ANÁLISE IN SILICO DE GENES RELACIONADOS À AUTOFAGIA DE TRÊS ISOLADOS DO Paracoccidioides brasiliensis: AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMO. Ana Caroline V.S. Braz, Flavia V. Morais. Universidade do Vale do Paraíba, Faculdade de Ciências da Saúde, Av. Shishima Hifume, N 2911, 12244-000, S.J.Campos, SP, Brasil ana.braz@bol.com.br, flavia@univap.br Resumo- O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico responsável pela paracoccidioidomicose (PCM), que está presente no meio ambiente (18 a 26ºC) como micélio, e, quando em contato com o organismo do hospedeiro, como levedura (36ºC). O termo-dimorfismo é fator determinante para instalação da PCM no homem. Este processo de alteração morfológica pode envolver, entre outros mecanismos, a autofagia, processo de digestão enzimática de material citosólico, cujo produto pode ser reutilizado como suprimento na síntese de novos compostos celulares. Assim, neste trabalho foi analisada a existência de polimorfismo em genes constituintes da etapa de regulação e indução da autofagia em três diferentes isolados de P. brasiliensis (Pb01, Pb03, Pb18). Foi verificado após alinhamento das seqüências, um extenso polimorfismo entre estes isolados, onde Pb01 apresenta índice menor de similaridade em relação aos isolados Pb03 e Pb18. Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, autofagia, polimorfismo, fungo, termo-dimorfismo. Área do Conhecimento: Biomedicina Introdução Autofagia é uma resposta celular a determinadas condições externas estressantes que um organismo eucarioto pode sofrer. Este fenômeno pode estar relacionado a estresses, como privação de nutrientes, hipóxia e altas temperaturas, além de eventos intracelulares, podendo ocorrer devido ao acúmulo demasiado de organelas e componentes citoplasmáticos (LEVINE; KLIONSKY, 2004). A autofagia é vista portanto, como possível fator na adaptação de fungos e outros organismos. Um importante fator atuante na patogenicidade de algumas micoses é o termo-dimorfismo, evento esse que exige aumento de metabolismo celular (TAVARES et al., 2005) e portanto obtenção de energia através possivelmente da autofagia. Dentro do quadro de micoses sistêmicas está inclusa a paracoccidioidomicose (PCM), que apresenta grande relevância epidemiológica na América Latina, ocorrendo em toda sua extensão com prevalência endêmica variável entre países e regiões (PANIAGO et al., 2003). A PCM tem como agente etiológico o Paracoccidioides brasiliensis, fungo sobre o qual pouco se conhece em se tratando de seu habitat natural e da área em que está presente no meio ambiente (MARQUES, 2003; PANIAGO et al., 2003). Na América Latina, acreditase que cerca de metade da população que vive em zonas endêmicas tenha sido exposta ao P. brasiliensis, sendo que somente uma porção pequena de indivíduos desenvolveu alguma manifestação clínica desta doença, o que não a descaracteriza como uma micose sistêmica de grande importância na saúde pública de países como Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina. Sabe-se que o P. brasiliensis, está presente em sua forma miceliana/filamentosa em ambientes com temperatura atingindo cerca dos 26ºC (SHIKANAI- YASUDA et al., 2006), e em forma de levedura quando em ambiente com temperatura aproximada de 36ºC. A relação temperatura/morfologia está associada as condições parasitárias do fungo, que apresenta patogenicidade quando em estado de levedura (MARQUES et al., 2007) no hospedeiro humano. Devido à contaminação ocorrer na maioria das vezes pelas vias aéreas superiores, os pulmões são freqüentemente infectados (MUNIZ et al., 2002). Porém, o fungo não se limita às áreas primárias de infecção, podendo também causar lesões em tecido conjuntivo e outras vísceras. Um diagnóstico ágil e eficaz seria de extrema importância para este tipo micose, tendo em vista que o tratamento adequado deve ser empregado, evitando equívocos na