Biorreatores e Processos Fermentativos

Biorreatores e Processos Fermentativos Aula 6 Prof a. Dr a Ilana L. B. C. Camargo Ciências Físicas e Biomoleculares IFSC - USP PARTE II 1

Classificação dos biorreatores Quanto ao tipo de biocatalisador; Quanto à configuração do biocatalisador (células/enzimas livres ou imobilizadas); Quanto à forma de se agitar o líquido no reator. Biocatalisadores: Enzimas ou células vivas (microbianas, animais ou vegetais) Classificação dos Biorreatores quanto ao tipo de biocatalisador: Grupo dos Reatores Bioquímicos Biorreatores nos quais as reações ocorrem na ausência de células vivas, ou seja, são tipicamente os reatores enzimáticos ; Grupo dos Reatores Biológicos Biorreatores nos quais as reações se processam na presença de células vivas ; 2

Classificação mista dos biorreatores segundo Kleinstreuer: Baseada no tipo do biocatalisador empregado (enzima, microrganismo aeróbio ou anaeróbio) e na configuração deste (livre, imobilizado ou confinado entre membranas) Grande variedade!!! I) Reatores em fase aquosa (fermentação submersa) (I.1) Células/enzimas livres Reatores agitados mecanicamente (STR: Stirred tank reactor ) Reatores agitados pneumaticamente - Torre - Coluna de bolhas - Reatores air-lift Reatores de fluxo pistonado ( plug-flow ) (I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo Reatores com leito fluidizado (I.3) Células/enzimas confinadas entre membranas Reatores com membranas planas Reatores de fibra oca ( hollow-fiber ) 3

II) Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sólida) Reatores estáticos (reatores com bandejas) Reatores com agitação (tambor rotativo) Reatores com leito fixo Reatores com leito fluidizado gás-sólido I. Reatores em fase aquosa (fermentação submersa) (I.1) Células/enzimas livres Mais amplamente utilizados: reatores agitados mecanicamente (STR, stirred tank reactor), conhecidos também como reatores de mistura, constituindo cerca de 90% do total de reatores utilizados industrialmente. 4

Reatores agitados mecanicamente (STR) Agitação mecânica favorece a homogeneização, suspensão de sólidos, dispersão gás-líquido, aeração e a transferência de calor e massa Quebra espuma Agitadores Chicanas / Baffles Sistema de aeração Reatores agitados mecanicamente (STR) Agitadores ou impelidores: geralmente são colocados em volta de um eixo central rotatório e distribuídos ao centro e fundo do tanque. O tipo, tamanho e número de agitadores, bem como a localização influenciam diretamente na mistura e transferência de massa no reator. A velocidade de rotação (rpm) dos agitadores é definida pelo usuário. Principais agitadores: 5

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Reatores agitados pneumaticamente Pense nos aquários!! Ar Ar Microrganismos para decomposição Reatores agitados pneumaticamente a)biorreatores em torre b)biorreatores coluna de ar/bolhas c)biorreatores air-lift (Loop reactor) Tubo difusor A B C Reator tipo Torre Reatores tipo Loop reactor Relação altura/diâmetro de 3:1 Pode ter até 20 m de altura! 7

Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores coluna de ar/bolhas Ponto de vista construtivo mais simples Cilindro com fundo e tampas abauladas Serpentinas de resfriamento internas ou externas Entrada de ar pelo fundo Produção de ácido cítrico até antibióticos Relação altura/diâmetro de 4:1 a 5:1 Pode chegar até 23 m de altura Quando há serpentinas internas, passam a funcionar mais como air-lift e não como bubble column fermenter Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores com borbulhamento / coluna de ar Miniatura Betts and Baganz Microbial Cell Factories 2006 5:21 http://www.microbialcellfactories.com/content/figures/1475-2859-5-21-3-l.jpg http://ct-cr4.chem.uva.nl/bc/lit_radi.html 8

Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores com borbulhamento / coluna de ar Ausência de agitação mecânica Menores tensões de cisalhamento Aplicação: células animais e vegetais Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores air-lift - promove movimentação cíclica do fluido usando um cilindro central em cuja base é inserido o ar A presença do tubo difusor permite: Aumentar a mistura axial no reator; Reduzir a coalescência das bolhas que circulam numa mesma direção (igual a do líquido); Equalizar as forças de cisalhamento (é distribuída uniformemente pelo reator). 9

Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores air-lift Regiões do Tubo Difusor Riser / fluxo ascendente: região onde as bolhas de gás são liberadas. Pode ser dentro ou fora do tubo central. Zona de alívio A ascensão das bolhas causa o fluxo de líquido na direção vertical. Para contrabalançar, o líquido flui em direção descendente no downcomer / fluxo descendente. Isto permite a circulação do líquido e aumenta a eficiência de mistura quando comparado a coluna de bolhas. Reatores agitados pneumaticamente Zona de alívio Biorreatores air-lift Zona de Alívio: Adiciona volume ao reator; Reduz a espuma; Minimiza a circulação de bolhas pelo downcomer devido ao súbito alargamento do topo do reator que diminui a velocidade da bolha e a libera do fluxo do líquido. Assim previne-se a entrada de bolhas ricas em CO 2 no downcomer; Redução da perda de meio devido a formação de aerossol Os reatores airlift são utilizados com fluidos menos viscosos e quando há necessidade de agitação mais suave e transferência de oxigênio a baixo custo. 10

Reatores agitados pneumaticamente Biorreatores air-lift Características: Extrema simplicidade Baixo investimento Maior facilidade para ampliação da escala Menor consumo de energia Adaptação mais fácil ao cultivo de células sensíveis ao cisalhamento Relação de altura diâmetro varia de 5:1 até 10:1 Relação do diâmetro do tubo central e diâmetro do reator é de 0,6 0,8, o que maximiza a circulação do meio e, portanto, obtém menor tempo de mistura Desvantagens dos Biorreatores tanque agitado mecanicamente em relação aos air-lift : -Maior consumo de energia -Maior nível de espuma -Nem sempre é compatível com alguns tipos de células (animais e vegetais) 11

Reatores de fluxo pistonado ( plug-flow ) Meio e inóculo são misturados a partir da base do reator e a cultura flui, idealmente, em velocidade constante, sem ocorrer mistura longitudinal. Meio Inóculo O fluxo é contínuo e o tempo dentro do reator é curto, por isso é utilizado para reações rápidas. http://www.pilot-plant.com/images/plug-flow-reactor.jpg (I.2) Células imobilizadas em suportes Principal característica: Estrutura física de confinamento que obriga as células a permanecerem em uma região particular de um biorreator Sem necessidade de células vivas Enzima/Sistema ezimático envolvido na conversão bioquímica ativo (1 ou algumas, sem coenzimas e vias anabólicas presentes na replicação celular) Com necessidade de células vivas Produtos a serem formados requerem múltiplos passos de transformações, regeneração de coenzimas, presença de cadeia respiratória, vias metabólicas geradoras de intermediários e outros inerentes às células vivas Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 12

(I.2) Células imobilizadas em suportes Vantagens do uso da célula imobilizada: Possibilidade de utilização de altas concentrações celulares no volume reacional, implicando em maiores velocidades de processamento; Operação de sistemas contínuos com velocidade de alimentação acima da velocidade específica máxima de crescimento da célula (não imobilizada); Eliminação de problemas com reciclo externo de células (sedimentadores, filtros, centrífugas); Provável obtenção de maiores fatores de conversão de substrato ao produto desejado; Possibilidade de utilização de projetos de biorreatores mais adequados à cinética do sistema biológico utilizado; Maior proteção ao sistema biológico em relação ao estresse ambiental, ocasionado por elevadas concentrações de substratos, ph e cisalhamento. Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 (I.2) Células imobilizadas em suportes A imobilização é conseguida através do contato do material utilizado para a imobilização com as células vivas que se pretende imobilizar, sob condições ambientais controladas. O material utilizado para a imobilização é denominado Suporte. Características de um suporte: a) Não ser tóxico para as células; b) Ter alta capacidade de retenção; c) Ser resistente ao ataque químico e microbiano; d) Ter pouca sensibilidade às possíveis solicitações mecânicas (compressão por peso, tensões de cisalhamento ou pressões internas ou externas de gases); e) Alta difusividade de substratos e de produtos. 13

(I.2) Células imobilizadas em suportes Polímeros naturais Polímeros sintéticos Materiais inorgânicos Alginato Poliacrilamida Alumina K-Carragena Cloreto de polivinila Sílica Àgar Poliestireno Zircônia Pectina Poliuretano Vidro Dextrana Polietileno glicol Diatomita Colágeno Vermiculita Celulose Métodos de imobilização em partículas: Adsorção, Ligação covalente e Envolvimento (I.2) Células imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado Métodos de imobilização em partículas 1. Adsorção (interações eletrostáticas, ligações iônicas e ligações covalentes parciais) Limitação: Influência do meio na capacidade de retenção das células ao suporte (concentração iônica, ph, e idade da população celular) Nome comercial Suportes comerciais utilizados no método de adsorção Material Diâmetro (mm ) Densidade (g/ml) Célula Cytodex dextrana 0,20 1,04 Mamífero Cytopore Celulose 0,23 1,03 Mamífero e microrganismo Cytoline Polietileno e sílica 2,0 a 2,5 1,03 a 1,3 Mamífero e microrganismo Siran Vidro poroso 1,0 a 2,0 1,6 microrganismo 14

