CONGELAÇÃO DO SÊMEM CANINO COM UM DILUIDOR A BASE DE ÁGUA DE COCO ACRESCIDO DE GEMA DE OVO E GLICEROL

Ciência Animal 2000, 10(1):29-36 CONGELAÇÃO DO SÊMEM CANINO COM UM DILUIDOR A BASE DE ÁGUA DE COCO ACRESCIDO DE GEMA DE OVO E GLICEROL (Canine semen freezing using a egg yolk-glycerol-coconut water extender) Rita de Cássia Soares CARDOSO*, Alexandre Rodrigues SILVA, Daniel Couto UCHOA & Lúcia Daniel Machado da SILVA Faculdade de Veterinária/ Universidade Estadual do Ceará RESUMO Foram utilizados oito cães com características seminais semelhantes. Os ejaculados foram obtidos por manipulação digital, onde foi utilizada a segunda fração dos mesmos. O sêmen foi avaliado macro e microscopicamente logo após a coleta, assim como após a diluição, o resfriamento e a descongelação. Foram testados dois diluidores, sendo um a base de água de coco (grupo A) e o outro a base de água de coco acrescido de 20% de gema de ovo e 4% de glicerol (grupo B). O protocolo de congelação utilizado foi o descrito por NUNES et al. (1997) modificado. O processo de descongelação do sêmen foi efetuado a uma temperatura de 37 º C por 1 minuto. Os resultados obtidos mostraram que após a primeira diluição e resfriamento, os dois grupos não diferiram. No entanto, os resultados de motilidade obtidos após a descongelação foram: 2,0 ± 4,5% e 50,0 ± 12,2% para os grupos A e B, respectivamente. O vigor após a descongelação foi de 0,2 ± 0,5 e 3,0 ± 0,6 para os grupos A e B, respectivamente. Os dois protocolos diferiram estatisticamente quanto aos parâmetros motilidade e vigor pós-descongelação (P = 0,009). Estes resultados mostraram que a adição de gema de ovo e glicerol ao diluidor a base de água de coco foi necessária para a preservação da qualidade espermática e que este diluidor pode ser utilizado com sucesso para a congelação de sêmen canino. PALAVRAS-CHAVE: sêmen, água de coco, congelação, glicerol, gema de ovo, cão ABSTRACT Semen was collected by digital manipulation from eight dogs which had similar seminal characteristics. The second fraction of the ejaculate was used in this study. Semen was assessed by macroscopic and microscopic criteria soon after collection, as well as after the first diluition, cooling and thawing. Experiments were conducted to compare two extenders, coconut water extender (group A) and the same extender plus 20% egg yolk and 4% glycerol (group B). The freezing method employed was the same as that described by NUNES et al. (1997). Semen was thawed at 37ºC for 1 minute. The data show that after dilution and cooling there was no difference between groups. Spermatozoal motility after thawing was 2.0 ± 4.5% and 50.0 ± 12.2% for groups A and B, respectivelly. The vigour after thawing was 0.2 ± 0.5 and 3.0 ± 0.6 for groups A and B respectively. The group A presented motility and vigour after thawing statistically superior than B (p = 0.009). These results showed that the addition of egg yolk and glycerol to coconut water extender was important to preserve the spermatozoal quality and that coconut water extender can be used with success in *Autor para correspondência Av. Paranjana, 1700 60740-000 Fortaleza, Ceará e-mail : rccard@zipmail.com.br 29

canine semen freezing. KEY WORDS: semen, coconut water, freezing, glycerol, egg yolk, dog INTRODUÇÃO A congelação de sêmen canino está se tornando cada vez mais popular, já que permite o transporte de material genético tanto dentro do país como internacionalmente. Além disso, o transporte do sêmen reduz o estresse dos reprodutores, o custo com o seu transporte, bem como o risco de transmissão de doenças. A criopreservação é o método pelo qual o sêmen, e por conseguinte, o potencial genético de machos valiosos, pode ser mantido por tempo indeterminado. A meta final na preservação de sêmen é a de obter gestações após inseminação artificial tão eficientemente como após a monta natural (QUINTANILHA, 1994). Isto depende de vários fatores tais como a qualidade do sêmen e o diluidor empregado. Apesar de já ter sido desenvolvido um diluidor específico para o sêmen do cão, o Biociphos (SILVA, 1995), este apresenta um alto custo. No nordeste do