(12) PEDIDO INTERNACIONAL PUBLICADO SOB O TRATADO DE COOPERAÇÃO EM MATÉRIA DE PATENTES (PCT)

(12) PEDIDO INTERNACIONAL PUBLICADO SOB O TRATADO DE COOPERAÇÃO EM MATÉRIA DE PATENTES (PCT) Secretaria Internacional ά llll II III I III III I III I I II III H II I II ) Número de Publicação Internacional (43) Data de Publicação Internacional ' ' WO 2013/152408 A2 17 de Outubro de 2013 (17.10.2013) W P O I P C T (51) Classificação Internacional de Patentes CARVALHO ANDRADE, Alan; Rua Delfino de Souza, C12N 15/113 (2010.01) 800, Centro, CEP-37200-000 Lavras, MG (BR). RODRIGUES DA SILVA, Felipe; Parque Prado, CEP- (21) Número do Pedido Internacional 13044-163 Campinas, SP (BR). PROTASIO PEREIRA, PCT/BR201 3/0001 10 Luiz Filipe; Rua Silvio Pegoraro, 382, J. Petrópolis, CEP- (22) Data do Depósito Internacional : 86015-490 Londrina, PR (BR). GUITTON COTTA, 9 de Abril de 2013 (09.04.201 3) Michelle; SHCGN 713, BI P, Apart, 404, Asa Norte, CEP- 70746-760 Brasília, DF (BR). SOUZA DA EIRA, Mirian (25) Língua de Depósito Internacional : Português Therezinha; SQSW 102, BI, H. Apt 407, Sudoeste DF, (26) Língua de Publicação : Português CEP-70670-208 Brasília, DF (BR). (30) Dados Relativos à Prioridade : (74) Mandatário : DANNEMANN, SIEMSEN, BIGLER & BR102012 008162-8 IPANEMA MOREIRA; Caixa Postal 2142, Rua Marquês 9 de Abril de 2012 (09.04.2012) BR de Olinda, 70, CEP-2225 1-040 Rio de Janeiro, RJ (BR). (71) Requerente EMPRESA BRASILEIRA DE (81) Estados Designados (sem indicação contrária, para todos PESQUISA AGROPECUÁRIA - EMBRAPA - os tipos de proteção nacional existentes) : AE, AG, AL, [BR/BR]; PqEB - Parque Estação Biológica, Edifício Sede AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, - Final W/3 Norte, Plano Piloto, CEP-70770-901 Brasília - BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DF (BR). DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN, (72) Inventores : DANTAS DE ALMEIDA, Juliana; SQN KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD, 308, Bloco F, Apto 307, CEP-70747-060 Brasília, DF ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, (BR). GOMES BARROS, Leila Maria; SQN 308, Bloco NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, J, Apto 305, Asa Norte, CEP-70867-100 Brasília, DF RW, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, (BR). CARNEIRO, Mauro; SHIS QI 11, Conj 8, Casa 07, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, Lago Sul, CEP-7 1625-280 Brasília, DF (BR). ZM, ZW. (Continua na página seguinte) (54) Title : COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING THE EXPRESSION OF GENES OF ESÍTEREST (54) Título : COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES DE INTERESSE (57) Abstract : The present invention relates to a specific promoter sequence for the expression of genes of interest in fruit endosperm. The invention also describes DNA Ê ÊS constructs that contain the promoter, as well as the method 30000 that uses these constructs to produce plants, plant cells or., transgenic protoplasts. The expression of the transgene 25000 exclusively in the organ of interest allows the exogenous 20000 transcript to accumulate only in the fruit and is advantageous over constitutive expression, since it makes it easier to 15000 RAIZ A A implement strategies that aim at obtaining cultivars with FOLHA B B higher added value, such as: adaptation to environmental 10000 m m ¾ stresses, resistance to pathogens, pests and agrochemicals, FRUTO C C 5000 increase in nutritional and therapeutic value, and a new /, / alternative for expression systems in plant organisms to 0 generate more competitive cultivars at lower costs. Moreover, 203,01 109,86 29497,49 the present invention also describes a sequence with constitutive expression, which offers an alternative for < implementing expression systems when constitutive expression is required. The objective of the invention is to FIGURA 3 o A A ROOT (57) Resumo : BBLEAF CCFRUIT increase the economic, social and environmental benefits, as well as the biosafety of genetic engineering. (Continua na página seguinte)

