1 Introdução 1.1 Aids

16 1 Introdução 1.1 Aids No início da década de oitenta (1981), a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS) foi reconhecida e descrita nos Estados Unidos 1 em função do aparecimento de um conjunto de doenças raras, como o Sarcoma de Kaposi e a pneumonia por Pneumocystis carinii, em pacientes homossexuais e bissexuais do sexo masculino provenientes de grandes cidades norte-americanas (Nova York, Los Angeles e São Francisco). Essas doenças já eram conhecidas: a pneumonia ocorria em pacientes com câncer em estágios avançados e o Sarcoma de Kaposi era bem comum entre idosos procedentes da Bacia do Mediterrâneo. Entretanto, essas enfermidades nunca haviam sido observadas, até então, ao mesmo tempo, em pacientes homossexuais masculinos sem históricos de outras doenças 2. Diante deste quadro, o CDC (Center for Disease Control and Prevention), o órgão de vigilância epidemiológica norte-americano, passou a estudar a doença e definir o seu perfil clínico e epidemiológico. Como a incidência, no início, era predominantemente entre homossexuais, suspeitou-se que houvesse relação entre a doença e este estilo de vida. No entanto, não tardaram a surgir casos entre heterossexuais e recém-nascidos 3. E assim, a AIDS tornou-se, a doença mais estudada, alcançando o status de prioridade internacional. Nunca se descobriu tanto em tão pouco tempo sobre qualquer outra doença. No Brasil, os primeiros casos confirmados ocorreram em São Paulo, em 1982. Foi no Hospital Emílio Ribas que o primeiro caso de AIDS do país foi atendido. Desde então, de acordo com o Instituto de Infectologia Emílio Ribas, cerca de 27.000 pessoas contaminadas pelo vírus já passaram pelo Instituto. Em pouco tempo, já havia casos registrados de pessoas com HIV em praticamente todas as regiões do globo, configurando uma pandemia. Segundo dados da Organização Mundial de Saúde, do ano de 2009, 33,4 milhões (31,1-35,8 milhões, considerando a margem de erro) de pessoas estão vivendo com AIDS no mundo, sendo 31,3 milhões (29,2 33,7 milhões) adultos, 15,7 milhões (14,2 17,2 milhões) mulheres e 2,1 milhões (1,2 2,9 milhões) crianças (Figura 1). No Brasil, cerca de 630

17 mil pessoas vivem com o HIV. O número é estimado, pois são registradas somente as pessoas soropositivas que tomam medicamentos antirretrovirais. Segundo dados do Boletim Epidemiológico de 2009, desde o início da epidemia até junho de 2009, foram realizados 544.846 diagnósticos e foram registradas 217.091 mortes em decorrência da doença. Por ano, são notificados entre 33 mil e 35 mil novos casos de AIDS 4. Figura 1. Número de pessoas vivendo com HIV, número de pessoas infectadas com HIV, número de mortes no mundo (milhões), 1990-2008. Extraída da referência 5. AIDS trata-se de uma doença provocada por um vírus denominado HIV Vírus da Imunodeficiência Humana 6. De uma forma geral, o HIV é um retrovírus (composto de RNA) que, por este motivo, ataca o sistema de defesa humano conhecido como linfócito T auxiliar (também chamado de linfócito T4 ou T CD4+) que normalmente encontra na corrente sanguínea e é responsável por toda a coordenação da defesa imunológica do organismo 7. A defesa imunológica da pessoa infectada fica inoperante contra os microorganismos invasores, tais como: vírus, bactérias, protozoários, etc, tornando a pessoa infectada vulnerável a infecções oportunistas. Os sintomas iniciais são fraqueza, febre, emagrecimento e diarréia 8,9.