Brasil, tem sido desenvolvido um diluidor a base de água de coco para a conservação de sêmen de caprinos (SALLES & NUNES, 1992). Posteriormente, esse diluidor foi adaptado para o sêmen de ovinos (OLIVEIRA et al., 1994), suínos (TONIOLLI et al., 1998), capotes (Numida meleagris) (MILITÃO et al., 1994) e caninos (CARDOSO et al. 1998). Contudo, não foi ainda definido um protocolo ideal para a conservação do sêmen do cão, utilizando-se esse diluidor. Este tem sido amplamente estudado, considerando-se que a água de coco apresenta uma riqueza de substâncias que participam no metabolismo do espermatozóide (NUNES & SALGUEIRO, 1999). Segundo SÁNCHEZ-PARTIDA et al. (1997), o sucesso da estocagem do sêmen a longo prazo depende da diluição do mesmo em um meio contendo crioprotetores. Além da gema de ovo, tem-se também o glicerol como agente crioprotetor, sendo este último o mais utilizado na criopreservação de sêmen. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficácia do diluidor a base de água de coco acrescido de gema de ovo e glicerol sobre a qualidade do sêmen canino descongelado. MATERIAL E MÉTODOS Animais Foram utilizados oito cães oriundos do canil da Polícia Militar do Ceará e de canis particulares com características seminais macro e microscópicas semelhantes. Os cães eram mantidos em canis individuais, alimentando-se uma vez ao dia com ração comercial e tendo acesso a água ad libitum. Coleta do Sêmen A obtenção dos ejaculados foi efetuada por manipulação digital. Cada ejaculado foi separado nas suas três frações que foram coletadas e mantidas dentro de tubo graduado. A segunda fração, rica em espermatozóides foi utilizada para o estudo, sendo as outras frações desprezadas. O sêmen coletado (a fresco F; 37 º C) foi avaliado macro e microscopicamente. As avaliações macroscópicas incluíram: cor, aspecto e viscosidade. As microscópicas incluíram: porcentagem de espermatozóides móveis (motilidade), vigor e porcentagem de alterações morfológicas. Através do emprego de microscópio óptico (M.O.) foram avaliados na fração rica, a motilidade e o vigor, este último variando de 0 a 5, segundo HERMAN & SWANSON (1941) a um aumento de 100x. Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizado um esfregaço de sêmen, o qual foi corado com Giemsa. Este corante consistiu de uma solução contendo água destilada e Giemsa na proporção de 1mL:100µL. As lâminas foram imersas nessa solução por 15 minutos, sendo depois lavadas em água corrente e secadas. A avaliação também foi realizada através do M.O., porém, a um aumento de 400x. Diluição e Congelação do Sêmen Os diluidores foram adicionados às frações espermáticas (frações ricas em 30

espermatozóides) dos ejaculados na proporção de 1 : 1. Foram testados dois diluidores de composições diferentes cujo meio básico consistia em uma solução a base de água de coco. Estes diluidores são mostrados na Tab.1 Após o preparo dos diluidores antes do acréscimo de gema de ovo e glicerol, foi realizada a correção da osmolaridade dos mesmos. A leitura da mesma foi feita com o auxílio de osmômetro, cuidando-se para que a osmolaridade ficasse situada entre 300 e 310 mosmol /L, pois a osmolaridade do sêmen do cão situa-se nessa faixa (BATT, 1992). Quando a osmolaridade apresentava valores superiores ao desejado, a mesma era corrigida com o acréscimo de água destilada. Caso contrário, ou seja, quando apresentava valores inferiores, adicionava-se água de coco. No processo de congelação com o diluidor A, a incorporação do mesmo ao sêmen era efetuada de uma só vez. Porém, na congelação com o diluidor B, o mesmo era dividido em duas partes iguais (a e b) onde a parte a foi incorporada ao sêmen a uma temperatura de 37 º C. Feita a diluição, o(s) tubo(s) foi(ram) colocado(s) dentro de um becker com água a uma temperatura de 37 º C, transferido para a geladeira até atingir a temperatura de 4 º C. Atingida esta temperatura, o sêmen acrescido do diluidor B foi novamente diluído, mas agora com a parte b que é semelhante a parte a porém acrescida de 8% de glicerol, atingindo-se uma concentração final de 4%. A parte b foi adicionada ao sêmen em três etapas, utilizando-se