AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO EM CULTURA INDIVIDUAL E COLETIVA Introdução Mariana de Carvalho Toledo 3 Camila de Paula Santos 3 Eduardo Freitas Velozzo 4 Fausto Romualdo de Faria 5 Aracele Pinheiro Pales dos Santos 2 Klayto José Gonçalves dos Santos 1* A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas são condições indispensáveis para o aumento da eficiência reprodutiva. Especialmente os ruminantes domésticos, biotécnicas como a IA e TE vêm sendo utilizadas com sucesso. Outras biotécnicas estão sendo aperfeiçoadas, com resultados inferiores na produção, como a produção in vitro de embriões (PIV), clonagem e transgenia. Ambas as biotecnologias contribuem para acelerar o melhoramento genético, desde que usem animais superiores nas características desejáveis, utilizando animais provados. Portanto as biotecnologias passam a ser uma ferramenta muito importante para o melhoramento genético animal (SANTOS, 2010). A produção in vitro de embriões é uma biotécnica de reprodução assistida e uma ferramenta para pesquisa de eventos relacionados a coleta de oócitos, maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV), bem como o cultivo in vitro (CIV) de zigotos, estruturas embrionárias e desenvolvimento embrionário na fase de pré-implantação. Além disso, a PIV é um instrumento de suporte para outras biotécnicas como clonagem, transgênese e transferência nuclear (SANTOS, 2010). Mesmo com o crescimento na utilização desse biotécnicas, ainda existem alguns problemas associados, sendo que boa parte desses problemas estão relacionadas com o cultivo in vitro, envolvendo a suplementação protéica do meio de cultivo, como a albumina sérica bovina (BSA) ou soro fetal bovino (SFB), que quando adicionado ao meio fluido sintético de oviduto (SOF) melhora significativamente o desenvolvimento de embriões bovinos (LONERGAN et al., 1999). No entanto, o soro pode levar a alterações químicas no meio, prejudicando o desenvolvimento dos embriões e introduzindo componentes tóxicos ou patogênicos no sistema de cultivo (BAVISTER, 1992). Além destes fatores o cultivo individual ou em grupo também influencia no desenvolvimento embrionário, pois sabemos que em grupos há uma maior produção de fatores de crescimento pelos embriões que proporcionam um maior desenvolvimento dos mesmos, porém há uma grande produção de substâncias embriotóxicas, como íons de amônia, metabólitos embrionários e radicais livres. Sob essas condições, formam-se as espécies reativas de oxigênio (ROS) que em bovinos promovem lesões no DNA (TAKAHASHI et al., 2000). 1 Pesquisador da UEG Laboratório de Reprodução Animal 2 Professora do Curso de Zootecnia da UEG 3 Bolsista PBIC/UEG 4 Zootecnista da UEG - Unidade Universitária de São Luis de Montes Belos 5 Médico Veterinário Autônomo Curso de Zootecnia, UEG - Unidade Universitária de São Luis de Montes Belos; CEP: 76100000, São Luis de Montes Belos Goiás, Brasil. *klayto.santos@ueg.br 1
A produção do ROS pode ter origem diretamente apartir de gametas e embriões, ou através do ambiente e se refere a produção de radicais O2, OH, H2O2. Além disso a produção dos radicais durante o cultivo in vitro é diferenciada de acordo com o estágio de desenvolvimento embrionário, sendo que o zigoto e o blastocisto são mais sensíveis às ROS (Guérin et al., 2001), podendo comprometer o potencial de desenvolvimento subseqüente. Isto pode ser explicado pelo fato de que a concentração de O2 no oviduto (entre 5-8%) de fêmeas mamíferas é menor do que no ambiente comumente utilizado para o cultivo in vitro 20% de O2 (FISHER; BAVISTER, 1993). Objetivo O objetivo desse trabalho foi avaliar as taxas de desenvolvimento embrionário em embriões cultivados em diferentes sistemas de acordo com o volume do meio e o número de zigotos por gota viabilizando o melhor sistema para os cultivos. Metodologia Os oócitos utilizados para o experimento foram obtidos de ovários de vacas leiteiras oriundos de abatedouros para obtenção de oócitos, os ovários coletados foram transportados em solução salina, em temperatura controlada (33 a 35 ºC) até o laboratório de Reprodução Animal da Universidade Estadual de Goiás na UnU de São Luis de Montes Belos. Após chegar ao laboratório os ovários foram lavados com solução salina e mantidos em Banho Maria à Temperatura de 35 ºC. Os folículos foram aspirados com seringas de 5ml e agulhas de calibre 40x12 (18G) e o liquido folicular mantido em tubos de ensaio de 15ml à temperatura de 35 ºC por 10 minutos em Banho Maria, não aspirando os folículo dominantes (maiores). Os sedimentos foram colocados em placas