INSTITUTO POLITÉCNICO DE LEIRIA ESCOLA SUPERIOR DE TURISMO E TECNOLOGIA DO MAR PROTOCOLO EXPERIMENTAL - 3 Ano Letivo 2013/2014 Disciplina: Reprodução em Aquacultura Ano: 1º Curso: CET Aquacultura e Pescas Semestre: 2º Trabalho Prático: Fecundação e desenvolvimento embrionário de Ouriço do Mar 1) Introdução Os ouriços-do-mar inserem-se na classe Equinoidea, filo Echinodermata. São animais que apresentam, habitualmente, a superfície corporal coberta de espinhos móveis. O corpo é de forma esférica, podendo ser relativamente achatado e possuem um esqueleto rígido. Tal como outros elementos do mesmo filo, tendem a apresentar simetria pentarradiada (apesar de existirem fases da vida em que a simetris é bilateral), e sistema ambulacrário. Uma característica com funções de alimentação a lanterna de Aristóteles constituído por cinco placas calcárias, fazendo cada uma parte de uma mandíbula interna (ver figura 1). Figura 1 - Representação esquemática do um ouriço do mar (http://karol-biologia.blogspot.com/) O desenvolvimento embrionário é um dos estudos mais fascinantes da biologia do desenvolvimento. O tipo de desenvolvimento de um animal depende, não só da quantidade de vitelo que existe no ovo, como da sua posição e distribuição. Nos ovos do ouriço-do-mar a quantidade de vitelo é pequena e encontra-se distribuída homogeneamente por todo o citoplasma. Apesar de possuírem sexos separados, ou ouriços-do-mar não apresentam dimorfismo sexual externo. O sexo só pode ser determinado após a libertação dos gâmetas. Os óvulos e espermatozóides são libertados na água através dos gonóporos (localizados na região aboral lado onde está o ânus); a fecundação ocorre, portanto, no meio externo. Cada fêmea produz, aproximadamente, um bilião de óvulos e cada macho produz vários biliões de
espermatozóides. Geralmente os gâmetas são libertados sincronicamente, o que aumenta a probabilidade de que a fecundação ocorra. Os embriões e larvas desenvolvem-se no plâncton. 2) Objectivo Neste trabalho será observada a fecundação bem como os primeiros estádios de desenvolvimento embrionário do ouriço-do-mar após ter sido provocada a libertação dos gâmetas injectando cloreto de potássio (KCl) a 0,5 M na cavidade do corpo. 3) Actividade Laboratorial Listagem de Material Necessários Ouriços do Mar (Paracentrotus lividus) Solução de cloreto de potássio (KCl) a 0,5M Seringas de 2mL gobelés Pipetas de Pasteur Lâminas escavadas Lamelas de vidro Microscópio Óptico Os ouriços-do-mar podem ser apanhados manualmente durante as marés baixas ou por mergulho livre. Após a colheita devem ser levados para laboratório e transferidos para tanques ou aquários com arejamento contínuo, procedendo a uma renovação parcial da água diariamente. a) Indução da Desova dos Gâmetas 3.1. Remova cuidadosamente o indivíduo do aquário e lave a superfície do animal com água do mar, para remoção de fezes e outros detritos. 3.2. Injecte com cloreto de potássio (KCl 0,5M) até cerca de 2ml no celoma do ouriço-do-mar. É necessário ter cuidado para inserir a agulha da seringa nas partes laterais da boca da lanterna de Aristóteles (ver figura 2 A). 3.3. Abane ligeiramente os animais e passado alguns minutos será possível observar a cor dos gâmetas que se libertam. O cloreto de potássio causa a contracção dos músculos das gónadas e, por consequência, a desova dos gâmetas através dos gonopóros. 3.4. Inverta o animal (o ânus deve estar virado para baixo isoladamente em gobelés com água do mar filtrada e aguarde (Ver figura 2B): - Se os gâmetas forem cor de laranja são óvulos. - Se os gâmetas forem de cor branco-sujo são espermatozóides. Assim que a desova dos gâmetas tiver terminado, pode colocar os ouriços-do-mar num aquário.