w o 2013/152408 A 2 II II III «III I1 III I III IIII III I III II I II (84) Estados Designados (sem indicação contrária, para Publicado: todos os tipos de proteção regional existentes) : ARIPO sem relatório de pesquisa internacional; será (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, republicado após receção do mesmo (Regra 48.2(g)) SZ, TZ, UG, ZM, ZW), Eurasiático (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), Europeu (AL, AT, BE, BG, CH, CY, com listagem de sequências, parte da descrição (Regra CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, 5.2(a)) ΓΓ, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). A presente invenção diz respeito a uma sequência promotora específica para a expressão de genes de interesse em endosperma de frutos. A invenção ainda descreve construções de DNA que contém o promotor bem como o método utilizando tais construções para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A expressão do transgene somente no órgão de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto e constitui vantagem em relação à expressão constitutiva, pois favorece a implementação de estratégias que visam a obtenção de cultivares com maior valor agregado como: adaptação a estresse ambiental, tolerância a patógenos, pragas e defensivos agrícolas, aumento do valor nutricional e terapêutico e uma nova alternativa para sistemas de expressão em orgamsmos vegetais gerando cultivares mais competitivas a custos mais baixos. Além disso, a presente invenção também apresenta uma sequência com expressão constitutiva, oferecendo uma alternativa para a implementação de sistemas de expressão onde a expressão constitutiva é requerida. A invenção tem como-objetivo o aumento-dos benefícios económicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES DE INTERESSE CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada ao campo da biotecnologia. Mais especificamente a invenção diz respeito a um promotor específico para a expressão de genes de interesse em endosperma de frutos. A invenção descreve ainda construções de DNA que contêm o promotor da invenção operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor da invenção para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de plantas com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizada para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios económicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Nas ultimas três décadas a agricultura tem sido beneficiada pela biotecnologia a qual associa a tecnologia do DNA recombinante, a cultura de tecidos vegetais e os métodos de melhoramento clássico para gerar plantas resistentes a herbicidas (Aragão, F.J.L., Vianna, G. R., Albino, M.M.C. & Rech, E.L. 2002 Transgenic Dry Bean Tolerant to the Herbicide Glufosinate Ammonium. Crop Science, v. 42, n. 4, p. 1298-1302), a insetos-praga (Lilley C. J., Wang D., Atkinson H. J. & Urwin P. E. 2010 Effective delivery of a nematode-repellent peptide using.plant Biotechnology Journal, pp. 1-11 doi: 10. 1111/j 1467-7652.20 10.00542.x, a root-cap-specific promoter) e tolerantes a

seca (Quan R, Hu S, Zhang Z, Zhang H, Zhang Z, Huang R. Overexpression of an ERF transcription factor- TSRFl improves rice drought tolerance. Plant Biotechnol J. 2010 May l;8(4):476-88), além de plantas com alto valor nutricional (Aluru, M, Xu, Y., Guo, R., Wang, Z., Li, S., White, W, Wang, K. & Rodermel, S. 2008 Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content. J. Exp. Bot., v. 59, n. 3, p. 3551-3562) e alto valor terapêutico (Marcondes, J. & Hansen, E. 2008 Transgenic lettuce seedlings carrying hepatitis B virus antigen HBsAg. Braz. J. Infect. Dis., v.12, n. 6, p. 469-471). Somadas, essas características resultam em aumento de produção, ganhos económicos, melhoria da qualidade de vida da população e preservação do meio ambiente. Por meio da técnica de transgenia é possível a introdução de genes de interesse independentemente de barreiras interespecíficas. Apesar dos benefícios económicos, sociais e ambientais associados à transformação genética, essa tecnologia se tornou alvo de preocupação por parte de consumidores e ambientalistas devido a questões de biossegurança. Dados da literatura apontam uma evolução na aplicação da transformação genética de acordo com o surgimento de várias gerações de transgênicos. A primeira e segunda geração de plantas transgênicas utilizaram promotores constitutivos como.o promotor do vírus do mosaico da couve flor (CaMV 35S) (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985 Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812), promotores de genes encontrados no T-DNA de Agrobacterium tumefaciens como por exemplo, o promotor do gene da enzima nopalina sintetase (Bevan, M. W., Barnes, W. M. & Chilton, M. D. 1983 Structure and transcription of the nopaline syntase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Research, v.l l, n. 2, p. 369-385) e promotores de genes que codificam proteínas altamente conservadas e envolvidas em processos vitais de praticamente todos os organismos como a ubiquitina (Toki S., Takamatsu S., Nojiri C, Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A.H., Quail P.H. & Uchimiya H. 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants. Plant Physiol. Nov;100(3):1503-7) e a actina (An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S. & Meagher R.B. 1996 Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Jul; 10(1): 107-21). Entretanto, a terceira geração de plantas transgênicas caracteriza-se, entre outros aspectos, pela