partes iguais, com intervalo de cinco minutos entre cada etapa. Em seguida, o sêmen Tabela 1. Composição dos diluidores CS= Citrato de sódio; AC= Água de coco; AD= Água destilada; GO= Gema de ovo; GLI= Glicerol processado com os diluidores (A e B) foi envazado em palhetas de 0,25 ml fechados com álcool polivinílico. As palhetas, dispostas horizontalmente, foram levadas ao vapor de nitrogênio por cinco minutos para poder atingir uma temperatura de aproximadamente - 60 º C, sendo logo após armazenadas em nitrogênio líquido a -196 º C. O sêmen foi avaliado microscopicamente após as etapas: primeira diluição (D1; 37 º C), resfriamento (R; 4 º C) e segunda diluição (D2; 4 º C). Descongelação do Sêmen Duas palhetas de cada protocolo foram descongeladas em um banho-maria a 37 º C por um minuto. Depois da descongelação, as palhetas foram secadas e suas extremidades foram cortadas. O sêmen foi então colocado em tubos graduados mantidos a 37 º C, sendo analisado, após três minutos da congelação (D), segundo a motilidade, vigor e percentagem de alterações morfológicas. Análise Estatística As médias e desvios padrões foram determinados pela estatística descritiva e a comparação das diferenças entre os resultados dos protocolos de congelação-descongelação foi realizada pelo teste de Mann -Whitney, sendo os resultados considerados significativos quando P < 0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO Após a coleta do sêmen dos diferentes cães, foi observado que os parâmetros macroscópicos seminais referentes à cor (branca), aspecto (normal) e viscosidade (leitosa) estavam normais. No tocante à avaliação microscópica do sêmen a fresco, os resultados de motilidade, vigor e alterações morfológicas foram 96,3%; 4,6 e 25,7%, respectivamente (Tab.2). Todos os parâmetros macro e microscópicos dos ejaculados utilizados estavam dentro da normalidade para a espécie, como já foi demonstrado por CHRISTIANSEN em 1986. Sendo assim, os ejaculados foram considerados 31

Tabela 2: Valores médios (± DP) dos parâmetros microscópicos dos ejaculados a fresco. aptos a serem congelados. Após a primeira diluição, os resultados de motilidade e vigor foram: 89,0% e 4,2 para o grupo A (solução água de coco), e 98,0% e 4,8 para o grupo B (solução água de coco + gema de ovo + glicerol), não havendo diferença estatística significativa entre os dois grupos para tais características. A queda de motilidade do sêmen a fresco até a etapa de primeira diluição, nos dois grupos, não foi significativa. Este fato também foi observado por ROTA et al. (1995), onde a motilidade logo após a coleta era de 78,6% e após a diluição caiu para 74% (média dos quatro grupos testados). Após o resfriamento, os dois grupos também não diferiram estatisticamente, com valores de motilidade e vigor de 76,0% e 3,6 para o grupo A e 90,0% e 4,2 para o grupo B. Estes resultados são parcialmente semelhantes com o de MOURA et al. (1999), onde estes autores encontraram resultados de motilidade de 75,4% após o resfriamento a 4 º C, utilizando um diluidor à base de Tris acrescido de gema de ovo. Estas discrepâncias podem ser resultantes do tipo de diluidor utilizado em cada experimento. Apesar de haver diferença na composição dos dois diluidores (A e B), com o acréscimo de 20% de gema no diluidor B, ambos preservaram a qualidade espermática de maneira semelhante. Portanto, até a etapa de resfriamento, a adição dessa substância não causou nenhum incremento na motilidade e vigor espermáticos. Nas Fig. 1 (motilidade) e 2 (vigor), observou-se a ação dos diferentes diluidores à base de água de coco nas diferentes etapas do processo de congelação (primeira diluição, resfriamento e segunda diluição), bem como após a descongelação. Os valores das características motilidade e vigor, do sêmen processado com o diluidor A, diminuíram progressivamente apresentando 2,0% de espermatozóides móveis Tabela 3: Características microscópicas do sêmen canino (primeira diluição) no uso de dois diluidores a base de água de coco. Letras diferentes na mesma coluna implicam em diferença estatística significativa (p < 0,05) pelo teste de Mann - Whitney A= diluidor a base de água de coco; B= diluidor A + gema (20%) + glicerol (4%) 32

