Replicação do DNA e Cromossomos

Características básicas da replicação do DNA In Vivo É semiconservativa, Inicia-se em origens únicas Geralmente é bidirecional a partir de cada origem de replicação.

A replicação do DNA é Semiconservativa Cada fita serve de molde A complementaridade do pareamento de bases determina a sequência da nova fita Cada fita da hélice parental é conservada

Modos possíveis para replicação do DNA

Centrifugação de equilíbrio por gradiente de densidade com CsCl

O experimento de Meselson-Stahl: A replicação do DNA em E. coli é semiconservativa

A Origem de Replicação em E. coli

Visualização da Replicação em E. coli

Replicação Bidirecional do Cromossomo Circular de E. coli

A Replicação é Bidirecional

Pontos principais A replicação do DNA ocorre por um mecanismo semiconservativo: a medida que os dois filamentos complementares da dupla hélice se desenrolam e se separam, cada filamento serve de molde para sínteses de um novo filamento complementar. Os potenciais de ligação de hidrogênio das bases nos filamentos molde especificam sequências de base complementares nos filamentos de DNA nascentes. A replicação inicia-se em origens únicas e geralmente prossegue nas duas direções a partir de cada origem.

Replicação do DNA em Procariotos A replicação do DNA é um processo complexo, que exige a ação conjunta de um grande número de proteínas.

DNA Polimerase I

Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Replicon: 1. Origem + Término 2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 3. O genoma de uma célula procariótica constitui um único replicon 4. Cada cromossomo eucariótico vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente

genoma eucariótico vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/s Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática

Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas

Fita contínua (líder) Fita descontínua

DNA Polimerases Síntese de DNA: adição de nucleotídeos a extremidade 3 OH da cadeia em crescimento. Matéria-prima: desoxiribonucleosídeo 5 trifosfato Sentido da síntese sempre é 5 3 As DNA-polimerases tem atividade revisora

Desoxiribonucleosídeo 5 trifosfato (precursor) Fita sendo polimerizada Fita molde

As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

correto Pareamento de bases incorreto

Atividade revisora 3 5 garante a fidelidade da replicação

Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I PolII PolIII Polimerização 5 3 + + + Exonuclease 3 5 + + + Exonuclease 5 3 + - - Número de subunidades 1 4 10 Tamanho em kda 103 90 ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000 Processividade 3-200 1500 500000 (nt adicionados antes da dissociação do molde)

DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica

Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli DnaA DnaB (helicase) DnaC HU Primase (DnaG) Single strand binding (SSB) RNA polimerase DNA girase Dam Metilase Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos Desenrola o DNA Auxilia a ligação de DnaB na origem Proteína do tipo histona que estimula a iniciação Sintetiza os primers de RNA Liga a fita simples de DNA Facilita a ação da DnaA Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita Metila as sequências GATC na OriC

Pré-iniciação da replicação em oric in E. coli

A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA Síntese da Fita descontínua Fita descontínua Fita contínua Síntese da Fita Contínua

RNA Primers são usados para iniciar a síntese de DNA

Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras

A DNA ligase sela as quebras

Mecanismo de ação da DNA ligase

Síntese das fitas contínua e descontínua é independente

O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas

DNA Polymerase I: 5' 3' atividade de Polimerase

DNA Polymerase I: 5' 3' atividade de Exonuclease

DNA Polymerase I: 3' 5' atividade de Exonuclease

DNA Helicase catalisa o desenrolamento da dupla hélice parental

Proteína de ligação ao DNA unifilamentar (SSB)

Helicases evitam a formação de super-hélices

DNA Topoisomerase I Produz quebras unifilamentares

Necessidades das DNA Polimerases Primer DNA com 3'-OH livre Molde de DNA para especificar a sequência da nova fita Substrato: dntps Mg 2+

Phage T7 Polymerase

DNA Polymerase III em E. coli

E. coli DNA Polymerase III Holoenzyme

Revisão

A replicação em E. coli

E. coli: Replisomo

Aspecto únicos da replicação em Eucariotos Embora as principais características da replicação de DNA sejam iguais em todos os organismos, alguns processos ocorrem apenas em eucariotos.

DNA Replication in Eukaryotes Shorter RNA primers and Okazaki fragments DNA replication only during S phase Multiple origins of replication Nucleosomes Telomeres

Bidirectional Replication from Multiple Origins in Eukaryotes

Múltiplos replicons por cromossomo

O Replisomo eucariótico

O problema do Telômero

Telomerase

Comprimento do Telomero e envelhecimento A maioria das células somáticas perde atividade da telomerase. Telomeres curtos são associados com senescência e morte celular. Doenças que causam envelhecimento prematuro são associadas com encurtamento de telômeros.

Pontos chave Replicação bidirecional com múltiplas origens. Duas ou três DNA polimerases ( e/ou e) estão presentes na forquilha de replicação. Telomeros são adicionados ao cromossomo por uma enzima chamada telomerase.