Tópicos Elementos de Microbiologia Introdução à Microbiologia, Morfologia e Estrutura das células, Nutrição Microbiana, Meios de Cultura, Crescimento Microbiano, Controle Microbiano 1 2 Microbiologia Ciência que estuda os micro-organismos Um amplo e diverso grupo de organismos com dimensões microscópicas Podem ser encontrados na natureza como células únicas ou agrupamentos celulares 3 4 Características Importantes dos Microorganismos Microbiologia como Ciência Capazes de realizar seus processos vitais sem depender de outras células Crescimento/Reprodução Geração de energia A microbiologia está associada ao estudo das CÉLULAS VIVAS e ao seu funcionamento Básica: Estuda a natureza fundamental e as propriedades dos micro-organismos (fortemente influenciada pela necessidade de conhecimentosobre mos causadores de doenças) Aplicada: Estudo da aplicação tecnológica dos microorganismos de forma benéfica em diversas áreas (medica, agrícola e industrial). 5 6 1
Ciência Básica Ciência Aplicada Características Morfológicas - forma e tamanho da célula; composição química e função de suas estruturas internas. Características Fisiológicas/Bioquímicas condições ambientais e nutricionais necessárias ao crescimento e reprodução. Características Genéticas genoma Características Ecológicas ocorrência e relação com o ambiente Produção de uma variedade de substâncias de interesse econômico (Ex: ácidos orgânicos,a ntibióticos, enzimas, vitaminas) Processos mais eficientes para o tratamento de efluentes industriais Produção de suplemento alimentar (proteína de célula única - SCP) Produção de biocombustíveis (gás metano e etanol) Exploração da atividade química de micro-organismos em processos de biorremediação (reduzir ou remover poluentes no ambiente) Usados como "inseticidas biológicos", no lugar de produtos químicos Classificação - a relação taxonômica entre os grupos microbianos. 7 8 MICRO-ORGANISMOS COMO CÉLULAS MICRO-ORGANISMOS COMO CÉLULAS Célula: Unidade básica de todos os organismos vivos Todos os organismos celulares correspondem a estruturas organizadas, que apresentam alguma forma de metabolismo Parede celular Membrana Várias estruturas e componentes químicos internamente a membrana que permitem o funcionamento celular. Ex: núcleo ou nucleóide onde abriga a informação genética - DNA Fungo unicelular (levedura) Bactéria 9 Fungo multicelular (bolor) 10 Componentes Químicos das Células Componentes Químicos das Células Ácidos Nucleicos Lipídeos Proteína Proteínas Célula Polissacarídeos Carboidrato; Lipídeo Ác nucleico Água (70 80%) A natureza química e o arranjo destas macromoléculas é o que tornará um mo diferente do outro 11 12 2
Componentes Químicos das Células Principais Características 13 14 15 15 16 16 Posição dos Micro-organismos no Mundo Vivo Classificação de Haeckel 1683 - descoberta das bactérias por Antoni van Leeuwenhoek Bactérias 1864 confirmação da existência de microorganismos (fermentação) por Louis Pasteur Como inserir estes seres vivos na classificação existente? (Reino ANIMAL ou VEGETAL) Protistas Algas Fungos 1866 - E.H.Haeckel (Zoólogo) sugeriu a criação de um terceiro reino denominado de PROTISTA Protozoários 17 18 18 3
A classificação de Haeckel foi satisfatória até que os estudos mais avançados sobre a ultra-estrutura celular (Microscopia Eletrônica) demonstraram a existência de dois tipos estruturais bastante distintos: Eucarióticas Geralmente maiores em tamanho e de maior complexidade estrutural Apresentam suas estruturas internas delimitadas por membrana (organelas). Ex: núcleo Procarióticas Material genético disperso no citoplasma (o material genético (DNA) concentra-se numa dada região chamada de nucleóide) 19 19 20 20 Classificação de Wittaker (5 Reinos) Plantas e algas superiores Fungos e Leveduras Animais R.H. Wittaker (1969) Propôs a expansão da classificação proposta por Haeckel, baseado não só na organização celular, mas também para acomodar os 3 modos principais de Nutrição. REINO PLANTAE Fotossintéticos REINO FUNGI Absorção REINO ANIMALIA Ingestão Fotossíntese Utilização da luz para converter dióxido de carbono em água e açúcares REINO PROTISTA (foto; Abs e Ing) Microalgas, protozoários e fungos limosos Absorção Captação de nutrientes químicos dissolvidos na água Ingestão - Entrada de partículas de alimentos não dissolvidas 21 21 REINO MONERA (absortivos) Procariotos - Bactérias 22 Classificação de Woese e Fox (3 Domínios) Carl Woese e George Fox (1979) estudando as similaridades e diferenças do RNA ribossômico dos micro-organismos descobriu um novo tipo de procarioto (Archaea) Propôs uma nova classificação dos seres vivos: Domínio ou Supra-Reino 23 23 24 4