farmacoterapia (QUAGLIATO Jr. et al., 2007). Um dos meios diagnósticos em ascensão na atualidade é a prática em biologia molecular. Apesar do alto custo atual, essa linha de análise diagnóstica promete grandes avanços em se tratando de rapidez e especificidade, podendo se tornar assim cada vez mais freqüente na área médica (MELLO; FONSECA-COSTA, 2005). Em busca de desvendar meios diagnósticos e terapêuticos por intermédio da biologia molecular, tem-se como ponto inicial a determinção dos perfis genômicos de organismos parasitários patogênicos. O Broad Institute em aliança com o Dimorphic Fungal Genomes Consortium (Consorcio Genômico de Fungos Dimórficos) está desenvolvendo um 1
projeto de comparação de genomas entre os fungos patogênicos que apresentam dimorfismo (PUCCIA et al., 2008). O genoma completo do P. brasiliensis estará totalmente disponível em um futuro próximo. O P. brasiliensis possui características polimórficas entre seus isolados. Morais et al. (2000), demonstraram por meio de análise em Southern blot com digestão total de DNA e por sequênciamento do gene GP43 diversos pontos polimórficos entre 17 isolados do fungo que culminavam com alterações na proteína final. Através da otimização das técnicas de separação dos cromossomos por tamanho de moléculas de DNA de P. brasiliensis de isolados clínicos, utilizando eletroforese, evidenciou-se o polimorfismo de bandas cromossômicas, tanto em número como em tamanho, caracterizando assim o polimorfismo cromossômico (MONTOYA et al., 1997; CANO et al., 1998; FEITOSA et al., 2003; PUCCIA et al., 2008). Uma vez comprovada a vasta variabilidade genética entre os isolados do P. brasiliensis, supõese que a existência de polimorfismo entre eles esteja diretamente relacionada com sua patogenicidade. Levine et al. (2004), em revisão bibliográfica, descrevem o processo de autofagia em fungos e os genes relacionados em cada fase deste processo (Tabela 1). Este presente trabalho tem como objetivo a avaliação de polimorfismo em genes relacionados ao processo de autofagia em diferentes isolados de P. brasiliensis (Pb01, Pb03 e Pb18). Para tanto, foram selecionados genes envolvidos na primeira fase da autofagia, referente à regulação da indução deste processo, que corresponde a um grupo de sete genes que interagem entre si sob resposta a privação de nutrientes. Tabela 1. Autofagia, suas etapas e genes relacionados a cada uma delas. Metodologia Acessando o banco de dados National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov), foram obtidas seqüências de DNA dos genes envolvidos no processo de indução da autofagia a partir de microorganismos como Saccharomyces cerevisiae e Aspergillus sp. Tais sequências possibilitaram obtenção das sequências similares em P. brasiliensis, através do banco de dados do Broad Institute (www.broad.mit.edu) utilizando a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que correlaciona diretamente proteína/proteína (blastp), nucleotídeo/nucleotídeo (blastn) e proteína/nucleotídeo (blastx). O alinhamento entre sequências dos isolados de P. brasiliensis para cada gene foi realizado com a utilização do software BioEdit, o qual permite alinhamento de duas ou mais seqüências, dispondo-as de forma a facilitar a visualização da presença de polimorfismo e grau de similridade entre elas em relação a sequência consenso. Resultados Em análise das seqüências genéticas pudemos observar variação no número nucleotídeos entre os isolados (Figura 1). Nucleotídeos 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Etapa Regulação da indução da autofagia Englobamento do material citosólico Nucleação vesicular Expansão vesicular Recuperação do material citosólico Acoplagem e fusão Rompimento da vesícula Gene APG1, APG11, APG13, APG17, APG20, APG24, VAC8 APG8, APG11, APG19 APG9, APG14, APG15, APG16, VPS34 APG3, APG4, APG5, APG7, APG8, APG10, APG12, APG16 APG2, APG9, APG18 CCZ1, MON1 APG15 