(I.2) Células imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado Métodos de imobilização 2. Ligação covalente (suporte com grupamento químico responsável pela imobilização da célula ao suporte) silanização de esferas de vidro (100 a 500µm) seguida de reação com glutaraldeído. (100 a 500 micra) O Suporte -O-S i -C-C-C-NH 2 O Tratamento com -aminopropil-trietoxisilano (APTS) O Suporte -O-S i -C-C-C-N-C-C-C-C-C O H O Tratamento do aminoalquil-suporte com glutaraldeído O Interação da carbonila do suporte com aminas da parede celular H Limitação: Potencial toxicidade do sistema devido ao Glutaraldeído Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 (I.2) Células imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado Métodos de imobilização 3. Envolvimento - Imobilização de células vivas Mais usado!! Confinamento de uma população celular em uma matriz polimérica formadora de um gel hidrofílico. Os poros da matriz formada são menores que as células contidas em seu interior. Meio Substrato Produto Materiais mais utilizados para partículas de gel são os polímeros naturais: Agar K-carragena Alginato Pectina Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 15

Imobilização de células por envolvimento em gel hidrofílico induzida por Ca 2+ e K + Solução do polímero em água 1 a 4% Polissacarídeo + Células Partículas contendo células imobilizadas Solução de KCl ou CaCl 2 0,05 a 0,5M Partículas com diâmetro de 0,5 ou 5 mm e densidade populacional de até cerca de 250 mg de biomassa seca g -1 de matriz Agitador magnético (I.2) Células imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado Métodos de imobilização 3. Envolvimento - Vantagens: a) Facilidade b) Baixíssima toxicidade c) Alta capacidade de retenção celular 16

(I.2) Células imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizado Métodos de imobilização 3. Envolvimento Desvantagem: Limitação imposta pela difusão intraparticular de substratos e produtos metabólicos Para minimizar os efeitos, deve-se otimizar: O tamanho da partícula; A difusividade das espécies através da matriz polimérica Concentração celular na partícula (I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo ou fluidizados O confinamento celular permite a utilização de biorreatores de configurações bastante diferenciadas. A maior parte dos biorreatores estudados para sistemas de células imobilizadas consistem-se de colunas operadas continuamente, contendo leito fixo ou fluidizado das partículas com as células imobilizadas. 17

(I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo Células ou enzimas são imobilizadas em grandes partículas sólidas ou gelatinosas formando pacotes. O meio é adicionado ou bombeado através da coluna preenchida com partículas onde estão aderidas ou aprisionadas as células que vão converter o substrato em produto. Suportes sólidos: células se aderem na superfície Partículas de gel: células aprisionam-se na rede de polímero (melhor retenção e maior área efetiva superficial para imobilização) Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 (I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo Biocatalisador é imobilizado em um suporte inerte (alginato, K-carragena, pectina, cerâmica, vidro, sílica etc). Finalidade: manutenção de elevadas concentrações celulares, podendo-se atingir, consequentemente, elevadas produtividades no processo em questão Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 18

(I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo Aplicações: -Tratamento de resíduos (suportes sólidos filtros biológicos) -Produção de enzimas (suportes gelatinosos) -Biotransformação de esteróides - Produção tradicional de vinagre! Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 (I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo: produção de vinagre Mistura de solução de álcool acidificado com ácido acético e nutrientes para o crescimento de bactérias produtoras do ácido acético e inóculo de espécies de Acetobacter. 25-30 0 C. É necessário sistema de controle de temperatura e o vinagre é produzido em 10 dias por este método. Bacilo G- Aeróbio Grades de madeira Raspas de madeira 19

(I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo Vantagens: -Fácil recuperação do produto Desvantagens: -Deficiência na transferência de O 2 e nutrientes; -Entupimento (crescimento das células) e alterações de fluxo (caminhos preferenciais); -Homogeneização prejudicada; -Com o tempo há perda por lavagem de células aderidas ou aprisionadas Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 20

