Influência do veículo na resposta tecidual e da capacidade de mineralização de um cimento reparador experimental FACULDADE DE ODONTOLOGIA

Campus de Araçatuba FACULDADE DE ODONTOLOGIA DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA RESTAURADORA DISCIPLINA DE ENDODONTIA LUCIANA SOLERA SALES Influência do veículo na resposta tecidual e da capacidade de mineralização de um cimento reparador experimental ARAÇATUBA-SP 21

Campus de Araçatuba LUCIANA SOLERA SALES Influência do veículo na resposta tecidual e da capacidade de mineralização de um cimento reparador experimental Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Odontologia. Orientador: Prof. Titular João Eduardo Gomes Filho ARAÇATUBA-SP 21

Dedicatória Aos meus pais, José Roberto da Costa Sales e Marli Solera, que me deram a vida e foram meus primeiros mestres, me dando todo o apoio e incentivo que me mantiveram perseverante nessa jornada. Dedico este trabalho a eles, que cоm muito carinho е apoio, nãо mediram esforços para que eu chegasse аté esta etapa da minha vida. Ao Professor Titular João Eduardo Gomes Filho, que me deu oportunidade de participar do projeto de pesquisa, me aceitando com todo carinho, atenção e dedicação.

AGRADECIMENTOS À Deus, pelo dom da vida, por iluminar sempre os meus passos, ter colocado pessoas maravilhosas ao meu lado e por me conceder sabedoria para aproveitar essa oportunidade de aprendizado. Ao Professor João, minha admiração por tamanha humildade e simplicidade com que transmite o saber, pelo acolhimento, pela amizade, apoio, ensinamentos, confiança, pela paciência durante todo esse tempo e por me dar a oportunidade de iniciar na pesquisa científica. À minha família, meu eterno muito obrigado por não medirem esforços para que tudo desse certo. Ao meu namorado, Régis de Oliveira Fialho, com amor, admiração e gratidão por sua compreensão, carinho e incansável apoio ao longo do período de elaboração desse trabalho. À Índia Olinta de Azevedo e Christine Men Martins, ambas alunas de pós-graduação do Departamento de Odontologia Restauradora Disciplina de Endodontia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, que muito me ensinaram sobre a metodologia desta pesquisa, organização dos trabalhos e apresentações em Congressos. À minha amiga Nicole Andrade Guinossi, pelo companheirismo nesses 5 anos de faculdade, pela amizade, torcida e ajuda em todos os momentos. À minha companheira de estágio e graduação, Letícia Santini Vernier, que sempre me acompanhou no desenvolvimento deste trabalho, agradeço pela amizade e ótima convivência. Aos professores de Endodontia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Eloi Dezan Júnior, Luciano Tavares Angelo Cintra, Gustavo Sivieri, Rogério Castilho, por terem contribuído de forma inestimável com a minha formação ao longo do curso de graduação.

Aos funcionários da Disciplina de Endodontia, Nelci, Elaine e Peterson, pela disponibilidade e auxílio indispensável para o desenvolvimento do trabalho. À Faculdade de Odontologia de Araçatuba pela formação acadêmica e oportunidades de aprendizado. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pela concessão do auxílio no desenvolvimento dessa pesquisa. Enfim, a todos que, de alguma maneira, colaboraram para minha formação e realização deste trabalho.

A nova fonte de poder não é o dinheiro nas mãos de poucos, mas informações nas mãos de muitos. John Naisbitt.

SALES, LS. Influência do veículo na resposta tecidual e da capacidade de mineralização de um cimento reparador experimental. Trabalho de Conclusão de Curso Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 21. RESUMO O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta tecidual e a capacidade de mineralização de um cimento reparador experimental (CER) usando água ou resina como veículos comparando com o cimento MTA Ângelus. Foram utilizados 3 ratos e todos os animais receberam individualmente quatro implantes de tubos de polietileno, sendo três contendo os cimentos a serem testados e mais um tubo vazio como controle. Os períodos de avaliação foram de 7, 15, 3, e 9dias. Após cada período pós-operatório, seis animais de cada grupo foram sacrificados e os tubos de polietileno juntamente com o tecido que o circunda foram removidos, fixados em glicol metacrilato e processados para análise microscopia, com inclusão em glicol metacrilato e coloração por, Von Kossa e sem coloração para análise com luz polarizada. O critério de avaliação foi de : nenhuma ou poucas células e nenhuma reação; 1: menos de 25 células e reação leve; 2: entre 25 e 125 células e reação moderada; 3: 125 ou mais células e severa reação. Cápsula fibrosa foi considerada fina quando < 15μm e espessa quando > 15μm. Presença de mineralização foi registrada como presente ou ausente. Os resultados foram analisados estatisticamente pelos testes de ANOVA e Kruskal Wallis. O controle, aos 7 e 15 dias, observou-se uma resposta inflamatória moderada e aos 3, e 9 dias, uma resposta inflamatória leve, ausência de estruturas birrefringente a luz polarizada e de áreas de mineralização. Os espécimes que continham o tubo com MTA, CER Água e CER resina apresentaram aos 7 e 15 dias, uma resposta inflamatória moderada com redução com o tempo. Aos 3 dias os espécimes que continham o tubo com CER Resina ainda apresentou uma resposta inflamatória moderada, já os com MTA e CER Água apresentaram uma resposta inflamatória leve. Aos e 9dias foi encontrada uma resposta inflamatória leve em todos os grupos. Estruturas birrefringentes a luz polarizada e áreas de mineralização foram encontradas, em todos os tempos avaliados e em todos os grupos. Os resultados desse estudo nos mostram que o CER Água e CER Resina são biocompatíveis e induzem a mineralização. Palavras chaves: MTA. Biocompatibilidade. Mineralização.