18 A transmissão pode ocorrer por meio do sangue, sêmen, secreção vaginal, uso de drogas injetáveis, transfusão de sangue contaminado e também durante a amamentação 10. O tratamento com medicamentos anti-hiv, as crescentes experiências entre os profissionais de saúde no atendimento aos pacientes infectados pelo HIV e a melhoria do acesso aos cuidados de saúde têm tido um extraordinário impacto na sociedade, permitindo que as pessoas infectadas levem uma vida relativamente normal e saudável 11. No entanto, muitas pessoas infectadas, infelizmente, não apresentam a resposta esperada aos medicamentos, devido principalmente à intolerância e aos efeitos colaterais dos mesmos ou têm dificuldade em cumprir com o tratamento, que envolve um grande número de comprimidos. Além disso, o surgimento de cepas do HIV que são resistentes às drogas atualmente disponíveis é um problema 12. 1.2 Ciclo de vida do HIV O vírus HIV pertence a um grupo de vírus chamado de retrovírus. Estes vírus armazenam o seu material genético como RNA (uma cadeia dupla de código genético) e possuem uma determinada quantidade de proteínas virais. Devido à sua incapacidade de auto-reprodução (replicação), precisam infectar uma célula que servirá de hospedeira para a produção de novos vírus 13, ou seja, são parasitas intracelulares obrigatórios. O alvo preferencial do vírus HIV são as células de defesa conhecidas como linfócitos T auxiliares, linfócitos T4 ou T CD4+, que normalmente estão presentes na corrente sanguínea e são responsáveis por garantir a defesa do organismo e por manter o corpo funcionando livre de doenças 7. O complexo glicoprotéico viral gp120-gp41 é usado pelo HIV para reconhecer e se ligar aos linfócitos 14. Quando o HIV se liga a um receptor da célula CD4+, prende-se utilizando a subunidade de superfície gp120, provocando mudanças conformacionais nesta, possibilitando a fixação aos co-receptores CCR5 ou CXCR4 15. A gp41 atua como um gancho e uma roldana (hook and pulley). À medida que se movimenta em direção aos receptores, dá um salto pra frente e penetra na membrana da célula humana puxando o vírus na direção da célula e ajudando-o a fundir-se com a membrana celular. Quando o HIV se une aos receptores da célula CD4+, o seu material genético (RNA) e algumas enzimas importantes para a sua replicação são absorvidos pela

19 célula humana 16 Com a entrada do capsídeo do HIV à célula, a enzima viral denominada de transcriptase reversa decodifica o material genético do HIV, ou seja, produz uma réplica de DNA de dupla cadeia no modelo do RNA original 17 (Figura 2). Figura 2. Proteínas gp120 e gp41 interagindo com os receptores quimiocíneos da célula TCD4+. Extraída da referência 19. O DNA viral, recém-formado, entra no núcleo da célula hospedeira e integra-se ao DNA humano pela ação da enzima integrase, permitindo assim que o HIV reprograme a célula humana para criar mais vírus. A ativação da célula hospedeira resulta na transcrição do DNA em RNA mensageiro, que é traduzido em proteínas virais. A enzima viral chamada protease corta os blocos de construção das proteínas em partes menores, formando a estrutura da nova partícula do HIV, que inclui todas as enzimas e proteínas necessárias para a replicação do vírus dentro de uma célula hospedeira. Na sequência, a nova partícula viral desenvolve-se na célula humana e sai desta, entrando na corrente sanguínea, podendo assim infectar outras células (Figura 3).

20 Figura 3. Ciclo de vida do HIV. Extraída da referência 18. 1.3 Fármacos anti-hiv Muitas estratégias de tratamento estão sendo desenvolvidas e testadas, incluindo o uso de medicamentos que impedem o vírus de entrar na célula (inibidores de fusão). No Brasil, a Lei 9113/96 garantiu a todos os indivíduos infectados com o vírus HIV o acesso gratuito ao coquetel de drogas 20. O coquetel é composto de fármacos que podem desacelerar em até 100 vezes a produção do vírus. Dependendo do perfil do paciente, o tratamento pode incluir dois ou mais medicamentos que atuam em diferentes momentos do ciclo de vida do HIV. Estes medicamentos são classificados em: inibidores da transcriptase reversa nucleosídeos (IsTRN), inibidores da transcriptase reversa não-nucleosídeos (IsTRNN), inibidores de protease (IsP), inibidores da integrase e os inibidores de fusão. Os IsTRN impedem os vírus de fazerem cópias de seus próprios genes. São os medicamentos zidovudina, didanosina, lamivudina, estavudina, zalcibatina, abacavir e tenofovir (Figura 4) 21. Eles criam versões defeituosas dos nucleosídeos, unidades básicas dos genes. Com isso, o DNA viral incompleto não é capaz de assumir o controle do DNA da célula CD4+ e produzir novas cópias dos vírus.