(I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fixo Departamento de Hidráulica e Saneamento - SHS, da Escola de Engenharia de São Carlos - EESC/USP Desenvolvimento de Reator Horizontal de Leito Fixo para Tratamento de Esgotos Sanitários. Reator anaeróbio de leito fixo Biomassa imobilizada em Espuma de poliuretano http://www.finep.gov.br/prosab/1_esgoto_usp.htm (I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fluidizado Adsorção ou envolvimento Podem ser definidos como grandes tubos ocos (colunas verticais) dentro dos quais partículas contendo células ou enzimas imobilizadas são carregadas (até cerca de 70% do volume útil) fluidizadas ou expandidas através de um dos mecanismos: 1) Gás inerte (N2 ou CO2) ou ar atmosférico inserido na base da coluna; 2) Reciclo parcial do efluente da coluna; 3) Movimentação interna do fluido promovida por agitação mecânica Eventualmente: próprio gás carbônico formado durante o processo 21

(I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fluidizado Movimentação interna do fluido promovida por agitação mecânica. (I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fluidizado Conforme o gás passa pelo distribuidor, o meio contendo as partículas sólidas se agita fazendo com que tenhamos um fluxo (Leito empacotado). Se esse fluxo alcança uma certa velocidade as partículas sólidas se dispersam no líquido e se tem o leito fluidizado. Muito usado na indústria petroquímica. http://www.nationmaster.com/encyclopedia/fluidized-bed-reactor 22

(I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fluidizado Vantagens: - Alta taxa de transferência e homogeneização; -Baixo atrito; -Fácil recuperação do produto (não precisa separar as células) -Não há problemas de entupimento como leito fixo -Boa produtividade volumétrica (maior que leito fixo e tanques agitados) Schmidell W. et al, 2001. V.2 cap. 16 (I.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes Reatores com leito fluidizado Biofilme no carvão O reator foi construído em aço carbono zincado a quente, com diâmetro da base de 1,50 m e 15,0 m de altura, tendo como material do leito, partículas de carvão ativado granulado. Foi utilizado, para receber e tratar cerca de 40% da vazão dos esgotos gerados no Campus I da USP, de São Carlos - SP. As fotos apresentam este reator e uma partícula (recheio) de carvão ativado, mostrando o seu aspecto na fase de aderência de microrganismos para a formação do biofilme. 23

(I.3) Células/enzimas confinadas entre membranas - Reatores com membranas planas - Reatores de fibra oca ( hollow-fiber ) Bioreactor de membrana combina tratamento biológico com um processo de separação utilizando membranas de microfiltração. É constituído por um tanque reator e uma unidade de microfiltração. No reator, os microrganismos (principalmente bactérias) transformam matéria poluída dissolvido em biomassa, e do nitrogênio amoniacal ("amoníaco") em nitrato. Assim poluentes orgânicos biodegradáveis são eliminados pelo biorreator (gorduras, ácidos orgânicos, resíduos vegetais, etc), bem como um certo número de metais que são oxidados em compostos insolúveis em grande parte. Os sólidos em suspensão são então eliminados por meio da membrana de microfiltração. 24

(I.3) Células/enzimas confinadas entre membranas - Reatores de fibra oca ( hollow-fiber ) http://www.fibercellsystems.com/about.htm (I.3) Células/enzimas confinadas entre membranas - Reatores de fibra oca ( hollow-fiber ) http://www.fibercellsystems.com/advantage.htm 25

II) Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sólida) Definição de fermentação semi-sólida: Processo que se refere a cultura de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida (substrato ou material inerte), onde o conteúdo de líquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela está a um nível de atividade de água que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das células e, por outro, não exceda a máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida Materiais insolúveis em água sobre os quais microrganismos crescerão: -Suporte sólido que atua como fonte de nutrientes; -Matriz sólida, inerte ou não, que absorve o meio de cultura líquido que traz os nutrientes. Em geral, na literatura, o suporte sólido atua como fonte de nutrientes II) fermentação semi-sólida Substrato forma natural: bagaço da cana, sabugo de milho produtos ou resíduos agroindustriais baixo ou nenhum valor comercial - forma sintética: argila Pode-se incorporar solução nutriente ao substrato sólido, visando adequá-lo melhor às condições nutricionais do microrganismo para a fermentação desejada Ex. Produção de -galactosidase por Aspergilus niger em composto de farelo de trigo. São adicionados: uréia (fonte de nitrogênio), água de maceração de milho (fonte de fatores de crescimento), farinha de soja (indutores da enzima) e ácido cítrico (favorece a produção da enzima) 26