Figura 2 A) injecção do KCl nos indivíduos; B) Desova de uma fêmea b) Observação dos Gâmetas 3.5. Mexa levemente a suspensão e retire algumas gotas com a pipeta de plástico (é possível reconhecer os óvulos ao olho nu). Os óvulos submersos na solução de água do mar irão flutuar até ao fundo. 3.6. De seguida, coloque uma gota da suspensão na cavidade da lâmina e cubra com uma lamela, e observe os óvulos ao microscópio óptico. 3.7. Para observar os gâmetas masculinos, coloque uma gota de suspensão na cavidade da lâmina de vidro e dilua uma pequena quantidade de esperma com 1 a 2 ml de água do mar. De seguida, coloque a lamela e observe ao microscópio óptico. ATENÇÃO: Para evitar a contaminação, é necessário etiquetar e utilizar um conta-gotas diferente para fazer a suspensão dos óvulos e dos espermatozóides. c) Fecundação, observação da interacção óvulo-espermatozóides 3.8. Prepare a suspensão de espermatozóides, adequada para a fecundação, diluindo uma pequena gota de esperma com cerca de 5ml de água do mar (a cor deve ser quase brancosujo). Para que a experiência seja bem sucedida, aconselhamos a utilização de uma baixa concentração de esperma. 3.9. Agite a suspensão de óvulos, que têm tendência de ficar no fundo do copo, recolha uma gota com a pipeta de Pasteur de plástico e coloque-a na cavidade da lâmina de vidro. 3.10. Adicione lateralmente, na extremidade da lâmina de vidro, uma gota de suspensão de esperma (pipeta de vidro). A fecundação desencadeia imediatamente um conjunto de eventos, sendo o mais significante a formação da membrana de fecundação (ver figura 3). d) Observação do desenvolvimento embrionário 3.11. Transfira 40ml da solução de óvulos e 1ml da suspensão de espermatozóides para o erlenmeyer de 50ml, abane cuidadosamente para ajudar ao contacto entre os gâmetas. Retire uma gota da suspensão em intervalos regulares e coloque-a delicadamente na cavidade de vidro para a observação ao microscópio. Para uma oxigenação suficiente dos embriões é necessário, de vez em quando, substituir a solução de água do mar e abanar a suspensão para evitar a falta de oxigénio aos óvulos fertilizados (ou, alternativamente, coloque dentro do copo uma pequena pedra porosa usada na oxigenação de aquários). A duração da segmentação e, em geral, do desenvolvimento do
embrião, depende da temperatura da água. No entanto, os ovos devem ser mantidos a temperaturas inferiores a 25ºC. 3.12. Observe as diferentes fases de desenvolvimento embrionário e identifique-as de acordo com as tabela I e Figura 3. Tabela I - Duração aproximada dos estádios de desenvolvimento embrionário do ouriço-do-mar Estádios Formação da membrana de fecundação Dois blastómeros Quatro blastómeros Oito blastómeros Blástula Gástrula Larva pluteus Tempo 2-5 min 50-70 min 78-107min 103-145 min 6-10 h 12-20 h 24-48 h Figuras 3 A-L: Desenvolvimento embrionário do ouriço do mar Lytechinus variegatus. A. óvulo; B. ovo fecundado; C. Início da primeira clivagem; D. estágio de 2 células; E - F. estágio de 4 células; G. estágio de 8 células; H. estágio de mórula; I. blástula; J. estágio de gástrula; L. larva pluteus
4) Referências Bibliográficas http://volvox.cienciaviva.pt/protocols/pdfs/ourico.pdf http://200.144.190.194/cbm/index.php/artigos-acesso-livre/72-desenvolvimentoembrionario-dos-ouricos-do-mar.html Rodrigues NV, Maranhão P, Oliveira P, Alberto J (2008). Guia de Espécies Submarinas. Portugal Berlengas. Instituto Politécnico de Leiria. 231pp