0 APG1 APG11 APG13 APG17 APG20 APG24 VAC8 Pb18 Pb01 Pb03 Figura 1- Variação no número de nucleotídeos por isolado em cada gene relacionado. Com o alinhamento de cada gene, visualizamos extensa presença de polimorfismo com relação á seqüência consenso. O gene APG1 possui um total de 72 pontos de polimorfismo, onde os isolados Pb18 e Pb03 apresentam 6 e 3 pontos polimórficos, respectivamente, enquanto o Pb01 possui 62 sítios de nucleotídeos distintos. Este isolado apresenta ainda um adicional de 120 nucleotídeos e uma deleção de 195 nucleotídeos em relação à seqüência consenso (Figura 2). 2
Figura 2- Regiões do gene APG1 mostrando algumas diferenças encontradas entre os isolados. A seqüência do isolado Pb01 apresenta um ponto de substituição no sítio 2511, sem conseqüente alteração do aminoácido correspondente. Visualizase também a deleção de 3 nucleotídeos, onde não há tradução de aminoácido, porém não se altera continuação da seqüência de aminoácidos neste isolado. (Gly glicina / Asn asparagina). O isolado Pb03 do gene APG11, apresentou deleção de 471 nucleotídeos. O polimorfismo observado neste gene equivale a 5 nucleotídeos no Pb18, 28 nucleotídeos no Pb03 e 79 nucleotídeos no Pb01. Este gene apresenta 11 sítios onde cada isolado apresenta um nucleotídeo distinto (Figura 3). Figura 4- Região do gene Apg20 mostrando que no sítio 1930 há um códon de finalização (TGA) nas seqüências do isolados Pb18 e Pb01. As substituições nos sítios 1930 e 1931 no isolado Pb03 descaracteriza o fim da seqüência. Tal alteração estende a seqüência do isolado Pb03 em 4335 nucleotídeos. Em se tratando do gene APG24, observou-se deleção de 132 nucleotídeos no isolado Pb18 e 71 nucleotídeos no Pb01. Além disso, nucleotídeos adicionais foram também observados nos isolados Pb18 (6) e Pb03 (2). Com maior número de sítios polimórficos neste gene (23) encontra-se o Pb01. Os isolados Pb18 e Pb03 apresentaram 3 e 1 pontos de polimorfismo, respectivamente. Existem neste gene 3 pontos de polimorfismo onde em cada isolado há um nucleotídeo distinto no mesmo sítio. No caso deste gene, tal polimorfismo ocorre quando há uma deleção ou ausência do nucleotídeo correspondente em um dos isolados, e nos outros dois isolados do fungo, há nucleotídeos diferentes no mesmo sítio correspondente (Figura 5). Figura 3- Regiões do gene APG11, mostrando os sítios 3923 e 3928 com presença de substituições nos três isolados do P. brasiliensis, observado no gene APG11. Após alinhamento, foram observados nucleotídeos adicionais nos isolados Pb18 (6) e Pb01 (66) do gene APG13. Verificou-se também deleção na seqüência do isolado Pb01 (3) e em diversos pontos da seqüência do Pb03 (504). O polimorfismo deste gene corresponde a 57 substituições no isolado Pb01, 4 nucleotídeos no Pb18 e 5 nucleotídeos no Pb03. O gene APG17 possui um total de 704 sítios de polimorfismo, onde somente 4 desses pontos equivalem ao isolado Pb18. Os demais nucleotídeos polimórficos correspondem ao isolado Pb01. O isolado Pb03, neste gene se apresenta íntegro em relação à seqüência consenso, ou seja, não há polimorfismo na seqüência genética do APG17 neste isolado quando comparada à seqüência consenso. Foi observado um número de 4344 nucleotídeos adicionais no isolado Pb03 na seqüência do APG20. Enquanto nos isolados Pb18 e Pb01 há um códon de finalização, no Pb03, com a alteração de dois nucleotídeos, a seqüência se estende (Figura 4). Figura 5- Região do gene APG24 Sítio 317 com uma deleção no isolado Pb18, uma citosina no isolado Pb01 e uma adenina no Pb03. No alinhamento do gene VAC8 verificou-se deleções de nucleotídeos nos isolados Pb18 (82) e Pb01 (48). Em contrapartida, visualizou-se 1 nucleotídeo adicional no isolado Pb18. Os sítios de nucleotídeos polimórficos vistos neste gene correspondem a 16 nucleotídeos no Pb18, 2 nucleotídeos no Pb03 e 28 nucleotídeos no isolado Pb01. Para uma melhor análise dos resultados, descrevemos os índices de polimorfismo observados após alinhamento em relação à seqüência consenso na Tabela 2. 3