SALES, LS. Influência do veículo na resposta tecidual e da capacidade de mineralização de um cimento reparador experimental. Trabalho de Conclusão de Curso Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 21. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the tissue response and mineralization ability of an experimental repair cement (CER) using water or resin as vehicles compared to the MTA Angelus cement. Thirty rats were used and all animals received four individual polyethylene tubes containing three of the cements to be tested and one empty tube as control. The evaluation times were 7, 15, 3, and 9 days. After each period, six animals from each group were killed and the polyethylene tubes with tissue that surrounds were removed, fixed in glycol methacrylate and processed for histologycal analysis, embedded in glycol methacrylate and staining with hematoxylin and eosin, von Kossa and without staining for analysis with polarized light. The evaluation criterion was : no or few cells and no reaction; 1: less than 25 cells and mild reaction; 2: between 25 and 125 cells and moderate reaction; 3: 125 or more cells and severe reaction. fibrous capsule was considered thin when <15μm thick when> 15μm. mineralization presence was recorded as present or absent. The results were analyzed statistically by ANOVA and Kruskal-Wallis tests. The control on 7 and 15 days, showed a moderate inflammatory response at 3, and 9 days, a mild inflammatory response, no structures birefringent to polarized light and mineralization areas. The specimens containing the tube with MTA, CER Water and CER Resin presented on 7 and 15 days, a moderate inflammatory response with a reduction over time. On 3 days the specimens containing the tube with CER Resin also presented a moderate inflammatory response, as the MTA and CER Water showed a mild inflammatory response. On and 9 days a mild inflammatory response was found in both groups. Structures birefringent polarized light and mineralized areas were found at all times and evaluated in both groups. The results of this study showed that the CER Water and CER Resin were biocompatible and induce mineralization. Keywords: MTA. Biocompatibility. Mineralization.

LISTA DE FIGURAS E DE TABELAS Figura 1 - Resposta inflamatória encontrada aos 7 dias 19 Figura 2 - Resposta inflamatória encontrada aos 15 dias 2 Figura 3 - Resposta inflamatória encontrada aos 3 dias 21 Figura 4 - Resposta inflamatória encontrada aos dias 22 Figura 5 - Resposta inflamatória encontrada aos 9 dias 23 Tabela 1 - Percentagem de amostras em cada grupo classificados de acordo com a resposta inflamatória, espessura da cápsula fibrosa e escores da mineralização 25

LISTA DE ABREVIATURAS Al 2 O 3 = Óxido de Alumínio Bi 2 O 3 = Óxido de Bismuto CaO = Óxido de Cálcio CER = Cimento Endodôntico Rápido CEUA = Comitê de Ética no Uso do Animal Fe 2 O 3 = Óxido de Ferro GMA = Glicol Metacrilato = Hematoxilina e Eosina K 2 O = Óxido de Potássio = Luz Polarizada MgO = Óxido de Magnésio MTA = Agregado Trióxido Mineral Na 2 O = Óxido de Sódio SiO 2 = Dióxido de silício SO 3 = Óxido Sulfúrico = Von Kossa

SUMÁRIO 1 Introdução 11 2 Proposição 13 3 Material e Métodos 14 3.1 Materiais Experimentais 14 3.2 Tubos de Polietileno 14 3.3 Anestésico 14 3.4 Teste de Biocompatibilidade 15 3.5 Procedimentos Cirúrgicos 15 3. Processamento laboratorial e técnica histológica para avaliação da resposta 1 inflamatória e capacidade de mineralização 3.7 Critério para Análise Estatística Quantitativa 1 4 Resultados 18 5 Discussão 2 Conclusão 28 Referências 29 Anexos 33