de petri e avaliados através do estereomicroscópio, para seleção e classificação dos oócitos. Os oócitos com coloração do citoplasma homogênea e com mais duas camadas completas de células do cummulus foram lavados com meio lave (TCM 199 Hepes). Após a lavagem, os oócitos selecionados foram maturados in vitro nas gotas com meio específico (MIV), coberta com óleo mineral, por 22 a 24 horas, em estufa (incubadora) de CO 2, Temp 38,5 ºC e 95% de umidade, durante 22 a 24 horas. Posteriormente a maturação, iniciou-se a fecundação in vitro dos oócitos. Foi utilizado sêmen congelado convencional da raça holandesa (previamente testado), o sêmen utilizado foi descongelado em banho Maria a uma temperatura de 37 ºC por 30 segundos, e adicionado ao gradiente Percoll, posteriormente centrifugado por 30 min para separação de espermatozóides vivos e mortos. O sedimento foi ressuspendido, e novamente centrifugado em meios de fecundação. A concentração foi corrigida para 1 x 10 6 de espermatozóides por ml do meio de fecundação. Os oócitos maturados foram lavados em meios de maturação e no meio de fecundação acrescido com meios capacitadores (heparina) e incubados em microgotas de 50 µg de meios de fecundação, envolvidos por óleo mineral, acrescentados de espermatozóides (descrito anteriormente). As placas foram incubadas para realização da fecundação por 20 horas, em estufa de 5% de CO 2, Temp 38,5% e 95% de umidade. Após a fecundação as células do cumulus dos possíveis zigotos foram retiradas parcialmente por pipetagem rápida e lavados três vezes em meio de cultivo embrionário SOF. Após a FIV os zigotos foram divididos aleatoriamente em seis grupos, sendo os grupos G1, G2, G3 em cultivo individual de embriões, onde G1 foi desenvolvido em gotas de 30 µl (microlitros), G2 em gota de 50µl e G3 em gota de 100µl. O restante dos zigotos foram divididos em: G4 com 10 embriões, G5 com 30 embriões, G6 com 2
50 embriões, cultivados em gotas de 100µl contendo meio CIV e cultivados em uma atmosfera controlada a 5% de CO2, 5% de O2 a 38,5 C. No terceiro dia de cultivo embrionário foi realizada a avaliação da clivagem, no sétimo dia dos embriões que chegaram ao estágio de blastocisto e no décimo dia os blastocistos eclodidos. Resultados e Discussão Entre os grupos analisados houve diferença entre as taxas de clivagem, taxa de blastocisto e taxa de blastocisto eclodido, com superioridade para o G3 em relação aos demais, apresentando respectivamente 90%, 66,6% e 58,3%. Os grupos em que o desenvolvimento foi individual independente da quantidade do meios utilizado apresentou superioridade em relação aos grupos coletivos com as taxas de blastocisto e blastocisto eclodidos. A taxa de blastocisto eclodido, observa-se que o grupo com menor densidade (G1) e o grupo de maior densidade (G6) apresentaram as menores taxas. Portanto, para se obter uma maior eficiência no cultivo embrionário qualquer quantidade de zigoto, mas com maior volume do meio CIV na gota, pois se baseando nos resultados obtidos pelo presente estudo, foi o sistema de cultivo que provavelmente melhor concentrou fatores embriotróficos que permitiram a progressão da cinética do desenvolvimento embrionário. São vários os fatores embriotróficos como o IGFI e II (fatores de crescimento semelhantes a insulina), TGF_ e TGF_ (fatores de crescimento transformadores), interferon-t, EGF (fato de crescimento epidermal) entre outros (GOOVAERTS, et al., 2009). Podemos sugerir que o volume do meio comprometer dispersão adequada dos componentes tóxicos ou patogênicos no sistema de cultivo, dados estes verificados nas taxas de clivagem, blastocisto e blastocisto eclodidos. A utilização do do cultivo individual de embriões se dá pelo fato de simplificar os procedimentos de ovum-pick-up (OPU), pois, a baixa recuperação de oócitos pode necessitar de um cultivo individual ou de pequenos grupos, tanto para maturação, fertilização como para cultura embrionária (O DOHERTY, et al., 1997; FUJITA, et al., 2006). O G3 foi o que obteve melhores taxas de blastocistos dentre os grupos de cultivo individual e coletivos, ou seja, foi melhor que o G1 e G3, fato que pode ser explicado pelas características maior disponibilidade de nutrientes favoráveis ao desenvolvimento embrionário e menor produção de substâncias indesejáveis a esse desenvolvimento, permitindo uma menor diluição dos fatores tóxicos e um menor acúmulo dos fatores autócrinos, sendo considerado uma opção viável no o cultivo de embriões individualmente. Em um estudo que cultivou embriões FIV individualmente obtevese 61% de blastocistos, resultados