As arqueobactérias (archeo = antigo / primitivo) Representam um restrito grupo de organismos procariontes que sobrevivem sob condições ambientais extremas (metanogênicas; termoacidófilas e halófilas) Manifestam características que as diferenciam das eubactérias (eu = verdadeiro), de acordo com a estruturação de algumas moléculas como: ácidos nucleicos (RNA ribossômico) e elementos integrantes da membrana plasmática e parede celular. Metanogênicas caracterizadas pelo metabolismo anaeróbio utilizam o elemento químico hidrogênio como co-fator de reações que catabolizam o gás carbônico (CO2) em metano (CH4). Termófilas são arqueobactérias que sobrevivem em temperaturas altíssimas, (atingindo cerca de 100 C) e acidez muito baixa, representando os ambientes aquáticos situados próximos à falhas na crosta oceânica (fendas vulcânicas). Esses organismos realizam quimiossíntese, utilizando compostos inorgânicos (ácido sulfídrico H2S) para sintetizar matéria orgânica e obter energia. Halófitas bactérias primitivas que vivem em locais com alta concentração de sal, em que a solução do meio (ambiente aquático) é extremamente hipertônica, por exemplo, a salinidade do Mar Morto. 25 25 26 26 Bactérias 27 27 28 28 São micro-organismos PROCARIOTOS A maioria UNICELULAR Forma simples (apesar dos 4 bilhões de anos que tem evoluído) Muitas possuem sistema de locomoção (flagelos) Reprodução assexuada (fissão binária) Variedade de tamanho e forma Utilização de nutrientes por absorção Diversidade (ocorre em todos ambientes do planeta onde exista H 2 O) Morfologia e Estrutura Tamanho: 0,5 a 1,0 µm (visualizadas em microscópio em uma magnitude de 1000 X) Forma: Esféricas ou ovalada (cocos): 0,8µm Cilíndricas (bacilos): 1 x 3 µm Espiraladas (bacilos curvos) (espirilos): Formas incomuns: espiroquetas, apendiculadas e filamentosas Grande importância industrial 29 29 30 30 5
31 31 32 32 Algumas das propriedades biológicas (taxas metabólicas e de crescimento) são afetadas pelo seu pequeno tamanho. Ex: A velocidade da entrada de nutrientes e saída de produtos de uma célula é inversamente proporcional ao seu tamanho. Como a velocidade de transporte é uma função da área superficial da membrana, e se comparadas ao volume; células pequenas apresentam maior relação entre área superficial:volume (S/V). 33 34 Estrutura Bacteriana As técnicas de microscopia revelaram que a célula tem uma diversidade de estruturas funcionando juntas. Algumas, encontradas externamente fixadas a parede celular e outras internamente Fundamentais Parede Celular Membrana Celular Mesossoma Ribossoma Genoma 35 35 36 36 6
Estrutura Bacteriana Estruturas Auxiliares Flagelo Auxiliares Pili Capsula Grânulo de Inclusão Endósporo Flagelos 37 37 38 Os flagelos são apêndices longos e sinuosos Estruturas Auxiliares Função: responsáveis pela locomoção; Participa da Quimiotaxia e Fototaxia (movimento a estímulos) Constituição Química: proteínas (flagelina) Teoria da Locomoção: cadeias protéicas contraem e relaxam alternadamente, fazendo assim um movimento ondulatório que puxa e empurra o mo. * Em Archaea, os tipos de flagelina e estrutura do flagelo são diferentes das Bactérias. (incomuns em cocos) Pili ou Fimbrias 39 39 40 40 Os pilis, são apêndices curtos e retilíneos, sem qualquer envolvimento na locomoção; Comuns em bactérias Gram negativas Estruturas Auxiliares Função: Aderência Específica (Fatores de Colonização); Aderência para a Conjugação Bacteriana (transferência de plasmideos). Ex.Pili Sexual Constituição Química: proteínas Glicocálice 41 41 42 7
A glicocálice é uma camada de material viscoso que envolvem as células bacterianas (polissacarideos ou peptídeos) Se a camada estiver bem organizada e rigidamente acoplada a parede celular (Capsula) Se estiver desorganizada, sem forma e acoplado frouxamente à parede celular (Camada limosa) A determinação dos constituintes da cápsula é normalmente um passo importante na identificação de certas bactérias patogênicas. Ex: o Bacillus anthracis (antrax)possui material capsular de natureza polipeptídica formado por ácido glutâmico. Os esporos desta bactéria podem ser usados em ataques bélicos Função da glicocálice Aderência: é a principal delas (em pedras onde passa água em grande movimento; em raízes de plantas; na superfície lisa dos dentes humanos provocando a cárie); Proteção (contra dessecamento temporário) devido ao grande número que grupos polares na molécula que podem ligar a água. Evitar a adsorção e lise das células por bacteriófagos que são vírus que atacam as células (protege da fagocitose) Reserva Nutritiva: Fonte de alimentos *Sob o aspecto industrial podem ser uma praga. Elas são responsáveis pelo acúmulo de lodo nos equipamentos, o que pode entupir filtros e tubos afetando a qualidade final do produto. 