11 1 Introdução O sucesso do tratamento endodôntico depende de uma limpeza profunda do sistema de canais radiculares, do controle de microorganismos patogênicos e, finalmente, do completo selamento tridimensional do canal radicular com materiais obturadores que apresentam propriedades físicas e biológicas apropriados, proporcionando condições para que ocorra o processo de reparação tecidual e prevenindo uma possível reinfecção (BERNARDES et al., 21; GOMES FILHO et al., 28; GOMES FILHO et al., 29; NASSRI et al., 23; SCELZA et al., 25; VALERA et al., 2; VALERA et al., 25). Um cimento endodôntico ideal deve ser biocompatível, apresentar adesividade e estabilidade dimensional, não ser irritante aos tecidos periapicais, ter capacidade de induzir osteogênese e cementogênese, ser de fácil preparo, estéril, radiopaco e não ter capacidade de expansão. Com o intuito de alcançar esses objetivos, existem atualmente no mercado diversas pastas e cimentos, com as mais variadas bases: óxido de zinco e eugenol, resina epóxica, ionômero de vidro, hidróxido de cálcio, Agregado Trióxido Mineral (MTA) (BERNARDES et al., 21; GOMES FILHO et al., 28; GOMES FILHO et al., 29; GOMES FILHO et al., 29a; MOTA et al., 21; NASSRI et al., 23; VALERA et al., 25). Agregado trióxido mineral (MTA) foi introduzido na década de 9 para ser utilizado nas perfurações radiculares tanto patológicas quanto iatrogênicas, bem como no ápice radicular (LEE et al., 1993; TORABINEJAD et al., 1993). Porém, devido às suas excelentes propriedades passou a ser utilizado também em pulpotomias, capeamentos pulpares diretos, apicogêneses e apicificações (CHIVIAN; TORABINEJAD, 1999). Tem características positivas, tais como favoráveis reações dos tecidos, caracterizados pela ausência de várias respostas inflamatórias, a presença de uma cápsula fibrosa e a indução de formação de tecido de reparação mineralizado (BERNABE et al., 25; PITT FORD et al., 1995). Pode ser utilizado mesmo na presença de humidade, devido à natureza hidrofílica das partículas do pó de MTA (TORABINEJAD et al., 1993). Estudos demonstraram que o MTA tem comportamento semelhante ao hidróxido de cálcio quando aplicado nos diferentes tecidos (HOLLAND et al., 1999). Estudos mostram que o MTA é um material biocompatível, radiopaco, possui atividade antimicrobiana, apresenta boa capacidade de selamento marginal, induz dentinogênese, cementogênese e osteogênese (MAROTO et al., 2; TANOMARU et al., 28; THOMSON et al., 23 TORABINEJAD et al., 1995). Recentemente um novo tipo de cimento foi desenvolvido, CER (SANTOS et al., 25), que é uma formulação composta de cimento de Portland em gel, de água, sulfato de bário, e um emulsificante (proprietário), cuja função é a de melhorar as propriedades de manuseamento. O nome CER vem de cimento endodôntico rápido. Um estudo anterior mostrou que o CER tem a mesma capacidade do Ângelus MTA (Ângelus soluções Odontológicas, Londrina, Brasil) para liberar os íons de hidroxila e de cálcio (SANTOS et al., 25), o tempo de presa 7 ± 1 minuto comparado com 15 ± 1 minuto comparado com o cimento Ângelus MTA e o coeficiente de expansão é similar ao da dentina (SANTOS et al., 28).

Estudos foram realizados e os resultados observados com CER utilizando água como veículo foram semelhantes aos Ângelus MTA. A resposta inflamatória crônica moderada reduziu com o tempo, foi observada uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso fino que envolve o tubo. Áreas positivas de Von Kossa e também foram observadas estruturas birrefringentes sob luz polarizada mostrando que o material estimula a formação de tecido mineralizado em tecidos subcutâneos de ratos através da formação de carbonato de cálcio a partir do cálcio e formação de dióxido de carbono a partir do tecido circundante (GOMES FILHO et al., 29). A resina como veículo tem a capacidade de melhorar suas propriedades físicas, contudo, as propriedades biológicas precisam ser mantidas ou aprimoradas. 12

13 2 Proposição O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta tecidual e a capacidade de mineralização do CER água, CER resina e Ângelus MTA, frente a implantes de tubos de polietileno em tecido subcutâneo de ratos, através de técnicas histológicas e de forma quantitativa e qualitativa. Objetivos específicos: Analisar e quantificar a resposta inflamatória; Observar por meio da Luz Polarizada e coloração de Von Kossa a presença de tecido mineralizado;

14 3 Material e Métodos 3.1 Materiais Experimentais Foram empregados o cimento CER + água (Ilha Solteira, Brasil), CER + resina (Ilha Solteira, Brasil) e o cimento reparador Ângelus MTA (Ângelus Indústria de Produtos Odontológicos S/A, Londrina, Brasil). Cimento Reparador Ângelus MTA O Ângelus MTA é um cimento composto de óxidos minerais na forma de finas partículas hidrofílicas. Apresenta na sua composição SiO 2, K 2 O, Al 2 O 3, Na 2 O, Fe 2 O 3, SO 3, CaO, Bi 2 O 3 e MgO. Além de resíduos insolúveis de sílica cristalina, óxido de cálcio e sulfatos de potássio e sódio. O seu tempo de presa inicial, segundo o fabricante, é de aproximadamente 1 minutos e o final de 15 minutos. Cimento endodôntico rápido (CER) O CER é um cimento composto por cimento de Portland em gel, de água, sulfato de bário, e um emulsificante (proprietário), cuja função é a de melhorar as propriedades de manuseamento (SANTOS et al., 25). Temos o CER água, que é manipulado com água e o CER resina que é manipulado com resina. 3.2 Tubos de Polietileno Foram utilizados 12 tubos de polietileno (Abbott. Lab. do Brasil, São Paulo SP) estéreis com 1,mm de diâmetro interno e 1,mm de diâmetro externo e 1,mm de comprimento. Os materiais, depois de manipulados segundo as recomendações dos fabricantes, foram introduzidos nos tubos de polietileno de forma a preenchê-los completamente. No grupo controle, os tubos permaneceram vazios. 3.3 Anestésico Foram empregados como sedativo Dopaser (Laboratórios Calier AS, Barcelona Espanha), a base de xilazina (relaxante muscular, analgésico e sedativo) na dosagem de 1mg/Kg de peso corporal e como anestésico o Vertanacol (Fort Dodge, Iowa EUA) a base de cloridrato de ketamina a 5% na dosagem de 25mg/Kg de peso corporal.