inferiores aos 66,6% obtidos no presente estudo (VAJTA, et al., 2000). Em relação as taxas de clivagem, blastocistos e eclosão houve diferença nos resultados, portanto, em cultivos individuais com maior volume das gotas interferiu positivamente no desenvolvimento embrionário. Porém, a produção in vitro em grupos maiores, reduz custos, requer uma menor quantidade de meio e o tempo dispendido na manipulação dos oócitos e embriões é menor (GOOVAERTS, et al., 2009), divergindo do resultado do presente estudo, onde o mesmo apresenta como alternativa essa utilização com grupos com maior densidade. Em um estudo que comparou a cultura de diferentes números de oócitos no desenvolvimento embrionário, obteve as maiores taxas de clivagem e blastocistos no cultivo com 20 a 40 oócitos, sendo a diluição das gotas de 10 µl e 5 µl/embrião respectivamente, resultados que não identificados com o presente estudo, cuja as melhores taxas foram do grupo G3 cuja a diluição com oócitos coletivos foi de 10 µl/ embrião. Portanto, os resultados 3
deste experimento indicaram que existem benefícios também na cultura de oócitos e embriões em grupos, podendo ser explicado pelo fato de haver a secreção de fatores de crescimento pelos embriões que beneficiam uns aos outros no grupo (O DOHERTY, et al., 1997). Em um estudo que avaliou o efeito do volume das gotas no cultivo individual e em grupo de embriões obteve-se taxas de clivagem e de blastocistos (respectivamente) nos grupos individuais em gotas de 20 µl de 54,5% e 2,2%, resultados superiores foram encontrados no presente estudo utilizando de 100 µl de 90% e 66,6%. FUJITA, et al (2006) observou que não houve diferença nas taxas de clivagem entre o número de embriões nas gotas de cultivo (de 1 a 5 embriões/gota de 5µl), porém houve aumento nas taxas de blastocistos em gotas com 5 embriões (31,7%) comparado a gota com 1 embrião (13,3%), resultados que diferem com o presente estudo. Estes resultados sugerem que o número de embriões cultivados por gota são importantes para dar suporte ao desenvolvimento embrionário. Desta forma, os resultados do presente estudo sugerem que os cultivos individuais ou com poucos zigotos por gota aumentaram a taxa de produção de blastocistos devido a possível redução da concentração de fatores de crescimento em suas gotas de cultivo, e que embriões cultivados em grande número por gota, retardem a cinética do desenvolvimento embrionário ou até mesmo reduza a produção dos mesmos. Considerações finais O sistema de cultivo embrionário é mais eficiente se realizado em grupos de oócitos e zigotos individuais. O volume ideal para o desenvolvimento embrionário nos cultivos de oócitos e zigotos coletivos foi de 10 µl/ embrião. Em adição pode-se concluir que em cultivos embrionários individuais, o volume das gotas interferem no desenvolvimento embrionário. Nos cultivos coletivos quanto menor da densidade de melhor foram as taxas de clivagem, blastocistos e blastocistos eclodidos. Referências BAVISTER, B.D. Culture of preimpplantation embryo: facts and artifact. Hum. Reprod. Update, v.1, p.91-148, 1995. GOOVAERTS, I.G.F., et al. Effect of cumulus cell coculture and oxygen tension on the in vitro developmental competence of bovine zygotes cultured singly. Theriogenology, Gebouw, v. 71, p. 729-738, 2009. FISHER, B. BAVISTER, B.D oxygen tension in the ovidcut and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits. J Reprod. Fértil, Cambridge v. 99, p. 673-679, 1993. FUJITA, T., et al. Effect of group and embryo-culture conditioned medium on development of bovine embryos. Journal of reproduction and development, Kuju, v.52, p.137-142, 2006. LONERGAN, P.; O'KEARNEY-FLYNN, M.; BOLAND, M.P. Effect of protein supplementation and presence of an antioxidant on the development of bovine zygotes in 4
synthetic oviduct fluid medium under high or low oxygen tension. Theriogenology, v.51, p.1565-1576, 1999. O DOHERTY, E.M., et al. Effects of culturing bovine oocytes either singly or in groups on development to blastocysts. Theriogenology, Dublin, v. 48, p.161-169, 1997. SANTOS, K, J, G.Efeito da progesterona na produção de embriões em novilhas Gir e Girolando. 2010. 114 f. Tese (Doutorado) Universidade Federal de Goiás. Goiânia. TAKAHASHI, H., et al. Effect of oxidative stress on development and DNA damage in in vitro culture bovine embryos by COMET assay. Theriogenology, New York v.53, n.3, p. 365, 2000. VAJTA, G., et al. New method for culture of zona-included or zona-free embryos: the Well of the Well (WOW) system. Molecular Reproduciton and Development, Tjele, v.55, p. 256-264, 2000 5