43 44 Grânulos de Inclusão São substâncias químicas que se acumulam intracelularmente formando depósitos insolúveis. Geralmente utilizados como material de reserva e fonte de energia;. Os grânulos de inclusão não são comuns a todas as células bacterianas. Grânulos Lipídicos: formados de poli-ß-hidroxibutirato (PHB) - material lipídico solúvel em clorofórmio. Grânulos Inorgânicos formados de polifosfato Grânulos Polissacarídicos (amido; glicogênio); 45 Endósporo Bacteriano Esporos que se formam dentro da célula e são exclusivos das bactérias (gram positivas). Sua principal função é a proteção. Durante o processo de esporulação ocorre desidratação celular, o que também contribui para a sua elevada resistência ao calor; Possuem parede celular espessa, brilham muito com a luz do microscópico, e são altamente resistente às mudanças ambientais - a maioria suportam ate 80 o C/10min; São muito relevantes para áreas de Medicina e indústria alimentícia, principalmente pelo fato de serem resistentes ao calor e à esterilização química, quando comparados com células em estado vegetativo 46 Endósporo Bacteriano Estruturas Fundamentais Parede Celular 47 47 48 8
Composição mureína: da Parede celular: peptideoglicano ou O peptideoglicano é um heteropolissacarídeo composto pelo ácido N-acetil-murâmico e N-acetilglucosamina) com cadeias laterais tetrapeptidicas Função: manutenção da forma bacteriana; proteção osmótica da bactéria. Previne o rompimento das células devido à entrada de água; serve como uma barreira a algumas substâncias prevenindo a evasão de certas enzimas que poderiam causar danos à célula As paredes celulares não são homogêneas (possuem camadas de diferentes substâncias que variam de acordo com o tipo de bactéria envolvida, diferindo em espessura e composição). A composição da parede celular de bactérias permite a classificação de 2 grupos distintos de bactérias: Gram+ e Gram-; Método de coloração diferencial Técnica de Gram: 49 50 Características Gram-Positivas Gram-Negativas Teor de Peptídeoglicano (PPG) Resistência Outros Componentes Elevado (15-50% da parede) Menor resistência (pode ser destruída completamente por certas enzimas) Ácido teicóico (antígenos) Baixo ( 5%) Maior resistência Membrana externa (lipopolissacarídeo) cobrindo o PPG Acido teicóico - polímero de glicerol e ribitol fosfato; carregados negativamente pode ajudar no transporte de íons para dentro e fora da célula; e no armazenamento de fósforo. Se encontram ligados ao peptidioglicano ou à membrana citoplasmática. 51 52 52 Mecanismo de Coloração de Gram MEMBRANA CELULAR Composição: bicamada fosfolipídica (lipídeos formados por uma molécula de glicerol, duas cadeias de ácidos graxos (saturado e insaturado) e um grupo fosfato através de ligações do tipo éster, com proteínas entremeadas. 53 54 54 9
Funções: Permeabilidade Seletiva; Transporte Ativo; Respiração Celular MEMBRANA CELULAR Normalmente, as membranas de organismos procariotos apresentam maiores concentrações de proteínas que as membranas eucarióticas, tendo em vista a ausência de organelas citoplasmáticas nas bactérias. As membranas de muitas bactérias estendem-se no citoplasma para formar túbulos chamados MESOSSOMOS Pode ser uma forma da bactéria de aumentar a superfície da membrana celular, potencializando as funções executadas por ela 55 55 56 56 Ribossomos Os ribossomos são partículas densas dispersas no citoplasma composto por RNA Ribossômico (RNAr); São encontrados em todas as células procarióticas e eucarióticas. Podem estar livres no citoplasma ou associados a MC; O citoplasma tem em torno de 80% de água, além de ácidos núcléicos, proteínas, carboidratos, lipídeos, íons inorgânicos, muitos compostos de baixo peso molecular, e partículas com várias funções S= unidade de quão rápido a partícula sedimenta quando centrifugada em alta velocidade Em bactérias consistem em 2 subunidades de tamanhos diferentes (50S e 30S), que juntas formam o ribossomo bacteriano 70S (isto porque o IS depende do tipo e tamanho). Sua principal função é a síntese proteica 57 57 Os ribossomos são alvos de antibióticos que inibem a síntese de proteínas (ex: estreptomicina e tetraciclina) 58 Genoma Bacteriano Estrutura e Composição: DNA Pode ocupar até 20% da área do citoplasma Função: Armazenamento das informações genéticas As arqueobactérias possuem uma membrana celular com lipídeos compostos de uma associação de glicerol-éter, enquanto que os das eubactérias e eucariotos são compostos de glicerol-éster; Ao contrário das bactérias, os Archaea não possuem uma parede celular de peptidoglicanos. Finalmente, o flagelo dos Archaea é diferente em composição e desenvolvimento do das bactérias. 59 59 60 60 10