15 3.4 Teste de Biocompatibilidade Para a realização deste trabalho, foram utilizados 3 ratos machos (Wistar), com idades aproximadas de 3 dias, pesando aproximadamente 25g, sendo provenientes do biotério da Faculdade de Odontologia de Araçatuba UNESP. Os animais foram mantidos em ambientes com temperatura entre 22 C e 24 C, com ciclo de Luz controlada (12 horas claro e 12 horas escuro) e em gaiolas coletivas, contendo seis ratos por gaiola. No interior das gaiolas havia cama de serragem, a qual foi trocada diariamente. Esses animais foram alimentados antes e durante todo o período experimental, com ração sólida triturada e água ad libitum, exceto nas primeiras 12 horas pré e pós-operatórias. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso do Animal (CEUA) processo FOA n o 215-451. 3.5 Procedimentos Cirúrgicos Para a realização das intervenções cirúrgicas, os animais foram inicialmente pesados e anestesiados. O período de trabalho com cada animal não ultrapassou 5 minutos para não haver necessidade de complementação anestésica. Após a anestesia dos 3 ratos, foi feita a tricotomia da região dorsal e a lavagem da área com a finalidade de se evitar contaminação do campo cirúrgico pela presença de pêlos. A anti-sepsia da área desprovida de pelos foi efetuada esfregando uma gaze embebida em solução aquosa 1% de PVPI (Áster Produtos Médicos, Sorocaba Brasil) por dois minutos. Em seguida, iniciou o procedimento cirúrgico, fazendo-se uma incisão com lâmina de bisturi número 15 (Shangai-Med. Sn, Shangai China), no dorso do animal, (tendo a coluna vertebral como linha média de marcação). Foram criadas quatro bolsas por divulsionamento, sendo duas para o lado direito e duas para o lado esquerdo da incisão. De cada lado, por tanto, foram criadas duas bolsas sendo uma na porção cranial e outra na porção caudal do animal. Com auxílio de uma pinça reta, cada bolsa recebeu um tubo contendo um dos três materiais. A quarta bolsa recebeu um tubo vazio como controle. Assim, cada animal recebeu quatro tubos, três preenchidos com os materiais a serem testados (CER água, CER resina e Ângelus MTA) e um tubo vazio (controle). O tecido foi suturado com fio de seda (4,) (Ethicon Inc., San Ângelo EUA) não reabsorvível e anti-sepsia final, foi realizada com PVPI 1%.

1 Os animais foram acompanhados até se recuperarem da anestesia antes de retornarem ao biotério. 3. Processamento Laboratorial e técnica histológica para avaliação da resposta inflamatória e capacidade de mineralização Os períodos de avaliação foram de 7, 15, 3, e 9 dias. A cada tempo experimental, seis animais foram sacrificados por meio de uma dose excessiva de anestésico Tiopental Sódico na dosagem de 1mg/kg de peso. Após o sacrifício, foi realizada novamente uma tricotomia da região dorsal, e anti-sepsia da área com PVPI 1%. Logo após, realizou uma nova incisão com lâmina de bisturi número 15, tendo a coluna vertebral como linha média de marcação, os tubos foram localizados e removidos juntamente com os tecidos que os envolvem e foram fixados em solução formalina 1% ph 7. As amostras foram processadas e incluídas em glicol metacrilato (GMA) (GOMES FILHO et al., 21), cortadas seriadamente em 3 μm para serem coradas com hematoxilina e eosina (); 1 μm para serem coradas de acordo com a técnica de Von Kossa () ou permanecerem sem coloração para serem observadas sob luz polarizada (). A análise histomorfológica qualitativa do processo inflamatório consistiu na descrição dos fenômenos inflamatórios observados microscopicamente nos cortes teciduais representativos de cada grupo e tempos pós-operatórios. A análise quantitativa foi realizada por meio da atribuição de escores, graduando a importância dos fenômenos microscópicos observados separadamente. Foi realizada a determinação das condições microscópicas das estruturas examinadas, em itens distintos, e avaliadas sob a forma de escores de a 3, para resposta inflamatória (COSTA et al., 2; FEDERATION DENTAIRE INTERNATIONAL, 198; OZBAS et al., 23; YALTIRIK et al., 24). Cápsula fibrosa foi considerada fina quando < 15μm e espessa quando > 15μm. Necrose e formação de calcificação foram registradas como presente ou ausente. Possibilitando dessa maneira, dados objetivos para uma análise estatística posterior com teste de Anova e Kruskal Wallis. 3.7 Critério Para Análise Estatística Quantitativa A) Infiltrado Inflamatório:

17 : Nenhuma: nenhuma ou poucas células; 1: Leve: inferior a 25 células; 2: Moderado: entre 25 e 125 células; 3: Severo: superior a 125 células (desorganização do tecido). B) Cápsula Fibrosa: Fina- até 15μm Espessa- maior que 15μm C) Mineralização: Presente Ausente Análise Estatística A avaliação microscópica dos cortes teciduais mais representativos de cada grupo e tempo pós-operatório foram realizados por dois observadores e os dados encontrados foram submetidos à análise estatística pelo programa Graph Prism 5. utilizando-se o Teste de ANOVA e Kruskal Wallis, sendo o nível de significância p<,5.

18 4 Resultados Controle (tubos vazios) Aos 7 e 15 dias, foi observado um infiltrado inflamatório moderado consistindo de linfócitos e macrófagos que estavam presentes na cápsula fibrosa espessa. Aos 3, e 9 dias foi observado um infiltrado inflamatório leve consistindo de linfócitos e macrófagos que estavam presentes na cápsula fibrosa fina. O controle não foi positivo para Von Kossa e granulações birrefringentes a luz polarizada foram ausentes. CER Água Aos 7 e 15 dias, foi encontrada uma resposta inflamatória moderada consistindo de linfócitos e macrófagos presentes na cápsula fibrosa espessa. A intensidade da inflamação foi reduzida aos 3, e 9 dias com presença de cápsula fibrosa fina. Coloração de Von Kossa positivo e presença de granulações birrefringentes a luz polarizada foram observadas em todos os períodos avaliados. CER Resina Aos 7, 15 e 3 dias foi encontrada uma resposta inflamatória moderada consistindo de linfócitos e macrófagos presentes na cápsula fibrosa espessa, presença de granulações birrefringentes a luz polarizada e coloração de Von Kossa positivo. Aos e 9 dias foi encontrada uma resposta inflamatória leve com cápsula fibrosa fina. Coloração de Von Kossa positivo e presença de granulações birrefringentes a luz polarizada também foram observadas. MTA Ângelus Aos 7 e 15 dias foi encontrada uma resposta inflamatória moderada consistindo de linfócitos e macrófagos presentes na cápsula fibrosa fina. Aos 3, e 9 dias foi observada uma resposta inflamatória leve consistindo de linfócitos e macrófagos presentes na cápsula fibrosa fina. Estruturas birrefringentes a luz polarizada e coloração de Von Kossa positivo foram encontradas em todos os tempos.

19 Figura 1: Resposta inflamatória encontrada aos 7 dias. Controle: (A) Presença de cápsula fibrosa espessa com resposta inflamatória moderada consistindo de macrófagos e linfócitos (hematoxilina e eosina, 1X); (B) mineralização ausente (Von Kossa, 1X); (C) ausência de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). MTA: (D) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória moderada (hematoxilina e eosina, 1X); (E) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (F) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Água: (G) Presença de cápsula fibrosa espessa com resposta inflamatória moderada (hematoxilina e eosina, 1X); (H) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (I) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Resina: (J) Presença de cápsula fibrosa espessa com resposta inflamatória moderada (hematoxilina e eosina, 1X); (K) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (L) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). 7 Dias Controle A B MTA D E CER Água G H CER Resina J K

2 Figura 2: Resposta inflamatória encontrada aos 15 dias. Controle: (A) Presença de cápsula fibrosa espessa com resposta inflamatória moderada consistindo de macrófagos e linfócitos (hematoxilina e eosina, 1X); (B) mineralização ausente (Von Kossa, 1X); (C) ausência de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). MTA: (D) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória moderada (hematoxilina e eosina, 1X); (E) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (F) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Água: (G) Presença de cápsula fibrosa espessa com resposta inflamatória moderada (hematoxilina e eosina, 1X); (H) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (I) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Resina: (J) Presença de cápsula fibrosa espessa com resposta inflamatória moderada (hematoxilina e eosina, 1X); (K) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (L) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). 15 Dias Controle A B MTA D E CER Água CER Resina J K J K

21 Figura 3: Resposta inflamatória encontrada aos 3 dias. Controle: (A) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve consistindo de macrófagos e linfócitos (hematoxilina e eosina, 1X); (B) mineralização ausente (Von Kossa, 1X); (C) ausência de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). MTA: (D) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (E) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (F) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Água: (G) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (H) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (I) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Resina: (J) Presença de cápsula fibrosa espessa com resposta inflamatória moderada (hematoxilina e eosina, 1X); (K) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (L) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). 3 Dias Controle A B MTA D CER Água G H CER Resina J K