Tabela 2. Número de pontos polimórficos identificado em cada isolado, nos genes correspondentes. *Número de nucleotídeos polimórficos em cada isolado em relação à seqüência genética de cada gene. **No gene correspondente, presença de polimorfismo onde em cada isolado apresenta um nucleotídeo distinto no mesmo sítio da seqüência genética. ***Soma do número de nucleotídeos polimórficos em toda a seqüência de cada isolados do fungo em seu respectivo gene. Pb18* Pb01* Pb03* 18/01/03** Total*** APG1 06 62 03 01 72 APG11 05 79 28 11 123 APG13 04 57 05 21 87 APG17 04 700 - - 704 APG20 05 26 59 01 91 APG24 03 23 01 03 30 VAC8 16 28 02-46 Com tais dados podemos inferir a similaridade entre os isolados descritos (Tabela 3). O grau de identidade/similaridade aqui abordado é definido quando se têm como idêntico o valor absoluto 1,0000000, onde valores menores correspondem a variações nas seqüências genéticas relacionadas. Tabela 3. Similaridade entre os isolados do P. brasiliensis. Identidade/Similaridade (%) Pb18/Pb03 Pb18/Pb01 Pb01/Pb03 APG1 0,9955280 0,8675256 0,8678560 APG11 0,8763797 0,9769438 0,8584744 APG13 0,8248817 0,9480820 0,7899271 APG17 0,9982847 0,9623288 0,9606164 APG20 0,2964736 0,9833593 0,2931227 APG24 0,9077323 0,8462038 0,9348534 VAC8 0,9427762 0,9008499 0,9557823 100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Similaridade entre os isolados APG1 APG11 APG13 APG17 APG20 APG24 VAC8 Pb18/Pb03 Pb18/Pb01 Pb01/Pb03 Figura 6- Grau de similaridade entre os isolados para cada gene. O calculo da identidade é realizado a partir de duas sequências, gerando três resultados de similaridade do cada gene estudado. Discussão Identificamos que os isolados do P. brasiliensis possuem extensa variabilidade genética entre si. Em toda a extensão dos genes foram observados pontos de substituições, deleções e adições de nucleotídeos. As deleções e adições de nucleotídeos podem interferir ou não no processo de tradução de aminoácidos, mas principalmente, alteram o tamanho das seqüências genéticas. Em seis dos sete genes analisados (APG1, APG11, APG13, APG17, APG24 e VAC8) a incidência mais relevante de substituições acontece no isolado Pb01. A não ser pelo gene APG20, onde observamos um índice de identidade/similaridade bastante variado quando se tratando da análise entre os outros dois isolados com o Pb03. A similaridade é variável entre os genes, entretanto, a variação é pequena entre os isolados. Apesar de demonstrar certa distinção, a similaridade entre eles é de alto teor. Entretanto, observamos após alinhamento do gene APG20 uma variação de similaridade bem expressiva, enquanto os isolados Pb18 e Pb01 demonstram similaridade em 98,34%, a identidade entre Pb18 e Pb03 e entre Pb01 e Pb03 não atinge os 30%. A identidade representa uma visão ampla sobre a existência de polimorfismo, porém tais dados não reportam os reais e possíveis impactos causados por substituições, adições e deleções de nucleotídeos. A deleção de códons, por exemplo, pode tanto ser silenciosa como causar alterações na formação da proteína final. A adição de nucleotídeos, ou de uma extensa seqüência de nucleotídeos, ocasionada por alterações como a substituição de um códon de finalização, pode acarretar a descaracterização do gene e provavelmente em alteração da função da proteína correspondente. Matute et al. (2006) descrevem três grupos distintos de isolados do fungo P. brasiliensis: S1, PS2 e PS3. O Pb18 é extensamente estudado e representa o grupo S1, o isolado Pb03 é o isolado mais estudado do grupo PS2, entretanto o Pb01 não está contido em nenhum dos três grupos filogenéticos descritos. Acredita-se que a presença de polimorfismo esteja relacionada à virulência do P. brasiliensis (BORBA et al., 2008). O isolado Pb03 possui uma baixa capacidade de virulência quando comparado com o isolado Pb18 (CARVALHO et al., 2005). No presente estudo, observamos que os isolados Pb03 e Pb18 apresentam números pequenos de nucleotídeos polimórficos quando comparados com o Pb01. 4
