Aula 1 BIOLOGIA Botânica - Práticas 2012/2013 Departamento de Biologia Vegetal Francisco Carrapiço e Isabel Caçador http://azolla.fc.ul.pt/aulas/biologiabotanica.html
Normas de segurança no laboratório O laboratório é um local de trabalho a que está associado a manipulação de equipamentos científicos e produtos químicos que, se indevidamente manipulados, podem conter riscos para a saúde e mesmo em casos extremos pôr em causa a própria vida. Usar sempre bata. Esta deve ser de algodão, evitando o uso de fibras sintéticas. Prender os cabelos com um elástico quando estes são compridos. Usar calçado adequado. Evitar o uso de calçado aberto que exponha o pé. Não beber ou comer no seu interior, incluindo mascar pastilhas elásticas. Usar material de vidro que não esteja danificado para evitar cortes ou ferimentos. Manter limpa a sua área de trabalho e separar o lixo produzido, utilizando os recipientes existentes para o efeito. Lavar as mãos antes e depois de utilizar os reagentes e ou em experiências a efectuar. Não abandonar o local de trabalho sem deixar tudo devidamente arrumado, não esquecendo de desligar os equipamentos que foram utilizados. Saber onde está o equipamento de primeiros socorros. Em caso de acidente, procurar ajuda rapidamente junto do professor.
Microscópio óptico cutícula 1665 http://microscopy.fsu.edu/primer/museum/hooke.html
Parte Mecânica Pé ou base Braço Tubo ou canhão Platina ou porta objectos Revólver ou porta-objectivas Parafuso macrométrico Parafuso micrométrico Parte Óptica Sistema de Iluminação Sistema de Ampliação Fonte Luminosa Condensador Objectivas Oculares
Ampliação obtida pelos microscópios ópticos e electrónicos. Os microscópios ópticos incluem contraste de fase e fluorescência. O ME inclui a transmissão (TEM) e varrimento (SEM)
Adaptado de Figueiredo, A.C. et al., 1996 Biologia (Botânica) Práticas Quadro comparativo da microscopia óptica e electrónica
Abertura numérica da objectiva e limite de resolução Abertura numérica da objectiva NA= n(sin µ) Fórmula de Abbe Limite de resolução ε=0,6λ/n(sin µ) n= índice de refracção do meio entre a lente frontal da objectiva e a lamela Ar= 1,00; óleo de imersão= 1,51 µ= metade da abertura angular, ie, semi-ângulo com vértice no cone formado pelos raios que, saindo da preparação, atingem a lente frontal da objectiva λ= comprimento de onda O limite de resolução é definido como sendo a distância mínima existente entre dois pontos de modo a ser ainda possível distingui-los como entidades separadas. Depende do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numérica, e é dado pela fórmula de Abbe.
Microscopia de contraste de fase Microscopia de contraste de Interferência (DIC) ou Nomarski
Ano lectivo 2011/12 Microscopia de fluorescência Principle of Fluorescence 1. Energy is absorbed by the atom which becomes excited. 2. The electron jumps to a higher energy level. 3. Soon, the electron drops back to the ground state, emitting a photon (or a packet of light) - the atom is fluorescing.
Micrografias ou fotografias de microscopia electrónica Chlamydomonas alga verde (Phylum Chlorophyta) Observada em MO e TEM Estruturas duma folha de angiospérmica observadas em TEM e SEM
Unidades de medida utilizadas em microscopia Unidade Símbolo Factor de conversão milímetro mm 1 mm = 1000 µm ou 0,001 m micrómetro µm 1 µm = 1000 nm nanómetro nm 1 nm = 10 Å Ångström Å 1 Å = 0,1 nm ou 10-10 m Como saber o valor final da ampliação da imagem do objecto em estudo? Ampliação final = ampliação da ocular x ampliação da objectiva exemplo: 10 x 40 = 400x
Preparações microscópicas temporárias e definitivas Preparação definitiva- preparação efectuada mediante um processo em que o material é submetido a um tratamento (fixação, desidratação, inclusão, microtomia) que o torna não alterável. Preparação temporária- preparação efectuada na altura e que se destina a uma observação rápida, após o que, o material se altera. (Sevinate-Pinto, I. & Antunes, T., 2005) Uma preparação microscópica é constituída por: Objecto ou material biológico. Lâmina de vidro, onde é colocado o material a observar. Lamela, igualmente de vidro, mas muito mais fina que a lâmina e que se coloca sobre o material a observar. Meio de montagem, líquido que pode ser incolor ou não e que é colocado entre a lâmina e a lamela e que embebe o material a observar. Um exemplo de meio de montagem é a água ou a solução de Ringer. lamela material biológico no meio de montagem lâmina
Cuidados a ter na utilização do microscópio óptico 1. Começar a focagem sempre com a objectiva de menor ampliação. 2. Manter o microscópio numa posição confortável para que o utilizador possa observar, e simultâneamente desenhar, o objecto que está a observar. 3. Após a utilização da objectiva de imersão, limpar convenientemente a lente frontal da objectiva. 4. No caso de se tratar duma preparação temporária, retirá-la do microscópio e separar a lamela da lâmina, colocando-as nos recipientes de lavagem. 5. Quando der por terminada a sua observação deixar no enfiamento do tubo a objectiva de menor ampliação. Desligar a fonte luminosa e tapar o microscópio. Técnica para efectuar uma preparação temporária 1. Colocar sobre uma lâmina de vidro uma gota de água (meio de montagem). 2. Fazer uma secção tranversal de um caule ou destacar uma epiderme do material que lhe for fornecido e colocar esse material sobre a gota de água. 3. Com cuidado, para não se formarem bolhas de ar, colocar a lamela e observar ao microscópio. As impressões digitais, quer na lâmina quer na lamela, devem ser evitadas. (Adaptado de Sevinate-Pinto, I. & Antunes, T., 2005)
Como proceder para focar com a objectiva de imersão Colocar a preparação na platina do microscópio e ligar a fonte luminosa. Colocar no alinhamento do tubo a objectiva de menor ampliação. Obter uma imagem nítida rodando o parafuso macrométrico. Ajustar com o parafuso micrométrico. Rodar as objectivas até à da ampliação de 40x e focar. Rodar a objectiva de 40x e colocar o revólver na posição intermédia entre a objectiva de 40x e 100x Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a preparação (lamela). Rodar a objectiva de 100x de maneira que a lente frontal fique em contacto com o óleo de imersão. Ajustar a focagem apenas com o parafuso micrométrico. Efeito do óleo de imersão na transmissão da luz para a lente frontal da objectiva (a). Com o ar entre o espécime e a lente frontal da objectiva alguma luz refractada é transmitida para a objectiva, mas a maior parte perde-se. (b) Com o óleo de imersão, a maior parte da luz refractada é captada pela lente frontal da objectiva devido ao alto indíce de refracção do óleo de imersão que é de 1,51, idêntico ao do vidro. O indíce de refracção do ar é de 1,0. (Adaptado de Sevinate-Pinto, I. & Antunes, T., 2005)
Observação de células da epiderme interna da escama do bolbo de Allium cepa, utilizando como meio de montagem o vermelho neutro