21 Figura 4. Estruturas dos medicamentos IsTRN. Extraída da referência 18. Os IsTRNN inibem ou cessam a produção de HIV ligando-se à transcriptase reversa e, assim, evitam que a enzima converta o RNA do HIV em DNA. São eles: efavirenz, nevirapina, delavirdina e etravirina (Figura 5). Figura 5. Estruturas de alguns IsTRNN. Extraída da referência18.

22 Os IsP atacam no estágio em que o RNA e as proteínas virais são formados, pois se ligam à enzima protease e não permitem que as proteínas do vírus se tornem funcionais. Com isso, são formadas partículas virais imaturas e inativas. 22 Os medicamentos desta classe utilizados são: indinavir, ritonavir, saquinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, atazanavir, darunavir, tipranavir (Figura 6). Figura.6. Estruturas dos medicamentos IsP. Extraída da referência 18. Os inibidores da integrase impedem que o DNA viral, recém-formado, se integre ao DNA da célula no organismo humano através da enzima viral chamada integrase. O primeiro medicamento dessa classe, o raltegravirm, foi aprovado pela FDA em outubro de 2007 e pela Anvisa em janeiro de 2008. Os medicamentos inibidores de fusão impedem o vírus de penetrar nas células e, por isso, representam uma abordagem muito interessante, uma vez que os outros tipos de fármacos atacam o HIV somente após a infecção do linfócito. A interação gp120-cd4+ provoca uma alteração conformacional na glicoproteína, possibilitando a sua ligação aos receptores CCR5 e/ou CXCR4 23 (Figura 7). Isso permite que a glicoproteína transmembranar do envelope do vírus se acople à célula. Essa sequência aproxima a membrana da célula ao vírus, e o material genético viral entra na célula 24.

23 Figura 7. Etapas da fusão entre o vírus HIV e a célula hospedeira, permitindo que o material genético viral seja introduzido na célula. Figura extraída da referência 25. Apenas o composto T-20, enfuvirtide ou Fuzeon (nome comercial), foi aprovado pelo FDA para uso clínico. O T-20 é um polipeptídeo constituído de 36 aminoácidos que interage com a gp41, impedindo a fusão do vírus com a membrana da célula (Figura 8) 26.Porém, o elevadíssimo custo da terapia a base de Fuzeon (em torno de R$ 73.000 por caixa do medicamento), devido à complexidade de sua síntese (são necessárias 106 etapas de síntese para a sua produção) 27, os efeitos colaterais como cansaço, insônia e irritações locais causadas pelas injeções subcutâneas e a necessidade de baixa temperatura para a sua conservação estimularam a procura de novas substâncias 28.

24 Figura 8. Estrutura do Fuzeon. Extraída da referência 26. Dentre os promissores candidatos a novos inibidores de fusão, destacam-se o maraviroc, o vicriviroc, aplaviroc e o AMD 3100, este último de especial interesse no contexto de nosso trabalho. Figura 9. Potenciais inibidores de fusão: Maraviroc, vicriviroc, Aplaviroc e AMD 3100. Extraída da referência 18.

25 1.4 AMD 3100 Desde o início dos testes, ficou claro que os derivados biciclos (incluindo o AMD 3100) interferiam no processo inicial (entrada do vírus) do ciclo de replicação do HIV 29. Diversos antagonistas do CXCR4 e CCR5 foram estudados 30, mas resultados apontam que o biciclo AMD 3100 é realmente específico para CXCR4 e se destaca pelos seus resultados em infecções causadas pelo HIV, na mobilização de células tronco e de células estaminais para transplante 31. O AMD 3100 foi aprovado para ensaios em humanos pela FDA (U.S. Food and Drug Administration) dos USA em dezembro de 2008. Na fase I foram feitos ensaios clínicos em voluntários saudáveis e um efeito inesperado foi observado: um rápido aumento de glóbulos brancos, atingindo um máximo 6 horas após a infusão intravenosa. O AMD 3100 encontra-se agora na fase II de testes para a mobilização de células-tronco e transplante em pacientes com mieloma múltiplo (tipo de câncer que se desenvolve na medula óssea, pelo crescimento descontrolado de células plásmaticas), e também para uso em pacientes com linfoma e como anti-hiv 32. A ligação das drogas a seus alvos macromoleculares é vista como primordial para a atividade fármacológica. O complexo binário receptor ligante possui etapas caracterizadas como início, duração e amplitude de ação 33. Dependendo do tempo e das alterações funcionais devidas à formação do complexo receptor - ligante, o composto pode vir a ser um fármaco 34. Os anéis macrocíclicos presentes no AMD 3100 têm unidades quelantes e rigídas, com uma face aberta e geometria adequada para formar fortes ligações coordenadas a um centro metálico 35 (Figura 10). Figura 10. Conversão de um composto cíclico em complexo macrocíclico. Extraída da referência 36.