utilização de promotores tecido-específicos, tais como: promotores específicos de células epidérmicas (Hooker T.S., Millar A.A. & Kunst L. 2002. Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis. Plant Physiol. Aug; 129(4): 1568-80), de floema (Okumoto S., Koch W., Tegeder M., Fischer W.N., Biehl A., Leister D., Stierhof Y.D. & Frommer W.B. 2004. Root phloem-specific expression of the plasma membrane amino acid proton cotransporter AAP3. J Exp Bot. Oct;55(406):2 155-68), de pólen (Wakeley PR, Rogers HJ, Rozycka M, Greenland AJ, Hussey PJ. A maize pectin methylesterase-like gene, ZmC5, specifically expressed in pollen. Plant Mol Biol. 1998 May;37(l): 187-92) ou induzidos por estresses bióticos (Himmelbach A., Liu L., Zierold U., Altschmied L., Maucher H., Beier F., Muller D., Hensel G, Heise A., Schutzendixbel A., Kumlehn J. & Schweizer P. 2010. Promoters of the barley germin-like GER4 gene cluster enable strong transgene expression in response to pathogen attack. Plant Celi. 2010. Mar; 22(3):937-52. Epub Mar 19), abióticos (Rai M., He C. & Wu R. 2009. Comparative functional analysis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgenic Res. Oct;18(5):787-99) e químicos (Tomsett, A. Tregova, A. Garoosi and M. Caddick, Ethanol-inducibic gene expression: first st tovvards a new green revolution?, Trends Plant Sei. 9 (2004), pp. 159-161) para promover uma expressão do transgene pontual e apenas quando necessário. A obtenção e disponibilização de promotores capazes de limitar a expressão gênica temporal e/ou espacialmente pode ser uma das maneiras de equilibrar os benefícios da transgenia e suas restrições. Promotor é um conjunto de módulos de controle de transcrição, organizados em volta do sítio de iniciação da enzima RNA polimerase II (Potenza, C ; Aleman, L. & Sengupta-Gopalan, C. 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular Development Biological-Plant v. 40, p.1-22) os quais contém sequências específicas reconhecidas por proteínas envolvidas na transcrição. Diferentes classes de promotores vêm sendo descritas na literatura, baseadas em seu perfil de expressão. Entre elas está a dos promotores constitutivos, os quais são ativos em todos os tecidos e em todas as fases do desenvolvimento do organismo, como, por exemplo, o CaMV35S (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985. Identification of DNA sequences required for

