Tema Elaboradora TESTE DE ANTIGLOBULINA E SUA APLICAÇÃO EM LABORATÓRIOS Margarida de Oliveira Pinho, Bióloga, Responsável pelo Setor de Imunohematologia e Coordenação da equipe técnica do Serviço de Hemoterapia do Instituto Nacional de Câncer-M.S. RJ, Título de Proficiência Técnica em Imunohematologia pela SBHH, Especialização em Hemoterapia-Instituto Fernades Figueira-Fio Cruz. Texto Introdutório O teste de antiglobulina humana (AGH), foi descrito em 1945 por Coombs e colaboradores. Em 1946 Coombs e colaboradores descreveram o uso de antiglobulina humana para detectar in vivo a sensibilização de hemácias por anticorpos, tornando possível o diagnóstico da Doença Hemolítica Perinatal (DHPN). Com a descoberta do teste de AGH, outros anticorpos IgG foram detectados com seus respectivos antígenos, levando a descorberta e à caracterização de muitos sistemas de grupos sangüíneos. Foi encontrado o primeiro anticorpo do sistema Kell e seu respectivo antígeno. Coombs produziu soro antiglobulina humana (AGH) injetando soro humano em coelhos. Como resposta imunológica ocorreu a produção de anticorpo contra a globulina humana. O uso da antiglobulina humana para detectar a sensibilização de hemácias in vitro é uma técnica de duas fases chamada Teste de Antiglobulina Indireta (TAI), também conhecida como Teste de Coombs Indireto. A sensibilização in vivo é detectada por procedimento de uma fase chamada de Teste de Antiglobulina Direta (TAD), também conhecida como Teste de Coombs Direto. O TAI e o TAD continuam sendo os procedimentos mais comuns e de muita importância na sorologia de grupos sangüíneos. O Teste de Coombs é baseado no principio de que as globulinas anti-humanas obtidas de espécies não humanas imunizadas ligam-se a globulinas humanas como IgG ou complemento, livres no soro ou fixas a antígenos em hemácias. Os principais anticorpos de grupo sangüíneo são incompletos). IgM (chamados de completos) e IgG (chamados de Os anticorpos IgM se ligam facilmente ao antígenos correspondentes devido a sua estrutura pentâmera que favorece a aglutinação direta das hemácias em suspensas em salina (soro fisiológico). Os anticorpos IgG são chamados não aglutinantes pois sua estrutura monômera é muito pequena, esses anticorpos são capazes de sensibilizar as hemácias que tenham antígenos correspondentes mas não promovem a aglutinação diretamente. As hemácias sensibilizadas por anticorpos IgG necessitam da adição do soro antiglobulina humana para aglutinarem. Alguns anticorpos de grupo sangüíneo têm a capacidade de ligar complemento à membrana da hemácia. Reagentes de globulina anti-humana: Antiglobulina Humana Poliespecífica Contém anticorpo IgG e C3d do complemento humano. Outros anticorpos anticomplemento, tais como anti- C3b, anti-c4b ou anti-c4d, também podem estar presentes. A AGH poliespecifica comercialmente preparada contém pouca ou nenhuma atividade contra cadeias pesadas de IgA e IgM, porém, a mistura de soros poliespecíficos podem conter atividade de anticorpos contra cadeias leves kappa e lambda comuns a todas as classes de imunoglobulinas com moléculas IgA ou IgM. Globulina anti-humana monoespecifica Reagentes AGH monoespecificos contêm apenas uma especificidade de anticorpos. A antiglobulina humana anti-igg que é o mais usado ou anticorpos específicos para componentes do complemento, como exemplo o C3b ou C3d. Anti- IgG Reagentes rotulados anti-igg, não contêm nenhuma atividade anticomplemento. O anti IgG pode conter especificidade anticadeia leve e, portanto, reagir também com células sensibilizadas com IgM e IgA. Anticomplemento Reagentes anticomplemento como anti-c3b-c3d, são reativos apenas contra os componentes de complemento designados e não contém nenhuma atividade contra imunoglobulinas humanas. TESTE DE ANTIGLOBULINA DIRETO (TAD) O TAD, também conhecido como Teste de Coombs Direto é um método simples que permite detectar in vivo a sensibilização das hemácias com anticorpos, IgG e ou componentes de complemento. Método em tubo Preparar para teste uma suspensão à 5% de hemácias em solução salina, transferir para um tubo uma gota da suspensão de hemácias e lavar três vezes com solução salina. Pingar uma gota do soro antiglobulina humana (preferencialmente poliespecífico) nas hemácias lavadas, ou de acordo com a rotina estabelecida pelo serviço, homogeneizar, centrifugar e ler observando a presença ou ausência de aglutinação. Página 1 de 6