Reino Fungi Fungos Fungos Limosos Fungos Inferiores Flagelados Fungos Terrestres (espécies mais conhecidas) São reconhecidos 3 principais grupos de fungos: Bolores (Penicillium sp. Aspergillus sp) Cogumelos(Agaricus sp, Pleurotus sp) Leveduras (Saccharomyces sp, Candida sp) Fungo multicelular (Bolores) Ex.Aspergillus sp Fungo multicelular (cogumelos) Ex.Agaricus sp Fungo unicelular (levedura) Ex.Saccharomycessp 61 61 62 CARACTERISTICAS GERAIS DOS FUNGOS São micro-organismos Eucariontes São heterotróficos e assimilam nutrientes por absorção Não realizam a fotossíntese (não possuem clorofila) Parede celular formada por quitina(com exceção aos fungos limosos) Reprodução assexuada e sexuada Multicelulares (maioria) e unicelulares 63 Hifas = filamentos tubulares microscópicos (septadas ou não septadas) Micélio = conjunto de hifas frouxo (bolores) ou compactos (cogumelos); 64 Tipos de Hifas Reprodução de Fungos Assexuada Brotamento (leveduras) Esporos(formados em estruturas internas ou nas extremidades das hifas) Sexuada Esporos (fusão de núcleos e meiose) 65 65 66 11
Reprodução de Fungos Reprodução assexuada Brotamento de levedura (Saccharomyces cerevisiae) Formação de esporos esféricos (conidiósporos) nas extremidades de uma hifa especializada, o conidióforo (Penicillium sp) 67 68 68 Reprodução Sexuada Reprodução Sexuada Esquema da formação de ascósporos 69 Esquema da formação de basidiósporos 70 Tabela 14.2 Classificação e principais propriedades dos fungos Grupo Nome comum Hifas Representantes típicos Ascomicetos Fungos com Septadas estrutura em forma de saco Basidiomicetos Fungos com estrutura em forma de clava, cogumelos Zigomicetos Bolores de pão Septadas Neurospora, Saccharomyces, Morchella ( moráceas ) Amanita (cogumelo venenoso) Agaricus (cogumelo comestível) Cenocíticas Mucor, Rhizopus (bolor comum de pão) Tipo de esporo sexual Ascósporo Hábitat Solo, matéria vegetal em decomposição Basidiósporo Solo, matéria vegetal em decomposição Zigósporo Solo, matéria vegetal em decomposição Doenças comuns Doença do olmo holandês, praga da castanha, ferrugem das gramíneas, apodrecimento Haste negra, ferrugem do trigo, alforra do milho Deterioração de alimentos; raramente envolvido em doenças parasitárias Oomicetos Bolores de água Cenocíticas Allomyces Oósporo Aquático Praga da batata, certas doenças em peixes Deuteromicetos Fungos imperfeitos Septadas Penicillium, Aspergillus, Candida Nenhum conhecido Solo, matéria vegetal em decomposição, superfície de corpos de animais Murchamentode plantas, infecções de animais como tínea, péde-atleta, infecções superficiais ou sistêmicas (Candida) 71 71 72 72 12
Parede Celular Confere resistência as pressões osmóticas e mecânicas Estrutura Fúngica Natureza: polissacarídica (80 a 90%) contendo tb proteínas, lipídeos, polifosfatos e íons inorganicos. Nos Bolores o polissacarídeo estrutural é a quitina (é um polimero de N-acetilglicosamina, um derivado de glicose) Nas Leveduras o polissacarídeo estrutural é o glicano e manano. 73 73 74 Membrana Citoplasmática Organelas Celulares Estrutura lipoproteica: Constituída por uma camada dupla de fosfolipídios e um arranjo de proteínas embebidas na bicamada lipídica (regula troca com o meio ambiente) A membrana plasmática dos fungos apresentam o ergosterol como o principal esterol da membrana plasmática. Os esteróis da membrana conferem estrutura, modulação da fluidez e possivelmente controlam alguns eventos fisiológicos. Mitocôndrias Retículo Endoplasmático (RE) Complexo de Golgi Peroxissomos Núcleo 75 75 76 76 Mitocôndrias As mitocôndrias são responsáveis pela conversão aeróbica de energia (síntese de ATP) Diâmetro de 0,5 a 1 µm e comprimento de até 3 µm. A ME é desprovida de esteróis (menos rígida do que a MC). Apresenta numerosos canais que são responsáveis pela passagem do ATP para o citoplasma. 77 77 78 78 13