the activity of the cauliflower mosaic vírus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812). Já os promotores tecido/órgão-específicos promovem a expressão de seu gene correlato somente em seu tecido/órgão-alvo como fruto (Atkinson R.G, Bolitho K.M., Wright M.A., Iturriagagoitia-Bueno T., Reid S.J. & Ross G.S. 1998 Apple ACC-oxidase and polygalacturonase: ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato. Plant Mol Biol. Oct; 38(3):449-60), semente-grão (Paine J.A., Shipton C.A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy.J., Vernon G, Wright S.Y., Hinchliffe E., Adams J.L., Silverstone A.L. & Drake R. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat Biotechnol. Apr;23(4):482-7), raiz/tubérculos (Visser R.G, Stolte A. & Jacobsen E. 1991. Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-gus gene in transgenic potato plants. Plant Mol Biol. Oct; 17(4): 69 1-9), flores (Annadana S., Beekwilder M.J., Kuipers G, Visser P.B., Outchkourov N., Pereira A., Udayakumar M., De Jong J. & Jongsma M.A. 2002. Cloning of the chrysanthemum UEP1 promoter and comparative expression in florets and leaves of Dendranthema grandiflora. Transgenic Res. Aug;l l(4):437-45) e folhas (Nomura M., Katayama K., Nishimura A., Ishida Y., Ohta S., KQma i.,,.miyao- okuto Matsuoka M. 2000, The promoter o-f-rbcs in a C3 plant (rice) direets organ-specific, light-dependent expression in a C4 plant (maize), but does not confer bundle sheath cell-specific expression. Plant Mol Biol. Sep;44(l):99-106). Existem ainda os promotores responsivos ou induzíveis os quais são ativados mediante uma determinada situação, em resposta a estresses bióticos, abióticos ou químicos. Promotores isolados a partir de um dado organismo podem ser utilizados para regular um gene de outro organismo por meio de construções gênicas quiméricas. Existem inúmeros promotores tecido-específicos descritos para plantas, como é o caso da expressão específica em semente (WO8903887), tubérculo (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369 e Schmulling et al. (1989) Plant Celi 1, 665-670), raiz (US20060143735 e como mencionado no pedido de patente US200301 75783, Keller et al., 1989 Genes Devei.

3:1639-1646), estames (WO8910396, W09213956), promotores específicos da zona de deiscência (W09713865), meristema (Ito et al. (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878) e fruto (Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 e US5753475, sendo que nesse último documento, a sequência apresentada tem ação específica no pericarpo do fruto. Na presente invenção, apresentamos um promotor isolado a partir de cafeeiro (Coffea ssp), específico do endosperma do fruto. O endosperma é a parte consumida do grão, de grande interesse económico, e a possibilidade de expressar uma proteína de interesse especificamente no endosperma é útil na introdução de características relacionadas à qualidade nutricional, características organolépticas, vantagens na fase pós-colheita. Atualmente, os promotores utilizados na obtenção dos transgênicos comerciais são frequentemente constitutivos e promovem a expressão do transgene em todos os tecidos da planta e em todas as fases do desenvolvimento. Essa característica acarreta desgaste energético na planta, pois ocorre desperdício metabólico na produção de uma proteína em quantidades e locais em que ela é desnecessária e pode levar a diminuição da produtividade. Além disso, é desejável do ponto de vista comercial a agregação de. va r a culturas importantes..economicamente co é o casa- do.arroz dourado, rico em β-caroteno (Beyer P. Golden Rice and 'Golden' crops for human nutrition. 2010. May 15. N Biotechnol. [Epub ahead of prinf]. http://vvw.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b8jg4-5033y3b- 2&_user=7430 124&_coverDate=05%2F 15%2F20 10&_rdoc=l &_fmt=high&_orig=sear ch&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=c0000 12878&_version= 1&_urlVersion=0 &_userid=7430 124&md5=a9c6d2 0db86be4e6946f0fl f69766c0). Outro aspecto importante é a facilitação de testes de biossegurança, uma vez que a expressão do gene fica restrita a um só órgão. O uso cada vez mais frequente da transgenia como recurso na resolução de problemas de culturas economicamente importantes ocorre porque a transgenia permite a incorporação de características desejáveis de forma direcionada, independentemente de barreiras entre espécies. A maioria das plantas transgênicas lançadas no mercado até o presente utiliza-se de promotores constitutivos, cujo produto é expresso em todos os tecidos do organismo. Outro fator limitante é a dependência tecnológica uma vez que os usos dos promotores