Resultados Negativos: pingar uma gota de hemácias sensibilizadas (reagente comercial - hemácias previamente sensibilizadas de rotina para validação dos testes com antiglobulina humana pelo método em tubo), homogeneizar, centrifugar e fazer a leitura. O resultado deste controle tem que ser positivo (presença de aglutinação), para que o teste seja validado. Se o resultado do controle for negativo o teste é inválido, portanto deve ser repetido. Resultados Positivos: indica presença de anticorpos na superfície da hemácia (sensibilização in vivo). Devem ser avaliados e relacionados com o diagnóstico do paciente, com a terapia medicamentosa do momento e com a história transfusional. Nos pacientes que apresentam resultado positivo é importante investigar sinais de hemólise in vivo, transfusão de sangue recente, fazer um teste de antiglobulina indireta (TAI) para investigar anticorpos no soro do paciente, verificar uso de medicamento e que medicamento está usando, verificar se recebeu transfusão de componentes plasmáticos ABO incompatível e outros fatores que possam ser relevantes para o diagnostico associado ao resultado encontrado. O teste de antiglobulina direto (TAD) está indicado para investigação de: Anemias Hemolíticas Autoimunes; Anemias Hemolíticas Induzidas por Drogas; Doença Hemolítica Perinatal; Reações Hemolíticas Transfusionais; Transfusão de sangue ou componentes contendo plasma ABO-incompatível; E outras situações mais específicas que são detectadas após criteriosa avaliação clínica para identificar a causa do TAD positivo. As amostras de sangue para realização do TAD devem ser colhidas em EDTA e o teste deve ser feito o mais rápido possível. A amostra não deve ir para geladeira antes do resultado final, evitando que anticorpos presentes no plasma sejam adsorvidos às hemácias resultando em resultados falsos negativos. A amostra com resultado de TAD positiva, deve ser submetida ao procedimento de eluição, que consiste em remover os anticorpos que estão causando a sensibilização na membrana da hemácia. A eluição pode ser feita por diversas técnicas. TESTE DE ANTIGLOBULINA INDIRETO (TAI) O TAI, também conhecido como Teste de Coombs Indireto, é capaz de detectar a presença de anticorpo irregular no soro (do tipo IgG). Este teste é muito utilizado em laboratórios Clínicos principalmente para monitorar mulheres Rh negativo em período gestacional. Método em tubo Para realizar este teste é necessário um conjunto de células (hemácias comerciais em suspensão à 5%) com perfil antigênico conhecido e capaz de detectar a maioria dos anticorpos de importância clínica. A técnica consiste em colocar uma ou duas gotas do soro a ser investigado junto com uma gota da suspensão das hemácias comerciais (conforme orientação do fabricante). O período de incubação à 37ºC pode variar conforme reagentes utilizados, é importante seguir sempre a técnica recomendada na instrução de uso do fabricante. Após o período de incubação lavar três vezes com solução salina e pingar uma ou duas gotas do reagente antiglobulina humana (conforme instrução do fabricante). O tipo de antiglobulina, se poliespecífica ou monoespecífica, deve ser definida pelo Serviço de acordo com as características dos pacientes atendidos no serviço. Resultados Negativos: pingar uma gota de hemácias previamente sensibilizadas (reagente comercial) usadas na rotina para validação dos testes com antiglobulina humana pelo método em tubo, homogeneizar, centrifugar e fazer a leitura. O resultado deste controle tem que ser positivo (presença de aglutinação), para que o teste seja válido. Se o resultado do controle for negativo invalida o teste, portanto, deve ser repetido. Resultados Positivos: indica a presença de anticorpo irregular (tipo IgG) e/ou fração de complemento na amostra-teste. Todos os resultados positivos devem ser informados por escrito: Ao médico solicitante (do paciente ou da gestante); Ao doador de sangue, juntamente com os resultados de sorologia; Mulher em idade fértil que, independente do Fator Rh, deve receber esclarecimento para que, em possíveis gestações, possa informar imediatamente ao médico que vai acompanhar o pré- natal. Principais causas de resultados positivos: Transfusões de sangue e/ou hemocomponentes; Gestação. O teste de antiglobulina Indireto (TAI) é utilizado para: Pesquisa de Anticorpos Irregulares (P.A.I.) em doadores de sangue e/ou pacientes, utilizando um conjunto de hemácias comerciais com perfil antigênico conhecido; Página 2 de 6