22 Figura 4: Resposta inflamatória encontrada aos dias. Controle: (A) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve consistindo de macrófagos e linfócitos (hematoxilina e eosina, 1X); (B) mineralização ausente (Von Kossa, 1X); (C) ausência de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). MTA: (D) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (E) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (F) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Água: (G) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (H) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (I) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Resina: (J) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (K) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (L) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). Dias Controle A B MTA D E CER Água G H CER Resina

23 Figura 5: Resposta inflamatória encontrada aos 9 dias. Controle: (A) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve consistindo de macrófagos e linfócitos (hematoxilina e eosina, 1X); (B) mineralização ausente (Von Kossa, 1X); (C) ausência de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). MTA: (D) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (E) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (F) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Água: (G) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (H) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (I) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). CER Resina: (J) Presença de cápsula fibrosa fina com resposta inflamatória leve (hematoxilina e eosina, 1X); (K) mineralização presente (Von Kossa, 1X); (L) presença de estruturas birrefringentes a luz polarizada (Luz Polarizada, 1X). 9 Dias Controle A B MTA D E CER Água H CER Resina J

24 Comparação entre os grupos Não houve diferença estatística significativa (p>,5) para resposta inflamatória para os grupos e todos os tempos experimentais. Quanto a mineralização, todos os materiais testados permitiram a formação de granulações birrefringentes a luz polarizada, bem como áreas Von Kossa positivas sem diferença entre os materiais nos tempos experimentais Os dados foram comparados em cada tempo experimental e estão apresentados na tabela 1.

25 Tabela 1. Percentagem de amostras em cada grupo classificados de acordo com a resposta inflamatória, espessura da cápsula fibrosa e escores da mineralização. Escores Resposta inflamatória Mineralização Tempo Material 1 2 3 Cápsula 7 dias 15 dias 3 dias dias 9 dias Controle MTA CER Água CER Resina Controle MTA CER Água CER Resina Controle MTA CER Água CER Resina Controle MTA CER Água CER Resina Controle MTA CER Água CER Resina 1 1 1 2 4 4 5 2 5 5 5 5 5 5 4 4 2 2 1 4 1 1 1 1 1 Espessa Fina Espessa Espessa Espessa Fina Espessa Espessa Fina Fina Fina Espessa Fina Fina Fina Fina Fina Fina Fina Fina

2 5 Discussão As reações a tubos vazios neste estudo causaram reações semelhante aos resultados previamente relatados (GOMES FILHO et al., 21; GOMES FILHO et al.,28; GOMES FILHO et al., 29; HOLLAND et al., 1999; OZBAS et al., 23). Os resultados observados com o CER água foram semelhantes aos do Ângelus MTA e o grupo controle. Uma resposta inflamatória moderada foi encontrada nos dias 7 e 15, que reduziu com o tempo, observou-se uma cápsula espessa de tecido conjuntivo fibroso que rodeia o tubo. Áreas positivas de Von Kossa e estruturas birrefringentes sob luz polarizada, foram também observadas, mostrando que o material estimula a formação de tecido mineralizado, em tecidos subcutâneos de ratos através da formação de carbonato de cálcio a partir do cálcio do material e dióxido de carbono a partir do tecido circundante (HOLLAND et al., 1999). Estes resultados foram semelhantes a outros mencionados em estudos anteriores (GOMES FILHO et al., 29). Cimentos a base de MTA são materiais endodônticos com propriedades químicas que favorecem o processo de cicatrização (HOLLAND et al., 1985; HOLLAND et al., 1999; SALLES et al., 212). O óxido de cálcio presente no material reage com os fluidos do tecido para formar hidróxido de cálcio, que em contato com a água dissociam em íons cálcio e íons hidroxila. A difusão de íons hidroxila aumenta o ph na superfície da raiz adjacente aos tecidos periodontais, possivelmente interferindo com a atividade osteoclástica, e a alcalinização favorece o processo de cura (TRONSTAD et at.,1981). Os íons cálcio reagem com o gás carbônico presente no tecido de modo a formar cristais de carbonato de cálcio (estruturas birrefringentes à luz polarizada), que servem como um núcleo para a calcificação, estimulando a deposição de tecido mineralizado (HOLLAND et al., 1999; SEUX et at.,1991). Tais atividades biológicas podem explicar a presença de áreas positivas para Von Kossa e estruturas birrefringentes à luz polarizada, que foram os tipos de análises feitas na pesquisa. Vários estudos têm demonstrado a biocompatibilidade do MTA, sua atividade antimicrobiana, capacidade osteocondutora e de promover a formação de tecido duro. Além de aumentar os níveis de fosfatase alcalina, osteopontina e osteocalcina e estimular a