disponíveis atualmente estão protegidos por patentes. A invenção aqui proposta pode ainda ser vista como uma alternativa a regiões promotoras j á existentes, principalmente em cultivares e programas de melhoramento. O cenário agronómico atual conta com impactos promovidos pelas mudanças climáticas os quais causam sérios desequilíbrios no meio ambiente e na agricultura e com o aumento populacional, que é um fator gerador de desequilíbrio ambiental pela demanda de espaço para aumento da produção agrícola. Para mitigar esses impactos é necessário o manejo sustentável dos recursos naturais como água e espaço e também das adversidades como seca, pragas e patógenos. Desta forma, plantas mais adequadas a esse cenário precisam ser desenvolvidas e a transgenia é uma ferramenta que acelera a obtenção desses cultivares. O documento PI0209551-3 apresenta uma invenção que se refere a uma sequência de nucleotídeos derivada de folhas de café que pode ser usada como um promotor para uma expressão induzível de genes em plantas. Particularmente, a referida invenção pertence a uma sequência de nucleotídeos englobando o promotor e a região de codificação de um gene rbcs. De forma diferente, a invenção proposta no presente documento trata-se de. un promotor específico para frutos e além.de..con.sistir.-uma alternativa a processos de transgenia, particularmente em organismos vegetais. Os documentos WO0151637 e WO0302939 se referem a promotores, isolados de Fragaria vesca morango, que dirigem seletivamente a expressão de sequências de DNA colocados sob o controle do mesmo nos frutos de plantas. Quando comparadas ao presente invento, nota-se que as sequências dos promotores descritos nas patentes supracitadas foram isoladas de Fragaria vesca - morango. A proposta revelada no presente documento possui como vantagem a sua utilização para a geração de cultivares e/ou programas de melhoramento em diversos organismos vegetais, inclusive aos pertencentes ao género Coffea ssp, uma vez que o isolado foi obtido desse mesmo género. Além disso, o promotor proposto apresenta alternativa para a criação de organismos vegetais expressando transgenes. A patente KR1 00797644 por sua vez, se refere a um promotor de expressão específico em frutos, derivado do Citrus unshiu - fruto cítrico de origem japonesa. O promotor é fornecido para induzir a expressão de período de maturação tardio em frutos, expressar eficientemente um gene exógeno em frutos e controlar sua expressão, de

modo que plantas transgênicas sejam produzidas eficientemente. A vantagem ao se utilizar a invenção proposta pelo nosso grupo se faz particularmente nas cultivares do género Coffea ssp ou mesmo em programas de melhoramento desse género por se tratar de uma região regulatória presente no próprio género. Apresentando também uma alternativa para a criação de organismos vegetais expressando transgenes, como supracitado. O documento WO20 10093 175 apresenta um promotor de expressão específico, do gene HR7, enquanto o documento WO20 10012848 refere-se a uma sequência promotora denominada FSP1 situada na região 5 'do DNA do gene Snl, ambas derivadas do Solanum lycopersicum - tomate. De acordo com o documento, um gene introduzido a partir de uma planta transformada pode ser especificamente expresso em tecido de flores e frutos, quando comparado ao utilizado convencionalmente, como, por exemplo, o promotor do Cauliflower mosaic virus - CaMV 35S. Apesar de ser um promotor específico podendo ser utilizado para a expressão em frutos, apresenta como desvantagem ao promotor aqui pleiteado a impossibilidade de ser utilizado como um promotor nativo do género Coffea ssp e/ou programas de melhoramento desse mesmo género. Por sua vez, as invenções retratadas nos documentos CN1 298021 e WO2005026366 se referem a sequências para direcionar a expressão de um gene de interesse no endosperma. Entretanto, essas mesmas são derivadas das sequências controladoras 5 ' do gene waxy e do gene glutelin gene GluD-1 respectivamente, do arroz apresentando assim, as mesmas desvantagens citadas no parágrafo anterior referentes ao género Coffea ssp. A invenção retratada no documento US2007 169226 refere se a métodos e reagentes para a expressão de genes regulada temporalmente e/ou espacialmente, especialmente em sementes de plantas e tecidos reprodutivos femininos relacionados. Entretanto, as composições compreendem novas sequências de nucleotídeos para um promotor que sabidamente controla a expressão em sementes, do gene conhecido como eepl e não de frutos especificamente. Além da sequência não ser específica para Coffea ssp. De forma bastante similar ao documento do item anterior, o documento WO2008040061 revela uma sequência de ácidos nucléicos isolada compreendendo uma