Retículo Endoplasmático (RE) O retículo endoplasmático constitui uma rede de membranas, próximas a membrana nuclear. RE liso (não possui ribossomas): síntese de lipídeos, glicogênio e esteroides. RE rugoso (possui ribossomos): síntese de glicoproteinas e componentes de membrana que são transportados por toda a célula. 79 79 80 80 Complexo de Golgi O CG consiste em um conjunto de membranas empilhadas que atuam juntamente com o RE. Empacotamento de certas enzimas sintetizadas pelo RE rugoso (proteases, nucleases, lípases etc.). Proteção da célula ao ataque de suas próprias enzimas. Responsável pelo transporte seguro dos compostos sintetizados para o exterior das células Contem enzimas glicosil transferases que unem moléculas de carboidratos com proteínas (glicoproteinas) 81 81 82 Peroxissomos Os peroxissomos são bolsas membranosas esféricas (0,5 a 1 µm de diâmetro) que contém inumeras enzimas; Função oxidativa/respiratória (não conserva energia na forma de ATP) Oxidação de ácidos graxos e aminoácidos Possuem grandes quantidades da enzima catalase - degradação do H2O2 (destoxificação celular), 83 83 84 84 14
Núcleo NUTRIÇÃO MICROBIANA Organela bem definida, circundada por um par de unidades de membrana. Contem o genoma celular; Contem um corpúsculo chamado de nucléolo, rico em RNAr. Mecanismo que fornece às células as ferramentas químicas (NUTRIENTES) necessárias à síntese dos diversos monômeros. 85 85 86 86 Macronutrientes: (C,N,P,S,K,Mg,Ca,Na) Uma célula típica contem cerca de 50% de carbono e 12% de nitrogênio (em peso seco) Micronutrientes (elementos traços), embora requeridos em pequenas quantidades, são de fundamental importância para as funções celulares como os macronutrientes Ex: Cr,Co,Cu,Mn,Mo,Ni,Fe,Zn Fatores de Crescimento: São definidos como compostos orgânicos que alguns tipos de mos necessitam de quantidades muito pequenas. Ex: vitaminas, amino ácidos, etc Os 4 elementos mostram uma boa aproximação da composição da biomassa CH O N α β δ 87 87 88 88 Substrato C H O N w Bactéria : CH Levedura : CH x ao 2 g h y Nitrogênio bh O N i z 1,66 1,75 N N 0,2 O 0,15 Célula 0,27 O 0,50 cc H Massa molecular Massa molecular Biomassa α O dco 2 eh 2 O Produto j k β l N fc H O N δ m = 20,7 = 23,9 89 89 Elemento Função ou constituinte Bactérias Leveduras Fungos filamentosos Carbono FC energia 46-52 45-50 40-63 Nitrogênio Proteínas, 10-14 5-9 3-7 ac.nuceicos, polímeros da parede Hidrogênio 8-12 8-12 8-12 Oxigênio 18-24 18-24 18-24 Fósforo Ac nucléicos, 2-3 0,8-2,5 0,4-4,5 fofolipídeos, polímeros da parede Enxofre Aa, biotina, 0,1-1,0 0,01-0,25 0,1-0,5 coenz A Potássio RNA, co-fator 1,0-4,5 1,0-4,0 0,2-2,5 Sódio 0,5-1,0 0,01-0,1 0,02-0,5 Cálcio Esporos bac, 0,01-1,0 0,1-0,3 0,1-1,4 co-fator Magnésio Ribossomos, 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,5 co-fator Ferro Citrossomos, 0,02-0,2 0,01-0,5 0,1-0,2 co-fator Proteínas 50-60 35-45 25-40 Carboidratos 6-15 30-45 40-55 Lipídios 5-10 5-10 5-10 Ac. Nucléicos 15-25 5-15 2-10 Cinzas totais 4-10 4-10 4-10 90 90 15
Como são fornecidos estes elementos? Classificação do Meios de Cultura Constituintes Químicos Estado Físico Finalidade Sintéticos (Definidos) Líquidos Seletivos Meios de Cultura Complexos (Naturais) Sólidos Diferenciais Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de promover o crescimento de micro-organismos, em condições de laboratório. 91 91 92 92 Constituintes Químicos Meios de cultura sintéticos ou definidos composição química é totalmente conhecida. Meios de cultura complexos - composição química não é totalmente definida, pois apresentam ingredientes cuja formulação não se conhece a exata composição (peptonas, extrato de levedura). 93 93 94 94 Estado Físico TÉCNICA ASSEPTICA Meios de cultura líquidos: Apresentam-se como caldos. (ativação de culturas) Meios de cultura sólidos: Contém agentes solidificantes, como o ágar com cerca de 1.5-2% p/v.(conservação de culturas) 95 95 96 16
Seletivo contém substâncias que inibem o crescimento de determinados grupos de micro-organismos, permitindo o crescimento de outros. Diferencial contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre micro-organismos muito parecidos Seletivo/Diferenciall Finalidade 97 Exemplo de meio seletivo: Agar verde brilhante permite a identificação de Salmonella (G-) causadora de infecções alimentares. O meio contendo o corante inibe as bactérias G+ que são habitantes comuns no trato intestinal (sem afetar G-). Exemplo de meio diferencial: Agar de sangue Permite a distinção entre bactérias do gênero Streptococcus atraves do padrão de hemólise (α β γ) Streptococcus pneumoniae (causadora de pneumonia) lisa parcialmente os glóbulos vermelhos do sangue padrão α Streptococcus pyogenes (causadora da faringite) lisa completamente os glóbulos vermelhos do