Tabela 4. Características microscópicas do sêmen canino (resfriamento) no uso de dois diluidores a base de água de coco. Letras diferentes na mesma coluna implicam em diferença estatística significativa (p < 0,05) pelo teste de Mann - Whitney. A= diluidor a base de água de coco; B= diluidor A + gema (20%) + glicerol (4%) com vigor de 0,2 após a descongelação. Portanto, o diluidor a base de água de coco sozinho não foi eficaz na preservação da qualidade espermática, não sendo recomendado o uso do mesmo para a congelação de sêmen canino. O sêmen processado com o diluidor B apresentou valores de motilidade variando entre 90,0 (resfriamento) e 98,0% (primeira diluição). Os valores do vigor ficaram entre 4,2 e 4,8 nas mesmas etapas anteriormente citadas (Tab. 3 e 4). Após a descongelação, os valores de motilidade e vigor caíram para 50,0% e 3,0, sendo superior estatisticamente ao grupo A (Fig 1 e 2, Tab.5). Apesar da queda de motilidade e vigor, a literatura demonstra, segundo CONCANNON & BATTISTA (1989), que os mesmos ainda alcançaram índice compatível para a realização de inseminação artificial. Portanto, neste experimento, o diluidor a base de água de coco acrescido de 20% de gema de ovo e 4% de glicerol foi eficiente na manutenção da qualidade do sêmen canino. A literatura demonstra que resultados semelhantes (SEAGER, 1969; OLAR et al., 1989) foram obtidos utilizando-se diferentes diluidores acrescidos das mesmas concentrações de gema de ovo e glicerol deste trabalho. No entanto, nossos resultados diferem de PEÑA et al. (1998), que utilizando um diluidor a base de Tris, encontraram motilidade pós-descongelação mais alta (60%) na presença de 8% de glicerol. Os melhores resultados com o protocolo B foram provavelmente devido a uma associação dos efeitos crioprotetores da gema de ovo e glicerol, que diminuíram a percentagem de danos às células espermáticas causados pelo processo de congelação/descongelação. Tal fato (efeito dos crioprotetores) foi observado por SÁNCHEZ- PARTIDA et al. (1997). A proteção conferida pela gema de ovo ainda não está totalmente esclarecida (ENGLAND, 1993), apesar de ser creditada a ela a estabilização da membrana do Tabela 5. Características microscópicas do sêmen canino (descongelação) no uso de dois diluidores a base de água de coco. Letras diferentes na mesma coluna implicam em diferença estatística significativa (P < 0,05) pelo teste de Mann - Whitney 33

% s p t z m ó v e i s A B F D 1 E Rt a p Da 2s D 1 0 0 7 5 5 0 2 5 0 5 4 V i g 3o r ( 0-5 ) 2 A 1 B 0 F D 1 R D 2 D E t a p a s Figura 1. Motilidade (% sptz móveis) do sêmen canino a fresco (F), após a primeira diluição (D1), resfriamento (R), segunda diluição (D2) e descongelação (D), no uso de dois diluidores a base de água de coco. A (diluidor água de coco); B (diluidor água de coco + 20% de gema de ovo + 4% de glicerol). Figura 2. Vigor (0-5) do sêmen canino a fresco (F), após a primeira diluição (D1), resfriamento (R), segunda diluição (D2) e descongelação (D), no uso de dois diluidoresa base de água de coco. A (diluidor água de coco); B (diluidor água de coco + 20% de gema de ovo + 4% de glicerol). espermatozóide e a manutenção da pressão coloidal do meio extra celular (KOBER, 1985; WATSON, 1990). Quanto ao glicerol, a sua habilidade na transposição da membrana celular, permite a desidratação da célula através da saída de água por osmose (HAMMERSTEDT et al., 1990), evitando a formação de cristais de gelo que poderão promover a ruptura da membrana plasmática do espermatozóide. Provavelmente, o glicerol teve uma maior participação na atividade crioprotetora, visto que, somente após 34