sequência de nucleotídeos que corresponde a uma região promotora ativa de uma sequência de DNA. Contudo, a sequência de ácido nucléico isolada é derivada de um grão de cereal e trás as mesmas desvantagens referentes à utilização do promotor no género Coffea ssp e nos programas de melhoramento do referido género. Ainda de forma semelhante, os documentos US2009089897 e US20 1003 7347 fornecem composições e métodos para a regulação da expressão de sequências de nucleotídeos em planta, sendo que as novas composições são sequências de nucleotídeos para promotores de tecido, entretanto, isolado a partir de sorgo. O documento WO20101 18477 por sua vez proporciona composições compreendendo sequências promotoras operáveis em plantas, isoladas de Triticum aestivum - trigo, e suas variantes, que conferem expressão seletiva/específica de genes específicos especialmente no endosperma sendo, portanto diferente e não apresentando as vantagens da sequência aqui proposta em relação ao género Coffea ssp. A patente US7071378 e o pedido de patente WO2005026366 revelam em seu conteúdo sequências de nucleotídeos promotoras isoladas, respectivamente de Zea mays - milho e Hordeum vulgare - cevada, que permitam a expressão de sequências codificadoras onde podem.estar.! igadas. que são específicas para região do. endosperma. Diante do explicitado, a presente patente refere-se a uma nova sequência promotora específica de endosperma para a expressão de gene de interesse somente no fruto. Além de apresentar vantagens como a expressão direcionada apenas no endosperma em frutos e ao ser utilizadas em cultivares de Coffea ssp e programas de melhoramento desse mesmo género, a invenção traz ainda uma nova alternativa para sistemas de expressão em vegetais. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção se refere a um novo promotor para expressão específica de gene em endosperma de frutos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de organismos vegetais com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para

sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizadas para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento.. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios económicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética. Em uma primeira concretização, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo que seja substancialmente similar à SEQ ID NOl; sequência reversa de SEQ ID NOl; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NOl. Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos. Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombinantes compreendendo, na direção 5'-3', uma sequência de promotor de polinucleotídeo da presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma sequência de terminação de genes. O polinucleotídeo a ser transcrito pode compreender uma armação de leitura aberta de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou pode ser u a região de não codificação, ou não traduzida, de um polinucleotídeo de interesse. A matriz de leitura aberta pode ser orientada em uma direção "sense" ou "antisense". Preferivelmente, a sequência de terminação de genes é funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a sequência de terminação de genes é a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado da técnica (vide Benjamin Lewin, Genes VIII, capítulo 9) como o terminador da nopalina sintase de A. tumefasciens. Os vetores recombinantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas. Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o vetor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou progénie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o vetor recombinante da presente invenção. Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão de um polipeptídeo modificada. Esse método compreende transformar uma célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênica sob condições que conduzem à regeneração e crescimento da planta madura. Ainda em outro aspecto da presente invenção é provido um método para identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a transformação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma sequência de promotor de polinucleotídeos da presente invenção ligada operacionalmente a um polinucleotídeo a ser testado, 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgênica, e 3) comparar o fenótipo da planta transgênica com o fenótipo de plantas não. transformadas, ou de tipo selvagem,. Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tornarão evidentes, e a invenção será melhor compreendida por referência na "Descrição Detalhada da Invenção". BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. Fluxograma apresentando as etapas envolvidas para o desenvolvimento do promotor endosperma-específico. Figura 2. Fracionamento eletroforético de fragmentos específicos representantes da sequência de CaLTPl. (+) controle positivo, (R) cdna de raiz, (Fr) cdna de fruto e (Fo) cdna de folha. Figura 3. Gráfico representativo do perfil de expressão da LTP1 em raiz, folha e fruto em relação ao gene da ubiquitina. Figura 4. Validação da expressão preferencial de LTP1 em fruto por Northern blot. Gel desnaturante 1,5% com amostras de raiz, folha e fruto de Coffea arábica 120 dias após o florescimento. R : raiz; Fo: Folha e Fr: Fruto.

