptona. Este composto químico é identificado pelo teste de Voges-Proskauer. A E. coli não produz acetilmetilcarbinol, mas o E. aerogenes produz. O E. aerogenes é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, ou seja, poderá crescer em um meio quimicamente definido em que o citrato de sódio é a única fonte de carbono. E. coli não cresce sob as mesmas circunstâncias. Por conveniência, esses testes são coletivamente designados como reações IMViC (1 = indol, M = vermelho de metila, Vi = reação de Voges-Proskauer e C = citrato). A Agência de Proteção do Meio Ambiente dos Estados Unidos (EPA-1972), considerando a capacidade dos processos convencionais de tratamento de água, recomenda que os coliformes fecais e a densidade de coliformes totais não devem exceder à média geométrica mensal de respectivamente 2.000/100 ml e 20.000/100 ml, nos mananciais dos sistemas públicos de abastecimento. O Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos (USA, 1969) recomenda para as mesmas condições os valores de coli-fecal de 4.000/ 100 ml e de coli total de 20.000/100 ml. A água pode colocar em perigo a saúde e a vida se apresentar microorganismos patogênicos. Os patógenos mais freqüentemente transmitidos pela água são aqueles que causam infecções do trato intestinal. Como exemplos, podem ser citados os agentes etimológicos de febre tifóide e paratifóide, shigelose, cólera, campilobacteriose, enterites virais e amebíase. Esses microorganismos estão presentes nas fezes ou na urina de uma pessoa infectada e, quando descartados, podem entrar em um corpo de água que pode servir como fonte de água potável. Não há um número particular de bactérias que seja oficialmente aceitável. Isto porque a água com poucas bactérias patogênicas obviamente é mais perigosa do que a água que contém muitas bactérias saprófitas. Todavia, as águas de boa qualidade fornecem uma contagem baixa de colônias, menos do que 100 por mililitro. As contagens em placa são úteis na determinação da eficiência das operações destinadas à remoção ou à destruição de organismos (sedimentação, filtração e cobrarão). A contagem pode ser feita antes e após o tratamento específico para medir a redução da população microbiana.
1 4 A prevenção de transmissão dessas patogenias Pode ser feita mediante: (1) métodos de purificação de água que forneçam água potável segura, (2) tratamento de água de esgoto antes do descarte ou na reutilização e (3) procedimentos por meio dos quais a água possa ser examinada para determinar a sua qualidade microbiológica. Conclusão Os resultados obtidos das amostras de água das escolas públicas estaduais analisadas estão com índices de coliformes abaixo dos estipulados por Padrões Provisórios de Água de Consumo Humano, da Agência de Proteção do Meio Ambiente dos Estados Unidos (EPA-1972), do Serviço de Saúde Publica dos Estados Unidos (USPHS-1969), e da Organização Mundial de Saúde (OMS-1971). Isso significa que a água é potável e apropriada para o consumo humano. O conhecimento das metodologias de análises microbiológicas adquirido neste projeto de iniciação poderá ser implantado no Unifieo para futuras análises de água a serviço da comunidade de entorno. Referências AGUDO, E.G. Guia de coleta e preservação de amostras de água. São Paulo: CETESB, 1987. APHA, Standards Methods for the Examination of Water. 17 Ed. American Public Health Association. Washington, DC USA. 1987. BERMUDEZ, M.; T. C. HAZEN. Phenotypic and Genotypic comparison of Escherichia co//from pristini tropical waters. Appl. Environ. Microbiol. 1988. ERIKSEN, T. H.; A. P. DUFOUR. Methods to identify water pathogens and indicator organisms. In: Water-borne Diseases in the United States. G. F. Craum, Boca Raton: Ed. CRC Press, 1986. GELDREICH, E. E.; B. A. KENNER. Concepts of fecal streptococci in stream poliution. J. Water Pollut. Control Fed. 1969. GERBA, C. P. Phase as indicators of fecal pollution. In. Phase Ecology. S. M. Goyal, C. P. Gerba, and G. Bitton, New York: Eds. Wiley Interscience, 1987. JAWETZ, E.; MELNICK, E. L.; ADELBERG, E. Microbiologia Médica. 15 ed., Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1987. MADEIRA, A. L.; Fonseca, L.A.M. R. Biologia Microbiana. Lisboa: Universidade Aberta, 1996. NATIONAL Interim Primary Drinking Water Regulations. Journal American Water Works Association. Denver, Colo, 1976. PARLATORE, A. C.; BEM-HUR, L. B. Controle da qualidade de água para consumo humano: bases conceituais e operacionais. São Paulo: CETESB, 1993. PELCZAR, M.; REID, R.; CHAN, E. C. S. Microbiologia. Vol. II, Rio de Janeiro: MCGraw-Hill do Brasil, 2000. PELCZAR JR., M.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiolgy, Concepts and Applications. Rio de Janeiro: Mc Graw-Hill, 1993. POUCHER, A.M, L. A. et. al. Enumeration by a miniaturized method of Escherichia coli Streptococcus bovis andenterococci as indicators of the origin of faecal pollution of water. 3. Appl. Bacterial. 1991. SYKES, G.; SKINNER, F. A. Microbial Aspects of Pollution. New York: Academic, 1971. TOBIN, A.J. & Dusheck, E.; Asking About Life. Saudenrs: College Publishers, 962 p. WHO Geneva, Guidelines for drinking-water quality. Geneva, Vol. I, 1998. USA. Manual for Evaluating Public drinking water supplies. Department of Health, Education, and Welfare, Environmental Control Administration Public Health Service Publication nº 1820. Cincinnati, 1969. WATER QUALITY CRITERIA, WASHINGTON. Environmental Protection Agency. 1973. OMS, Padrões internacionais para a água de alimentação. Trad. de Rui Hugo do Rosário. Macau: Ed. do Leal Senado, 1974.