II) fermentação semi-sólida Característica do substrato para maior rendimento: - Alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o meio Porosidade Tamanho Formato das partículas Porosidade: absorção de água, facilita transporte de enzimas e metabólitos por entre o meio e os microrganismos Tamanho das partículas velocidade de fermentação Granulometria própria para permitir circulação do ar, dissipação de gases e calor II) fermentação semi-sólida Exemplos de matéria prima para fermentação em estado sólido e produtos finais: Farelo e palha de trigo, farinha e farelo de soja, palha de arroz, bagaço da cana Produção de enzimas Bagaço da maçã, de uva, melaço de cana-de-açúcar produção de álcool Bagaço de cana, Água de maceração de milho, farelo de milho produção de antibióticos Soja miso, shouyo 27

II) fermentação semi-sólida Microrganismos: Fungos filamentosos (baixos níveis de água no sistema) Rhizopus renina microbiana Trichoderma Penicillium penicilina Aspergillus Bactéria: Bacillus thurigiensis produção de bioinseticida amilase II) Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sólida) Reatores estáticos Reatores com agitação Reatores com leito fixo Reatores de vidros Reatores de bandejas (madeira, bambu, alumínio) Esteira rolante Tubular horizontal (tambor rotativo) Reatores com leito fluidizado gás-sólido Ausência de água livre teor de umidade 30 a 80% que depende das características de retenção de água do substrato sólido empregado 28

II) Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sólida) Cultivo dos microrganismos em suportes sólidos sob baixo teor de umidade (frascos, colunas, tanques, bandejas ou tambores rotatórios) Suportes podem ser resíduos agrícolas (palha, fibra de cascas de arroz, trigo, milho, mandioca), alimentos (grãos e farinhas) ou ainda suportes inertes (argilas). Fermentação ocorre em níveis de umidade semelhantes aos encontrados no ambiente natural dos microrganismos Muito usado para processos que envolvem microrganismos filamentosos como a produção de enzimas por fungos filamentosos Exemplos II) fermentação semi-sólida Queijo Roquefort É produzido com leite de ovelha não-pasteurizado ao qual é adicionado o fungo Penicillium roqueforti. A umidade e a quantidade de ar no local de maturação, necessárias para que o fungo se desenvolva no queijo, são rigorosamente controladas. Originário da região de Rouergue, França, tem forma cilíndrica e pesa de 2 kg a 3 kg. A casca é pegajosa de cor marfim bem clara e a textura é macia, com um aroma característico e sabor que pode ser mais ou menos picante de acordo com o grau de maturação. 10 o C 90% umidade várias semanas http://www.frenchentree.com/tarn-aveyron-food-drink/displayarticle.asp?id=16885 http://www.queijosnobrasil.com.br/queijo_roquefort.htm 29

II) fermentação semi-sólida Celulase Foi observada a atividade celulolítica de extratos enzimáticos obtidos a partir de Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicillium citrinum, Penicillium chrysogenum, e Fusarium oxysporum, tendo como substrato palha de trigo, bagaço de cana seco ao sol, casca de arroz e fibra de coco. Foram utilizadas, como condições de processo, um ph inicial de 5,8 a um teor de umidade de 80% e temperatura de 25 0 C a 30 0 C, durante um período de 7 14 dias. Observou-se que a produção em meio sólido foi três vezes superior à submersa. II) fermentação semi-sólida Sequência típica de processo de produção de enzimas pelo método de cultura sólida Meio de cultura à base de farelo de trigo umedecido, esterilizado com vapor Resfriamento e inoculação com esporos de Aspergillus Mistura e colocação em bandejas ou tambores rotativos Incubação a 20 45 0 C de 1 a 7 dias Extração de enzima com água ou solução tampão secagem e moagem da cultura Extrato enzimático Farelo enzimático 30

II) Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sólida) Vantagens da Fermentação semi-sólida em relação à fermentação submersa: -Menor custo de capital e operacional; -Menor risco de contaminação (baixa umidade); -Maior facilidade de remoção do produto final; -Utilização de fontes de carbono não convencionais insolúveis; -Ausência de atrito; -Permite o desenvolvimento de estruturas diferenciadas; importante para formação de alguns produtos (fungos). Desvantagens: -Dificuldade de parâmetros físicos durante o cultivo (gradientes) -Natureza heterogênea do meio devido a dificuldades na homogeneização Bibliografia Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 8-13, 16, 20 31