26 Os íons metálicos em metalofármacos podem interagir com os átomos doadores de um alvo biológico formando um complexo estável, melhorando assim a potência da droga e aumentando o tempo que o fármaco permanece ligado ao receptor 37. Segundo estudos (Figura 11), após 24 horas de incubação, o complexo de cobre(ii) do AMD 3100 é aproximadamente duas vezes mais ativo que o próprio AMD 3100 na inibição da ligação do receptor CXCR4 a um anticorpo específico anti- CXCR4. Propõe-se que este efeito esteja associado à coordenação de um resíduo de aspartato presente em CXCR4 ao íon cobre(ii). A geometria resultante da coordenação do aspartato, controlada pela identidade do metal, favorece a rigidez e a estabilidade cinética frente à dissociação do complexo receptor ligante 38. Figura 11. Porcentagem de inibição da ligação de anticorpo específico ao receptor CXCR4 em função do tempo de incubação, na presença de diferentes candidatos a inibidores de fusão. Extraída da referência 39. Lamentavelmente, por causar problemas cardíacos graves, o AMD 3100 teve seus estudos clínicos interrompidos. Um derivado oral mais potente, o AMD 3465 (AnorMED Inc., Langley, BC Canadá), com fórmula estrutural ainda não divulgada, está atualmente em desenvolvimento 40. A fim de contribuirmos para a pesquisa relacionada a fármacos anti-hiv e com base nos bons resultados obtidos com o para-biciclo AMD 3100 e considerando ainda a potencialidade farmacológica de complexos de cobre 41 e o fato de que a eficiência de um agente terapêutico pode ser potencializada pela coordenação a um centro metálico, é apresentado neste trabalho um ligante binucleante inédito derivado do

27 bacteriocida isoniazida (Figura 12), a partir do qual foram sintetizados dois complexos binucleares de cobre(ii) e zinco(ii), respectivamente. Para o ligante sintetizado, foi utilizado um centro precursor com dois grupos éteres e duas moléculas de isoniazida (INH) como braços pendentes, incorporados via formação de hidrazona, em posições relativas para. N O H N N H 3 C O O CH 3 N N H O N Figura 12. Novo ligante binucleante sintetizado no presente trabalho de investigação. Este ligante guarda algumas semelhanças estruturais com o AMD 3100, como, por exemplo, a presença em ambos do espaçador aromático, assim como dos braços coordenantes polidentados. Além disso, o fato de a INH ser uma molécula bioativa torna especialmente interessante o seu uso na síntese do ligante. A isoniazida é um fármaco anti-tuberculose que inibe a síntese do ácido micólico, componente essencial da parede celular da microbactéria. De acordo com dados do Ministério da Saúde, todos os anos são registrados por volta de nove milhões de novos casos e quase dois milhões de mortes por tuberculose. As tentativas para tratar a tuberculose são dificultadas pela propagação de estirpes multi-resistentes de M. tuberculosis (TBMR). Além disso, a tuberculose é hoje a principal causa de morte entre os doentes com AIDS 42. Inúmeras pesquisas têm descrito as propriedades bactericida e fungicida de complexos Cu(II) e Zn(II) com isoniazida 43,44. Tais compostos apresentam atividade antibacteriana e antifúngica maior, contra uma ou mais bactérias/linhagens de fungos, em comparação com aos compostos não complexados. Estudos realizados com complexos de Cu(II) dos ligantes CTZ (clotrimazol) e KTZ (cetoconazol), mostraram melhores resultados na inibição da proliferação do protozoário Trypanosoma cruzi, agente causador do Mal de Chagas, que os apresentados pelos ligantes livres 44.