Biologia Molecular
O termo Biologia Molecular é usualmente aplicado à Química de Ácidos Nucleicos Ácido Deoxirribonucleico - DNA Ácido Ribonucleico RNA Ciência Genômica
A informação genética de todos os animais é escrita na linguagem universal das seqüências de DNA. A seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas bioquímicas simples que hoje praticamente todos os laboratórios de pesquisa podem dominar.
Histórico: Primeiras evidências de que o DNA é o material genético: F. Miescher, 1868- extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein) O. Hertwing, 1884 - demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma Hertwing suspeitou que nuclein fosse o material da hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos. O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em 1944 - demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético
A pedra fundamental da Biologia Contemporânea Nature - 25 de abril de 1953 A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid J. Watson and W. Crick We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest. Hoje, o fato de que o DNA é o material genético é um fato biológico tão óbvio e fundamental que torna-se difícil apreender a enormidade do vazio de conhecimento que esta descoberta preencheu.
1950: - Não se conhecia a seqüência de amino ácidos de nenhuma proteína. - Não se sabia que os amino ácidos numa proteína permanecem arranjados numa seqüência exata. 1960: - Foi definida a primeira estrutura tridimensional de uma proteína, definida por cristalografia. Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos de centenas de milhares de proteínas a partir dos genes que as codifica.
A identificação de moléculas de ácidos nucleicos tornou-se a maneira mais fácil de se chegar a uma dada proteína
Estrutura do DNA
Os ácidos nucleicos são moléculas muito mais simples que as proteínas Os ácidos nucleicos são formados de apenas 4 tipos de monômeros (alfabeto de 4 letras) Proteínas - alfabeto de 20 letras
ESTRUTURA DO DNA O DNA é uma molécula quase unidimensional Largura: 20 Angstrons Comprimento: 1,7 a 8,5 cm Uma Estrutura linear que dá origem a outra estrutura linear (o RNA) O RNA, por sua vez, dá origem a outra estrutura linear (sem ramificações): A Cadeia Polipeptídica
AS UNIDADES DO POLÍMERO - DNA Bases Purínicas (A ou G) e Pirimidínicas (C ou T) Um açúcar: desoxiribose Fosfato Nucleosídeo: purina ou pirimidina ligada ao açúcar Nucleotídeo: éster de fosfato de um nucleosídeo Exemplo: deoxiadenosina 5 - trifosfato (datp)
RNA
O DNA é uma molécula com polaridade: uma extremidade 5 - P uma extremidade 3 -OH A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO 5 3
O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos enroladas em hélice As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por PONTES DE HIDROGÊNIO Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que ser ANTIPARALELAS O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio
Figure 4-5 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Quanto maior o número de pontes de H mais estável é a interação. As fitas das moléculas de DNA no cromossomo não se separam na célula íntegra sem ajuda de enzimas especiais.
Desnaturação e Renaturação do DNA (1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA) As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas: Aumento de temperatura ou Extremos de ph (usamos ph alcalino para separar as fitas)
Força de interação entre moléculas e entre átomos numa mesma molécula
Tm e % de GC Quanto maior a porcentagem de pares GC, mais difícil é a desnaturação
Separação das fitas é denominada FUSÃO da molécula de DNA - MELTING MELTING POINT: TEMPERATURA NA QUAL É DESFEITA METADE DA ESTRUTURA EM HÉLICE DO DNA
Ácidos Nucleicos absorvem máximamente a 260 nm. A quantificação de ácidos nucleicos em laboratório é, usualmente, feita por espectrofotometria - na faixa UV
A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam. Temperatura de desnaturação, ou melting point (Tm), é a temperatura na qual ocorre 50% de desnaturação.
O DNA no núcleo: Um cromossoma : uma molécula de DNA Genoma: o conjunto de cromossomas de uma dada espécie Genoma Humano: 46 cromossomas 22 CROMOSSOMAS AUTOSSÔMICOS (x2) 2 CROMOSSOMAS SEXUAIS Total: 6 x 10 9 pares de nucleotídeos Cada célula tem aproximadamente 2 metros de DNA, se esse fosse desenrolado. O núcleo tem apenas 6 mm.
Compactação do DNA
Primeiro nível de compactação:. nucleossomos
Segundo nível de compactação: Histona H1
As histonas são proteínas altamente conservadas. Histona H4 102 amino ácidos: apenas duas diferenças entre H4 de uma pêra e de uma vaca!
Cromossomos na interfase
H1, H2A, H2B, H3 e H4 em interação com o DNA 142 pontes de H são formadas entre DNA e o cerne das histonas, em cada nucleossomo. A maioria entre o backbone de amino ácidos das histonas e o backbone fosfodiéster do DNA
Modificações na cauda N terminal das histonas
DNA de procariotas tem cerca de 1mm. Têm que ser compactados para se acomodarem na célula. A associação com poliaminas carregadas positivamente reduz a repulsão entre moléculas de DNA, facilitando a compactação: Proteínas interagem com o DNA, exercendo papel semelhante aos das histonas. A mais abundante destas proteínas é a H-NS.
Duplicação do DNA in vivo
DNA POLIMERASES POLIMERIZAÇÃO: 5 ---> 3 Todas as DNA-POLIMERASES requerem para seu funcionamento: Molécula de DNA - molde Primer de oligonucleotídeo Magnésio dntps
Incorporação de um nucleotídeo na cadeia Extremidade 3 DNA-polimerase
DNA polimerases precisam de primer
DNA polimerases têm dois sítios catalíticos:. Sítio de polimerização: Polimerase 5 3. Sítio de remoção: Exonuclease 3 5'
A necessidade de que a duplicação se faça com alta fidelidade requer uma atividade proofreading
Mecanismo hipotético: incompatível com o processo de correção Mecanismo real
O SENTIDO DA VIDA É... NA DIREÇÃO 5 3
DUPLICAÇÃO DO DNA in vivo"
DNA bacteriano: circular
Origem de replicação em bactérias: Uma seqüência específica de DNA, com algumas centenas de pares de bases, rica em AT. Na origem forma-se o complexo de replicação (RC) na fase G1.