sangue produzindo halos transparentes à volta das colônias padrão β Streptococcus mutans (causa cárie dentária), não é hemolítica padrão γ. 98 98 Ágar MacConkey (seletivo e diferencial) Destinado ao crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose Considerações Importantes Um dos fatores mais importantes na otimização de um processo fermentativo (bioprocesso) é a composição do meio. Satisfazer as necessidades nutricionais (máximo rendimento) As bactérias fermentadoras de lactose, utilizam a lactose disponível no meio e produzem ácido como produto final. Este ácido diminui o ph do meio para valores inferiores a 6.8, resultando na observação de colônias rosa choque/vermelhas. 99 99 Minimizar os custos Planejamento de Experimentos 100 METABOLISMO MICROBIANO É o conjunto de todas as reações catalisadas enzimaticamente que ocorrem dentro das células. Cada sequencia da reação é uma rota metabólica e os produtos destas reações são os metabólitos. Do ponto de vista da Engenharia Bioquímica, as reações importantes são aquelas que produzem substâncias bioquímicas em quantidades superiores as necessidades das células. 101 101 102 102 17
Catabolismo é a fase de degradação do metabolismo, as moléculas orgânicas tais como carboidratos, lipídeos e proteínas são degradados até produtos finais tais como: ácido lático, acético, CO 2, etc. Liberação de energia ATP. Opções metabólicas para obtenção de energia Anabolismo é a fase de construção do metabolismo, moléculas pequenas irão formar componentes moleculares relativamente grandes tais como polissacarídeos, lipídeos e proteínas. Requer energia livre ATP. 103 103 104 Fototróficos: possuem pigmentos fotossintéticos que permitem a utilização da luz como fonte de energia. Ex.: algas e bactérias fotossintetizantes. Quimiolitotróficos: obtêm energia a partir da oxidação de um substrato inorgânico, geralmente específico para o microrganismo em particular, como hidrogênio, enxôfre, amônia, nitritos e sais ferrosos. Ex.: bactérias dos gêneros Thiobacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, Hydrogenomonas e Desulphovibrio. Quimiorganotróficos: obtêm energia a partir do catabolismo de substratos orgânicos, açúcares em particular. A este grupo pertence a grande maioria dos microrganismos utilizados industrialmente. 105 105 A energia obtida pela célula a partir de substâncias nutritivas do meio ou da luz solar é utilizada na realização de: Trabalho químico (biossíntese de proteínas, ácidos nucleicos, lipídeos, polissacarídeos e vários outros componentes celulares) Trabalho osmótico (transporte de substâncias nutritivas através da membrana celular) Trabalho mecânico (contração e locomoção) 106 106 FONTE DE CARBONO Classificação Nutricional dos Micro-organismos Autotróficos: Utilizam CO 2 fonte de carbono como única Compostos químicos Quimiotróficos (organotróficosou litotróficos) Fonte de Energia Luz Fototróficos Heterotróficos: Utilizam substancias organicas como fonte de carbono (glicose) Compostos orgânicos Fonte de Carbono CO 2 Compostos orgânicos Fonte de Carbono CO 2 Quimioheterotrófico Quimioautotrófico Fotoheterotrófico Fotoautotrófico 107 107 108 18
Requerimentos Ambientais Temperatura Para que ocorra o crescimento celular, além do fornecimento adequado das substâncias nutritivas (Meio de Cultivo), deve-se conduzir o processo sob condições ambientais apropriadas 1.Temperatura 2.pH 3.[solutos] 4.[O 2 ] Os valores ótimos para crescimento podem ser diferentes do ótimo para produção de metabólitos. 109 109 A atividade microbiana (crescimento) é dependente de reações químicas que são afetadas pela temperatura. Variações térmicas influenciam nos processos metabólicos e morfologia celular. Classificação em 3 grandes grupos, no que se refere a temperatura ótima de crescimento. 110 110 Classificação em resposta a temperatura Psicrófilos Crescem na faixa de 0 C a 20 C, com um ótimo em torno de 10 C Se a temperatura é muito alta, certas enzimas e/ou a membrana citoplasmática podem ser danificadas. Mesófilos Crescem na faixa de 5 C a 50 C, com um ótimo entre 25 C e 40 C. A maioria dos mos de interesse são mesófilos. Termófilos Crescem na faixa de 35 C a 90 C, com um ótimo em torno de 60 C. mos encontrados em áreas vulcânicas e em nascentes quentes. A maioria desses mos são procarióticos, não se conhece eucarióticoquecresçaacimade60 o C. 111 111 112 112 Classificação em resposta ao oxigênio Os microrganismos também se diferenciam em função de suas exigências de oxigênio: Estritamente aeróbios: desenvolvem-se unicamente em presença de O 2 (Streptomyces sp) e a maioria dos fungos filamentosos; Estritamente anaeróbios: desenvolvem-se unicamente na ausência de O 2 (Clostridios sp); Facultativos: desenvolvem-se em situação de aerobiose e anaerobiose (leveduras industriais); Microaerófilos: crescem na presença de diminutas concentrações de oxigênio livre. Não resistem aos níveis de O 2 atm (21%). 113 113 114 114 19