Prova de compatibilidade (prova cruzada) em teste pré- transfusional; Titulação de anticorpos tipo IgG; Identificação de Anticorpos Irregulares (IAI) utilizando um painel de hemácias com perfil antigênico conhecido; Fenotipagem de hemácias utilizando anti-soros comerciais com especificidade definida. Figura nº1 O esquema acima, mostra as hemácias sensibilizadas por imunoglobulinas IgG e sendo ligadas pela antiglobulina humana promovendo a reação de aglutinação. Principais fatores que afetam o teste da antiglobulina: Temperatura A temperatura ótima para detecção de anticorpos tipo IgG é de 37ºC, que é também uma temperatura ótima para ativação de complemento. Os testes de antiglobulina indireto devem ser incubados à 37º. Tempo de incubação Hemácias suspensas em salina o tempo pode variar de 30 a 120 minutos. Usando a técnica de LISS, o tempo de incubação pode variar de 10 a 150 minutos. Usando LISS, o tempo de incubação não deve exceder a 40 minutos, a incubação prolongada pode eluir os anticorpos das hemácias. Lavagem das células Para realizar os TAD e TAI é necessário lavar as hemácias com salina, no mínimo por três vezes, antes de adicionar a antiglobulina humana. A lavagem das hemácias tem como objetivo retirar as globulinas séricas livres no meio, a lavagem inadequada ocasiona neutralização da AGH resultando numa reação falso-negativa. Uso incorreto do polietilenoglicol (PEG) É usado como aditivo para aumentar a captação de anticorpos. Sua ação é remover a água, concentrando efetivamente o anticorpo. O reagente (AGH) de escolha deve ser o anti-igg para evitar resultados falsos-positivos. A utilização do PEG pode causar agregação de hemácias com resultados falsos-positivos quando centrifugado logo após a incubação. Para evitar resultados falsos-positivos é necessário lavar o teste imediatamente após a incubação. A performance do PEG é comparada ao LISS, entretanto, resultados indicam que o PEG dobra a detecção de anticorpos clinicamente significativos enquanto diminui os não significativos clinicamente. Adição da antiglobulina humana A antiglobulina humana deve ser acrescentada às hemácias imediatamente após a lavagem, evitando eluição do anticorpo das hemácias e como conseqüência, neutralizando a antiglobulina humana, resultando em reação falso-negativa. O volume do reagente adicionado ao teste deve seguir a instrução do fabricante do reagente. Página 3 de 6
Centrifugação para leitura As centrífugas devem ser calibradas e validadas para diversas necessidades de centrifugação definidas por cada laboratório. Para centrifugação de botão de células recomenda-se usar 1.000 de força centrífuga relativa (FCR), durante vinte segundos. A centrifugação é fundamental para conclusão dos resultados. Centrifugação mais alta gera resultados mais sensíveis, porém dependendo da forma que o botão é ressuspenso, o resultado pode ser falso-positivo fraco (por ressuspensão inadequada) ou ter um resultado falso-negativo se a suspensão for vigorosa. As condições ótimas de centrifugação devem ser determinadas para cada centrífuga. CAUSAS DE ERROS NOS TESTES DE ANTIGLOBULINA HUMANA Resultados falsos-positivos 1-Amostra refrigerada e/ou coaguladas são inadequadas e podem aderir complemento in vitro; 2-Hemácias com autoaglutinação; 3-Contaminação bacteriana da amostra, na salina para lavagem ou pipetas utilizadas para o teste; 4-Reagente de hemácias utilizadas para testes de antiglobulina indireta com TAD positivo; 5-Salina contaminada por metais pesados ou sílica colidal; 6-Tubos sujos; 7-Centrifugação excessiva para leitura; 8-Células poliaglutinantes; 9-Anticorpo conservante-dependente em reagentes LISS; 10-Anticorpos contaminantes no reagente de globulina anti-humana; 1-Lavagem inadequada ou imprópria de células; Resultados falsos-negativos 2-Reagente de antiglobulina humana não reativo devido a neutralização; 3-Reagente de antiglobulina humana não adicionado; 4-Soro em teste não reativo por perda da atividade do complemento; 5-Condições de incubação inadequadas no teste de antiglobulina indireto (TAI); 6-Concentração da suspensão de hemácias inadequada, muito alta ou muito baixa; 7-Centrifugação inadequada, muito forte ou muito fraca; 8-Leitura inadequada na hora ressuspender o botão de hemácias para leitura. Importante: Todas as reações negativas nos testes de antiglobulina humana pelo método em tubo deve ser validado com adição do reagente de hemácias sensibilizadas com anticorpos IgG. Após a adição