Figure 5-25 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Duplicação de um DNA circular Bactérias Plasmídeos DNA mitocondrial
Duplicação do DNA Em eucariotos
As origens de replicação são elementos do DNA aos quais se ligam ORCs (origin replication complex) Janela de oportunidade: fim em G1 proteínas específicas se ligam aos ORCs (pre-rc) [Leveduras: Cdc6p e RLFs (MCM)] Proteínas cinases dependente de ciclinas (ciclinas B-CDK) agem no pré-rc Ciclinas B acumulam-se na célula imediatamente antes da fase S e fosforilam proteínas do pré-rc pré-rc fosforilado pós-rc Inicia-se a fase S Pós-RCs não são capazes de reiniciar a replicação do DNA O Processo de replicação só será possível quando as células filhas passarem novamente pelo mesmo processo.
Cada cromossomo tem aproximadamente 150 milhões de pares de nucleotídeos. Numa velocidade de 50 nts/s, levaria cerca de 800 horas para replicar um cromossomo. Em cada cromossomo, 20 a 80 origens são ativadas para que o DNA seja replicado em tempo hábil. O intervalo entre as origens de replicação varia entre 30.000 a 300.000 pares de nucleotídeos.
Replicação semiconservativa
No local de replicação forma-se uma bolha, que vai se abrindo em ambas as direções. Das duas fitas originais, simultaneamente surgem quatro.
A fita nova é iniciada pelo complexo PRIMASE+DNA-pol a que sintetiza um primer de RNA
A polimerização se faz obrigatoriamente na direção 5 3' Fragmentos de Okazaki na fita de síntese descontínua
Fazem parte do complexo de replicação além das polimerases: Girase e Helicase (abrem as fitas) Helicase é um hexâmero de proteínas MCM Proteínas que se ligam no DNA quando em fita única RPA (replication protein A)
Figure 5-15 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 5-16 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
RFC (replication factor C) (Clamp Loader) Atua na substituição do complexo primase/dna-pol a pela polimerase que irá estender a fita por distâncias maiores (Pol e ou Pol d) Carrega a PCNA para o local PCNA (proliferating cell nuclear antigen) (Sliding clamp) PCNA funciona como um anel que circunda o DNA e prende a DNA-polimerase no local, aumentando sua processividade
Figure 5-18a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
RFC Estas proteínas são importantes para manutenção da estabilidade cromossômica porque participam também do reparo do DNA e soluções dos problemas de quebra na fita durante a replicação (stalled replication forks) PCNA Figure 5-18b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 5-18c Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Um fork de replicação de mamífero. Primers: 7-9 RIBOnucleotídeos estendidos depois até ~ 30 nts pela DNA polimerase a Na lagging-strand, os primers são sintetizados a cada 100 a 200 nucleotídeos.
Velocidade de polimerização: Procariota: 500 a 1000 nucleotídeos/segundo Eucariota: 50 nucleotídeos/segundo DNA helicase: à medida que se move ao longo do DNA, hidrolisa ATP e separa as fitas, numa velocidade de ~ 1000 nt/s
Topoisomerase I
Figure 5-23 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Topoisomarease II
Maturação dos fragmentos de Okazaki Cerca de 50 milhões de Fragmentos de Okazaki são gerados a cada duplicação do DNA em células de mamíferos
Sempre auxiliadas por PCNA as seguintes enzimas participam da maturação dos fragmentos de Okazaki: Rnase H/FEN1: degrada os segmento RNA do segmento alfa FEN1: cliva o segmento que é deslocado pela DNA polimerase d (se pequeno) DNA2/RPA: cliva o segmento deslocado, se este é longo FEN1 + exo1 : podem também fazer a edição da porção DNA do segmento a
FEN1 metilada: cliva o segmento FEN1 fosforilada: desprende-se do complexo Ligase I : fecha a interrupção na fita (nick)
Término de replicação de DNA linear: telômeros Sequências repetidas dos telômeros (TTAGGG) Fitas parentais 3 5 velha nova Telomerase * * * * nova velha velha nova + Preenchido pela DNA-polimerase + Primers de RNA Digestão dos primers por RNases 5 3 5 3 3 5 3 5 Falha na extremidade (primer gap) Primase DNA-polimerase * * * * Digestão do primer por RNases Falha na extremidade (primer gap)
Estrutura da telomerase
Telomerase é uma transcriptase reversa: uma classe de DNA polimerases que sintetiza DNA a partir de uma template de RNA. Em humanos, a seqüência GGGTTA é adicionada pela telomerase, se estendendo por cerca de 10.000 nucleotídeos.
A extremidade do telômero adquire uma estrutura especial (alça T) Ausência de Rtel1 leva a instabilidade genômica com fusões de cromossomos. Os telômeros têm a cromatina altamente condensada.
A maquinaria de replicação desloca o DNA das histonas. Ambas as fitas de DNA herdam histonas velhas. H2A e H2B velhas se juntam com H3 e H4 novas. H3 e H4 velhas se juntam com H2A e H2B novas. mrnas de histonas aumentam cerca de 50 vezes durante a replicação, e em seguida são rapidamente degradados.
Chaperonas auxiliam na montagem dos nucleossomos nas fitas filhas