27 liberação do íon cálcio (AL-ZAIMI et al., 2; DE VASCONCELOS et al., 29; DUARTE et al., 23; GANDOLFI et al., 214; HOLLAND et al., 1999; HOLLAND et al., 22; HUANG et al., 25; KOH et al., 1997; LEE et al., 214; TANOMARU et al., 28; TANOMARU FILHO et al., 29; THOMSON et al., 23). CER é composto por cimento Portland em gel com água, sulfato de bário, e um emulsivicante, cuja função é melhorar as propriedades de manuseamento, que tem a mesma capacidade do Angelus MTA para liberar ions de hidróxido de cálcio (SANTOS et al., 25), apresenta menor tempo de presa, e um coeficiente de expansão similar à dentina (SANTOS et al., 28). O comportamento do CER no tecido subcutâneo, no presente estudo foi semelhante ao observado com o MTA Angelus, incluindo o estímulo da mineralização, provavelmente como resultado da presença de cimento Portland na sua composição. A semelhança entre o mecanismo do MTA e do cimento Portland no tecido subcutâneo de ratos já foi demonstrado (HOLLAND et al., 21). O comportamento favorável de CER, no presente estudo, também pode ser explicado pela sua capacidade para liberar ions de cálcio e óxido,semelhantes ao MTA (SANTOS et al., 25), que são importantes para a indução da mineralização (HOLLAND et al., 1999; SCHRODER, 1985; SEUX et al., 1991; TRONSTAD et al., 1981).

28 Conclusão Os resultados desse estudo sugerem, com base nas metodologias empregadas, que a resposta encontrada no tecido subcutâneo de ratos para o CER água, CER resina e MTA foram semelhantes. E é possível concluir que o CER água e CER resina são biocompatíveis e induzem a mineralização.

29 Referências AL-ZAIMI, K. et al. Antibacterial effect of two mineral trioxide aggregate (MTA) preparations against Enterococcus faecalis and Streptococcus sanguis in vitro. Journal of Endodontics., v.32, n.11, p.153-15, nov.2. BERNABE, P.F. et al. Comparative study of MTA and other materials in retrofilling of pulpless dogs teeth. Braz Dent J., v.1, n.2, p.149-155, maio/agost. 25. BERNARDES, R.A. et al. Evaluation of the flow rate of 3 endodontic sealers: Sealer 2, AH Plus, and MTA Obtura. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., v.19, n.1, p. E47-E49, jan. 21. COSTA, C.A.S. et al. Biocompatibility of two current adhesive resins. Journal of Endodontics., v.2, n.9, p. 512-51, set.2. DE VASCONCELOS, B.C. et al. Evaluation of ph and calcium ion release of new root-end filling materials. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics., v.18, n. 1, p.135-139, jun.29. DUARTE, M.A. et al. ph and calcium ion release of 2 root-end filling materials. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics., v.95, n.3, p.345-347, abr.23. FEDERATION DENTAIRE INTERNATIONAL. Recommended standart practices for biological evaluation of dental materials. Federation Dentaire International Commission on Dental Materials, Equipment, and Theropeutics. (198) Part 4.11: Subcutaneous implantation test. International Dental Journal, v, 3, p. 173 174. GANDOLFI, M.G. et al. Ion release, porosity, solubility, and bioactivity of MTA Plus tricalcium silicate. Journal of Endodontics., v.4, n.1, p.132-137, out.214. GOMES FILHO, J.E. et al. A Mineral Trioxide Aggregate Sealer Stimulated Mineralization. Journal of Endodontics., v.35, n.2, p.25-2, fev.29. GOMES FILHO, J.E. et al. Evaluation of the effects of endodontic materials on fibroblast viability and cytokine production. Journal of Endodontic., v.35, n.11, p.1577-1579, nov.29. GOMES FILHO, J.E. et al. Evaluation of the Tissue Reaction to Fast Endodontic Cement(CER) and Angelus MTA. Journal of Endodontics., v.35, n.1, p.1377-138, out. 29. GOMES FILHO, J.E. et al. Glycol Methacrylate: An alternative method for embedding subcutaneous implants. Journal of Endodontics., v.27, n.4, p.2-28, abr.21.