desse reagente o teste deve ser homogeneizado e centrifugado. Depois da centrifugação fazer uma nova leitura. Teste válido: resultado positivo (aglutinação de pelo menos 1+) Teste inválido: resultado negativo (ausência de aglutinação) Repetir o teste da AGH A causa mais comum de erro é a lavagem inadequada, reagente AGH não reativos e falha na adição do reagente AGH. Questão 1 A sensibilização das hemácias in vivo, por anticorpos pode ser detectada através do teste de antiglobulina: 1. Indireto; 2. Direto e Indireto; 3. Indireto em temperatura ambiente; 4. Direto. Questão 2 O resultado do TAD positivo pode ser causado por: 1. Sensibilização das hemácias in vivo, por anticorpos plasmáticos ABO incompatível; 2. Anticorpos maternos ligados as hemácias do recém-nato; 3. Anticorpos ligados as hemácias devido à transfusão incompatível; Página 4 de 6
Questão 3 Questão 4 Questão 5 Para realizar o TAD (Teste de Antiglobulina Direto) ou TAI (Teste de Antiglobulina Indireto), em tubo, é necessário lavar as hemácias três vezes para: 1. Retirar o excesso de hemácias; 2. Retirar as globulinas séricas livres no meio; 3. Retirar os anticorpos que estão presos às hemácias; 4. Nenhuma das respostas acima. Para validar os resultados negativos dos testes de antiglobulina humana realizados em tubo, utilizamos um reagente comercial: 1. De hemácias lavadas com TAD negativo; 2. De hemácias do grupo 0 com fenótipo conhecido; 3. De hemácias sensibilizadas com anticorpos IgG; 4. Nenhuma das respostas acima estão corretas. É incorreto pesquisar anticorpo irregular no soro utilizando. 1. TAD também conhecido como Teste de Coombs Direto; 2. TAI também conhecido como Teste de Coombs Indireto; 3. PAI (Pesquisa de Anticorpo Irregular); 4. Nenhuma das alternativas acima. Questão 6 A temperatura ótima para detecção de anticorpos tipo IgG no soro é: 1. 37ºC; 2. 25ºC; 3. 4ºC; 4. 18ºC. Questão 7 Questão 8 Questão 9 Questão 10 O Teste da Antiglobulina Indireta é utilizados para: 1. Provas cruzadas; 2. Pesquisa de D fraco; 3. Fenotipagem eritrocitária; O polietilenoglicol (PEG) é utilizado na pesquisa de anticorpos irregulares por intensificar a reação antígeno anticorpo por: 1. Aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno; 2. Reduzir o potencial zeta; 3. Concentrar os anticorpos pela remoção da água; 4. Aumentar a especificidade do anticorpo pelo antígeno. O reagente AGH poliespecífico contém: 1. Anti-IgG e anti-igm; 2. Anti-IgG; 3. Anti-C3d; 4. Anti-IgG e anti-c3d. São as principais causas de resultados falsos-negativos nos Teste de Antiglobulina Humana. 1. Lavagem inadequada das hemácias; 2. Reagente de antiglobulina humana não adicionado; 3. Temperatura de incubação inadequada; Página 5 de 6
Questão 11 Questão 12 Questão 13 Questão 14 Questão 15 Referências Bibliográficas: São as principais causas de resultados falsos-positivos nos Teste de Antiglobulina Humana. 1. Contaminação bacteriana da amostra, na salina para lavagem ou pipetas utilizadas para o teste; 2. Centrifugação excessiva para leitura; 3. Reagente de hemácias utilizadas para testes de antiglobulina indireta com TAD positivo; O TAI (Teste de Antiglobulina Indireta) positivo indica: 1. Presença de anticorpo irregular (tipo IgG) e/ou fração de complemento no soro; 2. Presença de anticorpo irregular (tipo IgG) e/ou fração de complemento nas hemácias; 3. Presença de crio aglutininas; 4. Presença de anticorpos IgM. Conforme mostra o esquema nº1, a antiglobuliza é responsável por promover a aglutinação quando as hemácias estão sensibilizadas por anticorpos IgG. Os anticorpos IgG são: 1. Pentâmeros capazes de promover a aglutinação sem adição da AGH; 2. Monômeros por isso necessitam da AGH para promover a aglutinação das hemácias sensibilizadas; 3. Os anticorpos IgG são pentâmeros e reagem à temperatura ótima de 37 C; 4. As opções 1 e 3 estão corretas. Os principais fatores que afetam o teste da antiglobulina são: 1. Temperatura de incubação; 2. Tempo de incubação; 3. Lavagem das células; 4. As opções 1, 2 e 3 estão corretas. O teste de antiglobulina direto (TAD) está indicado para investigação de: 1. Doença Hemolítica Perinatal; 2. Doença Hemolítica Autoimune; 3. Reações Hemolíticas Transfusionais; 4. As opções 1, 2 e 3 estão corretas. 1. DANIELS, G. Human Blood Groups. 2ª ed. Blackwell Science - 2002. 2. HARMENING, D. Técnicas Modernas em Banco de Sangue e Transfusão. 4ª ed - Editora Revinter,2006. 3. RDC 153, de 14 de Junho de 2004. Página 6 de 6