a sua incorporação ao sêmen, foi evidenciada diferença significativa entre os grupos. CONCLUSÕES A adição de gema de ovo e glicerol ao diluidor a base de água de coco foi necessária para a preservação da qualidade espermática durante os processos de congelação e descongelação. Além disso, o diluidor a base de água de coco acrescido de 20% de gema de ovo e 4% de glicerol pode ser utilizado com sucesso para a congelação de sêmen canino visando uma posterior inseminação artificial. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BATT, P. 1992. Canine semen. Artificial Proceedings of Insemination in Dogs. Sydney, Post graduate Comittee, p.4. CARDOSO, R. C. S., SILVA, A. R., UCHOA, D. C.; SILVA & L. D. M. 1998. Efeito da água de coco, gema de ovo e glicerol sobre a qualidade do sêmen canino congelado. In: III Semana Universitária da UECE, Fortaleza, 1998, p.284. CHRISTIANSEN, I. J. 1986. Reprodução no cão e no gato. Ed. Manole, 363p. CONCANNON, P. W. & BATTISTA, M. 1989. Canine semen freezing and artificial insemination. In: SAUNDERS, W.B., Current Vet. Therapy X., Philadelphia, p.1247-1259. ENGLAND, G.C. W. 1993. Cryopreservation of a dog semen: a review. J. Reprod. Fert, 47:243-255. HAMMERSTEDT, R., GRAHAM, J. & NOLAN, J. 1990. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J. Androl., 11:73-88. HERMAN, H. A. & SWANSON, E. W. 1941. Variation in the diary bull semen with respect to its use in artificial insemination. Univ. Mo. Agr. Exp. Sta Bull. 320p, KOBER, C. 1985. Vergleichend Untersuchungen von Verdünnern zur Spermakonservierung bei Schwein, Pferd und Hund unter besonderer Berücksichtigung physikalischer Eigenschaften. Gynäkologischen und Ambulatorischen Tierlinik der Tierärztlichen Fakultät der Universität München, 119p (Tese de Doutorado). MILITÃO, S. F., POSSO, C. S. & SOUZA, F. M. 1994. Avaliação de diluidores alternativos para inseminação artificial em capotes (Numida meleagris). XXIII Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, Olinda, 1994, p. 5 MOURA, C. S., CAVALCANTI, M. O., GUERRA, M. M. P. & TAVARES, P. T. S. 1999. Criopreservação de sêmen canino utilizando diferentes métodos de refrigeração. Rev. Bras. Reprod. Anim., 23:304-305. NUNES, J. F., CIRÍACO, A. L. T. & SUASSUNA, U. 1997. Produção e reprodução de caprinos e ovinos, 2 ª ed., Fortaleza: Gráfica LCR, 199p. NUNES, J. F. & SALGUEIRO, C. C. M. 1999. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de caprinos e ovinos. Rev. Cient. Prod. Animal, 1:17-26. OLAR, T. T., BOWEN, R. A. & PICKETT, B. W. 1989. Influence of extender, cryopreservative and seminal processing procedures on postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws. Theriogenology, 31:451-461. OLIVEIRA, L. F., EVANGELISTA, J. J. F., BEZERRA, M. B. & NUNES, J. F. 1994. Água de coco in natura adicionada ou não de gema de ovo e sob a forma estabilizada de gel como diluidor do sêmen ovino. In: XXIII Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, Olinda, 1994, p. 561. PEÑA, A. I., BARRIO, F, QUINTELA, L. A. & HERRADÓN, P. G. 1998. Effect of different glycerol treatments on frozen-thawed dog sperm longevity and acrossomal integrity. Theriogenology, 50:163-174. QUINTANILHA, A. M. P. N. 1994. Inseminação artificial e sêmen congelado. In: NELSON, R. W.; COUTO, C.G. Fundamentos de Medicina Interna de Pequenos Animais. Rio de Janeiro, p.526 529. ROTA, A., STRÖM, B. & LINDE-FORSBERG, C. 1995. Effects of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 4 º C. Theriogenology, 44:885-900. SALLES, M. G. F. & NUNES, J. F. 1992. Avaliação in vitro do sêmen caprino diluído em água de coco in natura adicionada da fração ativa JYP. Ci. Anim., 2:115-125. SÁNCHEZ-PARTIDA, L. G., SETCHELL, B. P. & MAXWELL, W. M. C. 1997. Epididimal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoa. Reprod. Fertil. Dev., 9:689-696. SEAGER, S. W. J. 1969. Successful pregnancies utilizing frozen dog semen. A. I. Digest., 17:6-7. 35

SILVA, L. D. M. 1995. Procréation médicalement assistée dans l espécie canine - Investigations morpho-fonctionnelles et optimisation des techniques permettant d arriver á la maîtrise de la reproduction. Bélgica. Universidade de Liége, 173p. (Tese de Doutorado). TONIOLLI, R., MESQUITA, D. S. M. & CAVALCANTE, S. G. 1998. Avaliação in vitro do sêmen de suíno diluído em BTS e na água de coco in natura e estabilizada e com BTS. Rev. Bras. Reprod. Anim., 22:198-201. WATSON, P. F. 1990. Artificial insemination and the preservation of semen. In: LAMMING, G.E., Marshall s Physilogy of Reproduction. Edinburgh: Churchill Livingstone, p.772-779. 36