Conclusão Concluímos, portanto, que o isolado Pb01 possui mais números de pontos polimórficos, quando comparado com os isolados Pb18 e Pb03, confirmando assim sua distinção. Os pontos de polimorfismo entre os demais isolados são igualmente relevantes, podendo estar relacionados a virulência e patogenicidade de cada um. Tais dados mostram que existe ainda um abrangente campo de análises, onde a determinação dos possíveis impactos causados pelo polimorfismo nas proteínas expressas por esses genes pode apresentar grande relevância clínica. Referências - BORBA, C.M. et al. Genetic characterization of morphologically variant strains of Paracoccidioides brasiliensis. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. V.103, n.3, p.306-309, 2008. - Broad Institute. Disponível em: www.broad.mit.edu. Acesso em: 20 ago. 2009. - CARRERO, L.L. et al. New Paracoccidioides brasiliensis isolate reveals unexpected genomic variability in this human pathogen. Fungal Genet. Biol. V.45, n.5, p.605-612, 2008. - CARVALHO, K.C. et al. Virulence of Paracoccidioides brasiliensis and gp43 expression in isolates bearing known PbGP43 genotype. Microbes and Infection. V.7, n.1, p. 55-65, 2005. - CANO, M.I.N. et al. Electrophretic karyotypes and genome sizing of the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. J. Clin. Microbiol. V.36, n.3, p.742-747, 1998. - FEITOSA, L.S. et al. Chromosomal polymorphism, syntenic relationships, and ploidy in the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Fungal Genet. Biol. V.39, n.1, p.60-69, 2003. - LEVINE, B; KLIONSKY, D.J. Development by selfdigestion: Molecular mechanisms and biological functions of autofphagy. Develop. Cell. V.6, n.4, p.463-477, 2004 - MELLO, F.C.Q.; FONSECA-COSTA, J. The utility of molecular biology in the diagnosis of tuberculosis. J. Bras. Pneumol. V.31, n.3, p. 188-190, 2005. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=s1806-37132005000300002&script=sci_arttext&tlng=en. Acesso em: 02 set. 2009. - MONTOYA, A.E. et al. Electrophoretic karyotype of clinical isolates of Paracoccidioides brasiliensis. Fungal Genet. Biol. V.21, n.2, p.223-227, 1997. - MORAIS, F.V. et al. Polymorphism in the gene coding for the immunodominant antigen gp43 from the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. J. Clin. Microbiol. V.38, n.11, p.3960-3966, 2000. - MUNIZ, M.A.S. et al. Paracoccidioidomicose pulmonar aspectos na tomografia computadorizada de alta resolução. Radiol. Bras. V.35, n.3, p.147-154, 2002. - Nactional Center for Biotechnology Information. Disponível em: www.ncbi.nlm.nih.gov. Acesso em: 20 ago. 2009. - PANIAGO, A.M.M. et al. Paracoccidioidomicose: estudo clínico e epidemiológico de 422 casos observados no estado de Mato Grosso do Sul. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. V.36, n.4, p.455-459, 2003 - PUCCIA, R. et al. Diversity in Paracoccidioides brasiliensis. The PbGP43 gene as a genetic marker. Mycopathologia. V.165, n.4-5, p.275-287, 2008. - QUAGLIATO Jr., R. et al. Associação entre paracoccidioidomicose e tuberculose: realidade e erro diagnóstico. J. Bras. Pneumol. V.33, n.3, p.295-300, 2007. - SHIKANAI-YASUDA, M.A. et al. Consenso em paracoccidioidomicose. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. V.39, n.3, p.297-310, 2006. - TAVARES, A.H. et al. Virulence insights from the Paracoccidioides brasiliensis transcriptome. Genet. Mol. Res. V.4, n.2, p.372-389, 2005. - MARQUES, S.A. Paracoccidioidomicose: Atualização epidemiológica, clínica e terapêutica. An. Bras. Dermatol. V.78, n.2, p.135-150, 2003. - MARQUES, S.A. et al. Paracoccidioidomicose: freqüência, morfologia e patogênese de lesões tegumentares. An. Bras. Dermatol. V.82, n.4, p.411-417, 2007. 5