3 GOMES FILHOS, J.E. et al. Reaction of rat connective tissue to a new calcium hydroxide based sealer. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., v. 1, n.2, p.e71- E7, agost.28. HOLLAND, R. et al. Reaction of rat connective tissue to implanted dentin tubes filled with mineral trioxide aggregate or calcium hydroxide. Journal of Endodontics., v.25, n.3, p.11-1, mar.1999. HOLLAND, R. et al. Reaction of rat connective tissue to implanted dentin tubes filled with a white mineral trioxide aggregate. Brazilian Dental Journal., v.13, n.1, p.23-2, mar.22. HOLLAND, R. et al. Reaction of rat connective tissue to implanted dentin tube filled with mineral trioxide aggregate, Portland cement or calcium hydroxide. Braz Dent J., v.12, n.1, p.3-8, 21. HOLLAND, R.; SOUZA, V. Ability of a new calcium hydroxide root canal filling material to induce hard tissue formation. Journal of Endodontics., v.11, n.12, p.535-543, dec.1985. HUANG, T.H. et al. Biocompatibility of human osteosarcoma cells to root end filling materials. Journal of Biomedical Materials Research. B Applied Biomaterials., v.72b, n.1, p.14-145, jan.25. KOH, E.T. et al. Mineral trioxide aggregate stimulates a biological response in human osteoblasts. Journal of Biomedical Materials Research., v.37, n.3, p. 432-439, dec.1997. LEE, B.N. et al. (214) Effects of mineral trioxide aggregate mixed with hydration accelerators on osteoblastic differentiation. Journal of Endodontics., v.4, n.12, p. 219-223, dec.214. LEE, S.J.; MONSEF, M.; TORABENEJAD, M. Sealing ability of a mineral trioxide aggregate for repair of lateral root perforations. Journal of Endodontics., v.19, n.11, p.541-544, nov.1993. MAROTO, M. et al. Dentin bridge formation after white mineral trioxide aggregate (white MTA) pulpotomies in primary molars. American Journal of Dentistry., v.19, n.2, p.75-79, abr.2. MOTA, C.C.B.O. et al. Propriedades e aspectos biológicos do agregado trióxido mineral: revisão da literatura. Revista Odontologia da UNESP., v.39, n.1, p.49-54, jan/fev.21. NASSRI, M.R.G.; LIA, R.C.C.; BOMBANA, A.C. Análise da resposta tecidual de dois cimentos endodônticos. Journal of Applied Oral Science., v.11, n.1, p.9-14, jan.23. OZBAS, H. et al. Reactions of connective tissue to compomers, composite and amalgam rootend filling materials. International Endodontic Journal., v.3, n.4, p.281-287, abr.23.

31 PITT FORD, T.R. et al. Use of mineral trioxide aggregate for repair of furcal perforations. Oral Surg Oral Med Oral Pathol., v.79, n., p.5-3, jun.1995. SALLES, L.P. et al. Mineral trioxide aggregate-based endodontic sealer stimulates hydroxyapatite nucleation in human osteoblast-like cell culture. Journal of Endodontics., v.38, n.7, p.971-97, jul.212. SANTOS, A.D. et al. Physico-chemical properties of MTA and a novel experimental cement. International Endodontic Jounal., v.38, n.7, p.443-447, jul.25. SANTOS, A.D. et al. Setting time and termal expansion of two endodontic cements. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., v.1, n.3, p. e77-e79, jul. 28. SCELZA, M.F.Z.; SOARES, J.; MACIEL, A.C.C. Avaliação de alguns cimentos endodônticos quanto a obstrução dos túbulos dentinários. RPG Revista Pós-Graduação (USP)., v.12, n.3, p.33-335, 25. SCHRODER, U. Effects of calcium hydroxide-containing pulp-capping agents on pulp cell migration, proliferation, and differentiation. Journal of Dental Research., v.4, p.541-548, abr.1985. SEUX, D. et al. Odontoblast-like cytodifferentiation of human dental pulp cells in vitro in the presence of a calcium hydroxide-containing cement. Archives of Oral Biology., v.3, n.2, p.117-128, 1991. TANOMARU, J.M. et al. Antimicrobial activity of endodontic sealers based on calcium hydroxide and MTA. Acta Odontológica Latinoamericana., v.21, n.2, p.147-151, dez.28. TANOMARU-FILHO, M. et al. Evaluation of ph and calcium ion release of root-end filling materials containing calcium hydroxide or mineral trioxide aggregate. Journal of Endodontics., v.35, n.1, p.1418-1421, out.29. THOMSON, T.S. et al. Cementoblasts maintain expression of osteocalcin in the presence of mineral trioxide aggregate. Journal of Endodontics., v.29, n., p.47-412, jun.23. TORABINEJAD, M. et al. Comparative investigation of marginal adaptation of mineral trioxide aggregate and other commonly used root-end filling materials. Journal of Endodontics., v.21, n., p.295-299, jun.1995. TORABINEJAD, M.; CHIVIAN, N. Clinical applications of mineral trioxide aggregate. Journal of Endodontics., v.25, n.3, p.197-25, mar.1999. TORABINEJAD, M.; WATSON, T.F.; PITT FORD, T.R. Sealing ability of a mineral trioxide aggregate when used as a root end filling material. Journal of Endodontics., v.19, n.12, p.591-595, dec.1993.

32 TRONSTAD, L. et al. ph changes in dental tissues after root canal filling with calcium hydroxide. Journal of Endoddontics., v.7, n.1, p.17-21, jan.1981. VALERA, M.C. et al. Avaliação da compatibilidade biológica do cimento Sealapex e deste cimento acrescido de iodofórmio ou óxido de zinco. Ciência Odontológica Brasileira., v.8, n.4, p.29-38, out/dez.25. VALERA, M.C. et al. Cimentos endodônticos: análise morfológica imediata e após seis meses utilizando microscopia de força atômica. Pesquisa Odontol Bras., v.14, n.3, p.199-24, jul/set.2. YALTIRIK, M. et al. Reactions of Connective Tissue to Mineral Trioxide Aggregate and Amalgam. Journal of Endodontics., v. 3, n.2, p.95-99, fev.24.

Anexos 33