ph Aacidezoualcalinidadedeumasoluçãoéexpressapor seu ph, em uma escala na faixa de 0 a 14 onde a neutralidade corresponde ao ph = 7,0. É importante lembrar que o ph é uma função logarítmica, ou seja: a alteração de 1 unidade de ph representa uma variação de 10 vezes na concentração de íons hidrogênio. Crescimento aeróbio (a); anaeróbio (b); facultativo (c); microaerófilo (d) e anaeróbios aerotolerantes (e). 115 115 Assim como para a temperatura, existe um valor ótimo de ph para o crescimento dos micro-organismos dentro de limites mínimos e máximos. 116 116 As bactérias suportam variações de ph do meio na faixa de 4,0 a 9,0, com valores ótimos entre 6,5 e 7,5. Os fungos suportam variações na faixa de 2,0 a 8,0. No caso de bolores, o ph ótimo situa-se em 5,6, enquanto as leveduras tem o crescimento favorecido em ph 4,0-4,5. Organismos que crescem em phs baixos ou elevados são conhecidos como acidófilos (ph <1) e alcalifílicos (ph>9). Considerações Importantes sobre o ph Durante o cultivo de um micro-organismos, podem ocorrer alterações no ph do meio, como resultado das atividades metabólicas que consomem ou produzem substâncias ácidas ou básicas. As variações de ph podem ser contornadas de duas maneiras: 1. Uso de soluções tampão apropriados: tampão fosfato KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 2. Adição de ácido ou base ao sistema: HCl ou NaOH 117 117 118 118 Efeitos Osmóticos no Crescimento Microbiano Limite de Solubilidade para Solutos Comuns Aáguaéosolventeuniversaldavida A disponibilidade de água é também função da concentração de solutos, como sais açúcares e outros A atividade de água é expressa em termos físicos como atividadedeágua(a w ). Os valores de (Aw) variam de 0 a 1 (Ex: a água pura tem a w = 1,Cereais,balasefrutassecastemA w =0,70. 119 119 120 120 20
Os mos que suportam certo grau de redução na A w são chamados de HALOTOLERANTES Os mos que apresentam crescimento ótimo em meio com baixaatividadedeágua(concentraçãodesalde2a4%)são denominados HALÓFILOS (halófilos extremos podem cresceremmeioscontendode15a30%denacl) Os mos capazes de sobreviver em ambientes ricos em açúcar são denominados OSMÓFILOS Limite mínimo de A w para os diferentes tipos microbianos Micro-organismos A w mínima Maioria das bactérias 0,88 0,90 Maioria das leveduras 0,88 Maioria dos bolores 0,80 Bactérias halófilas 0,75 Leveduras osmófilas 0,60 0,62 121 121 122 122 Requerimentos Ambientais Crescimento Microbiano As células microbianas quando cultivadas em sistemas fechados (reatores, frascos ou tubos) contendo meio de cultura líquido onde nenhum nutriente é adicionado ao sistema e nenhum produto é removido chamamos de Cultura em Batelada. As células inicialmente se dividem e o número de células aumenta por um período de tempo. Este aumento cessa quando os nutrientes são esgotados ou quando os produtos formados se acumulam em quantidades suficientes para interromper o crescimento (intoxicação pelos produtos). 123 123 124 124 Curva Típica do Crescimento Microbiano Medidas do Crescimento Microbiano 1. Determinação da massa seca ou úmida Medida da massa das células São necessárias amostras relativamente grandes Não se aplica a baixas densidades celulares Podem ocorrer perdas durante o processo de lavagem das células Não se aplica quando o meio contém partículas sólidas 2. Determinação Química dos componentes celulares Dosagem de proteínas e ácidos nucleicos Aplicáveis a pequenas amostras (sensíveis e precisos) 125 125 126 126 21