Figura 5. Fracionamento eletroforético dos fragmentos obtidos por meio da técnica de 5'race. M - marcador 1Kb ladder, 1/1 M - biblioteca Dral, 2/2M - biblioteca Eco RV, 3/3M - biblioteca PvuII e 4/4M - biblioteca Stul. Figura 6. Esquema que detalha a reconstrução do vetor binário PBI121. O vetor PBI121 possui 12800 pb de comprimento e seu número de acesso no Gen Bank é AF485783. A construção de interesse foi obtida por meio da substituição do promotor CaMV 35S (835 pb) pelo fragmento de 451 pb referente ao promotor CaLTPl. Figura 7. Reconstrução do vetor binário PBI121. O vetor PBI121 possui 12800 pb de comprimento e seu número de acesso no Gen Bank é AF485783. A construção de interesse foi obtida por meio da substituição do promotor CaMV 35S (835 pb) pelo fragmento de 451 pb referente ao promotor CaLTPl. Figura 8. Localização da atividade de GUS em plantas de tabaco transformadas com o promotor PBI. A, B, C, D; e I, J, K, L representam os controles negativo e positivo (PBI 121) do experimento, respectivamente. A, E e I representam tecidos foliares e radiculares; B, F e J secções transversais de frutos; C, G e K sementes; D, H e L estame, pétala e gineceu. E, F, G e H representam a atividade do promotor CaLTPl. -Pode-se observar o diagnóstico de reação_apenas nas. sementes (G) de plantas que contêm o promotor endosperma-específico. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um promotor específico de endosperma para a expressão de gene de interesse apenas no fruto do organismo vegetal transgênico. Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção. Um "gene quimérico" é um gene compreendendo um promotor e uma região codificadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, o gene quimérico compreende o polinucleotídeo da presente invenção ligado a regiões codificadoras de genes endógenos e/ou exógenos. Uma "sequência consenso" é uma sequência artificial na qual a base em cada posição representa a base frequentemente mais encontrada na sequência atual comparando-se diferentes alelos, genes ou organismos.

U "promotor" é aquela porção do DNA acima da região codificadora que contém sítios de ligação para RNA polimerase II para iniciar a transcrição do DNA. "Expressão" é a transcrição ou tradução de um gene estrutural, endógeno ou heterólogo. "GC box" é um elemento comum no promotor que pode aumentar a atividade do promotor. "TATAbox" é um elemento no promotor, localizado aproximadamente 30 bases acima do sítio de início da transcrição. O TATA box está associado com fatores de transcrição em geral, incluindo a RNA polimerase II. O termo "gene" significa uma unidade física e funcional da hereditariedade, representada por um segmento de DNA que codifica uma proteína funcional ou molécula de RNA. Um "gene endógeno" é um gene próprio da célula ou do organismo. Um "gene..heterólogo",, é.. ur gene is adp de u organismo._ oador,e recombinado no organismo receptor transformado. E um gene que não é próprio da célula ou do organismo. Um "gene repórter" é uma unidade codificadora cujo produto é facilmente testado, por exemplo, genes CAT, GUS, GAL, LUC e GFR A expressão de um gene repórter pode ser usada para testar a função de um promotor ligado a esse gene repórter. O termo "propágulo" como usado na presente invenção significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexual ou assexuai, incluindo as mudas. "Sense" significa que a sequência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5'-3' com relação ao promotor. "Antisense" significa que a sequência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5' -3' do promotor.

Como usado aqui, o termo "x-mero", como referência a um valor específico de "x", refere-se a uma sequência compreendendo pelo menos um número específico ("x") de resíduos do polinucleotídeo identificado como SEQ ID NOl. De acordo com formas de realização preferidas, o valor de x é preferivelmente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente ainda pelo menos 60 e mais preferivelmente pelo menos 80. Assim, polinucleotídeos da presente invenção compreendem um polinucleotídeo de 20 meros, 40 meros, 60 meros, 80 meros, 100 meros, 120 meros, 150 meros, 180 meros, 220 meros, 250 meros, 300 meros, 400 meros, 500 meros ou 600 meros identificado como SEQ ID NOl e variantes dos mesmos. O termo "polinucleotídeo (s)" como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mrna, de filamentos tanto "sense" como "antisense", e compreende cdna, DNA genômico, e DNA recombinante, assim como polinucleotídeos completamente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém íntrons e corresponde a uma molécula de DNA em um modo geralmente um a um. Uma molécula de RNAm corresponde a uma molécula de DNA e HnRNA da qual os íntrons foram excisados. Um polinucleotídeo pode consistir de um gene completo, ou qualquer porção do mesmo. Os polinucleotídeos "antisenso" operáveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de "polinucleotídeo" inclui assim todos esses fragmentos antisense operáveis. Os polinucleotídeos antisense e técnicas envolvendo polinucleotídeos antisense são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.) Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puro. O termo "oligonucleotídeo" refere-se a um segmento relativamente curto de uma sequência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores ("primers"),

onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase. O termo "sonda" utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo sequências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma sequência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de "hibridizar especificamente" ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Consequentemente, a sequência da sonda não necessita refletir exatamente a sequência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5' ou 3' da sonda, com o restante da sequência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou sequências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a sequência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele. O termo "primer" como utilizado aqui se refere a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e ph adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3' pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade

similar para produzir uma primeira extensão do produto. O 'primer' pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o 'primer' oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O 'primer' deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a sequência do 'primer' deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5' de um 'primer' complementar. Alternativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da sequência de oligonucleotídeo do 'primer', desde que o 'primer' tenha complementaridade suficiente com a sequência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto. O termo "hibridizando especificamente" diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam sequências suficientemente complementares para permitir tal hibridização sob condições pre determinadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1, 2003) Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 4, 2003). Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridização entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press): Tm = 81,5 C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida)-600/pb no duplex (sonda)

Como ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368] e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57 C. Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da presente invenção identificado como SEQ ID NOl ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da sequência especificada como SEQ ID NOl, ou uma variante desta. O termo "oligonucleotídeo" é referido aqui como 'primers' e 'sondas' da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 15-50 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, N Y, 1 89), levando em consideração estringências de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica. A definição dos termos "complemento", "complemento reverso" e "sequência reversa", como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a sequência 5'AGTGAAGT3', o complemento é 3'TCACTTCA5', o complemento reverso é 3'ACTTCACT5' e a sequência reversa é 5'TGAAGTGA3'. Como usado aqui, o termo "variante" ou "substancialmente similar" compreende sequências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de sequências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As sequências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas sequências de nucleotídeos com a sequências de nucleotídeo descrita aqui (SEQ ID NO 1), como determinada por

algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucléicos preferidos são aqueles cujas sequências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de sequência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 9 9% de identidade de sequência quando comparada com a sequência de referência. A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas sequências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na sequência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). O termo "vetor" diz respeito a um replicon, tal como plasmídeo, cosmídeo, bacmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (seja DNA ou RNA) possam ser ligadas para serem replicadas juntas com o vetor. Preferencialmente o vetor derivado de vírus é selecionado entre os bacteriófagos, vaccinias, retrovírus ou vírus do papiloma bovino. O "vetor recombinante" é resultante da combinação de um vetor comercial com genes quiméricos, ou o polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados a, são os vetores pgem-t, pcambia 1391, vetores gateway e o vetor pmon. O termo "sequências acentuadoras de expressão" conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, "upstream" ou "downstream") e que potenciam a taxa de transcrição. Estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que

estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das sequências adjacentes. O primeiro intensificador descoberto que estimulava a transcrição de genes eucariotos foi o SV40 (Presente no genoma do Vírus 40 de Símio) Após a descoberta do intensificador SV40 foram identificados centenas de outros enhancer como HSV-1, AMV, HPV-16, em outros genomas virais no DNA de células eucarióticas. ( Lodish et al, Biologia celular e molecular. 4 a edição pág 368) O termo "operacionalmente ligado" significa que as sequências regulatórias necessárias para expressão da sequência codificadora são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativa à sequência codificadora para efeito de expressão da sequência codificadora. Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de sequências codificadoras e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, auxiliadores ou "enhancers" e elementos ou sequências de terminação) no vetor de expressão. Uma região codificadora exógena é tipicamente flanqueada,por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificadora exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificadora exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléico que pode causar transcrição de regiões codificadores exógenas, posicionado na região 5' da região codificadora exógena. No caso da presente invenção a região regulatória diz respeito às regiões substancialmente similares à SEQ ID NO 1. Para auxiliar no aumento da transcrição de um determinado polinucleotídeo, a sequência promotora da presente invenção poderá estar ligada a outras sequências regulatórias j á descritas, tais como: ATATT (elemento de forte expressão na raiz), AACAAAC e GCCACCTCAT (elementos relativos a expressão específica em sementes), CACGTG e CCTACC (ambas sequências podem ser estimuladas ao um fator de estresse), entre outros. (Ai-Min Wu et al, Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426 435)