Medidas do Crescimento Microbiano Turbidimetria 3. Turbidimetria Medida da turvação do meio(absorbância em espectrofotômetro) Aturvaçãoestárelacionadacomamassasecadascélulas(LeideLambert-Beer) Permite a construção de curvas de calibração para um conjunto de condições experimentais As equações de correlação são fundamentais para a determinação da massa de células através da medida de absorbância com o tempo 4. Determinação do Número de células em uma suspensão Contagem do número total (amostras são colocadas em câmaras de contagem Neubauer e leitura é feita em microscópio). Os resultados são expressos em Número de células por ml. Contagem do número de viáveis (semeadura das amostras através de seu espalhamento em meio sólido). As colônias formadas serão contadas e os resultados expressos em Unidade Formadora de Colônias por volume de amostra (UFC/mL) As leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectrofotometria. Elas são tratadas simultaneamente, processo no qual a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada solução depende da concentração do soluto e da espessura da solução (l). A= α l c Onde: A= absorbância α= absortividade molar l= distância que a luz atravessa pelo corpo - caminho óptico (1 cm) c = Concentração da solução 127 127 128 128 Lei de Beer-Lambertt Curva de calibração de massa seca (λ) Para os micro-organismos em geral o valor de λ máx é de 500-600 nm. Relação entre a absorbância e a concentração celular de Pichia stipitis cultivada em hidrolisado hemicelulósico da palha de arroz in natura. 129 129 130 130 Câmara de Contagem Câmara de Contagem Volume total do quadrante central da câmara de Neubauer é de 0,1 mm3 Volume de cada quadrado vermelho 0,004mm3 é de Volume de 1 quadrado vermelho =4 x 10-6 ml Volume de 5 quadrados vermelhos = 2 x 10-5 ml 1 ml = 1cm3 1cm3 = 10x10x10 mm3 = 1000mm3 Como a contagem é feita em 5 quadrados vermelhos, os resultados expressos em Número de Células/mL será dado pela equação: Númerodecélulas = celulas nos5quadrados vermelhos x fator dediluição ml Volume dos5quadrados vermelhos Númerodecélulas 4 = celulas nos5quadrados vermelhos x5x10 x fator de diluição ml 131 131 132 132 22
Contagem de Células Viáveis Contagem de Células Viáveis UFC Númerodecolonias formadas = x fator dediluição ml Volumeda amosta O ideal é contar de 30 300 colônias 133 133 134 134 Contagem de Células Viáveis Curva Típica do Crescimento Microbiano O ideal é contar de 30 300 colônias Água potável < 500 UFC/mL 300 7 UFC Número de viáveis = x10.000= 3x10 0,1 ml 135 135 136 136 Fase Lag Fase Log Nesta fase as células estão fisiologicamente ativas e sintetizando novas enzimas para se adaptarem ao meio novo. A contagem não revela aumento do número de células, mas a massa pode aumentar como reflexo do aumento do tamanho da célula. Esta fase ocorre quando as células do inóculo provem de cultura velhas ou quando as células do não são cultivadas em meios adequados. Nesta fase a velocidade de crescimento (dx/dt) é zero 137 137 As células estão em condições de crescimento balanceado (aumento ordenado de todos os constituintes). Não há limitação de nutrientes As células são aproximadamente uniformes em termos de composição química, atividades metabólicas e fisiológicas. É a fase mais importante para estudos de fisiologia e cinética Há um aumento exponencial do número de células com o tempo A velocidade de crescimento (dx/dt) é proporcional a concentração de micro-organismos 138 138 23
Fase Log Fase Estacionária Tratando os micro-organismos como bactérias que se multiplicam por divisão binária, temos: N = N0. 2 n log N = log N0+ n log 2 N = número de micro-organismos ao final de n divisões (gerações) N 0 = número inicial de micro-organismos log N log N0 n= log 2 A velocidade exponencial de crescimento (R) pode ser expressa pelo número de gerações na unidade de tempo: R n = A recíproca de R é o tempo de geração t t 0 1 t t = tg = R n 0 Nesta fase o número de células novas é igual ao número de células que morrem. Acúmulo de metabólicos tóxicos e/ou exaustão de nutrientes e limitação de oxigênio. A duração desta fase varia consideravelmente com as condições do cultivo A velocidade de crescimento (dx/dt) é zero 139 139 140 140 Fase de Morte (ou declínio) Taxonomia Nesta fase, o número de organismos que morre tornase muito superior em relação aos que surgem. O número de viáveis diminui de forma exponencial. Organização Classificação Nomenclatura Completa exaustão de nutrientes e acúmulo de metabólitos inibitórios. A velocidade de crescimento (dx/dt) é negativa Baseada em 7 níveis descendentes Reino Divisão Classe Ordem Família Gênero Espécie É o arranjo dos micro-organismos em grupos obedecendo relações evolutivas É o processo de dar nomes as espécies existentes. É latino binomial combinando o nome genérico (gênero) seguido da espécie Ex: Saccharomyces cerevisiae gênero espécie 141 141 142 142 Bibliografia Biotecnologia Industrial. Willibaldo Schmidell; Urgel de Almeida Lima; Eugenio Aquarone; Walter Borzani (Coordenadores). Volume 1. Engenharia Bioquímica. 2001. Editora Edgard Blucher. Microbiologia de Brock - Michael T. Madigan; John M. Martinko & Jack Parker. 10ª Edição. 2004. Editora Pearson Education, Inc. 143 143 24